0064] 小鼠HIF-la可以是核酸序列SEQIDN0:1，其編碼SEQIDN0:2(圖7A和圖7B)。 SEQIDN0:2是小鼠HIF-1a的氨基酸序列，其中兩個脯氨酸殘基已被丙氨酸被替代。這種 替代可防止或減少HIF-la的羥化，從而防止或減少HIF-la被pVHL識別。SEQIDN0:2 是通過肽鍵連接于IgE前導(dǎo)序列的小鼠HIF-1a的氨基酸序列。
[0065] 在一些實施方案中，小鼠HIF-la可以是在SEQIDN0:1中所示的核酸序列的 完整長度上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸序列。在其它 實施方案中，小鼠HIF-la可以是編碼在SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的完整長度上 具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠 HIF-la可以是在SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0066] 在一些實施方案中，小鼠HIF-la可以是核酸序列SEQIDN0:3,其編碼SEQID 勵:4(圖8六和88)。5￡〇10勵:4是小鼠11正-1€ [的氨基酸序列，其中兩個脯氨酸殘基已 被丙氨酸替代，如圖8B中顯示的。該替代可防止或減少HIF-1a的羥化，從而防止或減少 ^1正-1<1被1^1識別。3￡010勵:4是未通過肽鍵連接于18￡前導(dǎo)序列的小鼠11正-1€ [的 氨基酸序列。
[0067] 在一些實施方案中，小鼠HIF-la可以是在SEQIDN0:3中所示的核酸序列的 完整長度上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸序列。在其它 實施方案中，小鼠HIF-la可以是編碼在SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上 具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠 HIF-la可以是在SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0068] 人HIF-1a可以是核酸序列SEQIDN0:5,其編碼SEQIDN0:6(圖9A和圖9B)。 SEQIDN0:6是人HIF-la的氨基酸序列，其中兩個脯氨酸已被丙氨酸替代，如圖9B中顯示 的。該替代可防止或減少HIF-la的羥化，從而防止或減少HIF-la被pVHL識別。
[0069] 在一些實施方案中，人HIF-la可以是在SEQIDN0:5中所示的核酸序列的完整 長度上具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的同一性的核酸序列。在其它實施方 案中，人HIF-la可以是編碼在SEQIDN0:6中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少 約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的氨基酸序列的核酸序列。人HIF-la可以 是在SEQIDN0:6中所示的氨基酸序列的完整長度上具有至少約80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99 %或100 %的同一性的氨基酸序列。
[0070] 一些實施方案涉及SEQIDN0:1、SEQIDN0:3和SEQIDN0:5的片段。片段可包 含SEQIDNO: 1、SEQIDN0:3 和 / 或SEQIDN0:5 的至少 60%、至少 65%、至少 70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至 少99%。在一些實施方案中，片段包含編碼前導(dǎo)序列例如免疫球蛋白的前導(dǎo)序列諸如IgE 前導(dǎo)序列的序列。在一些實施方案中，片段不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0071] 可提供具有與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:5的片段具有同一 性的核苷酸序列的核酸的片段。此類片段可包含與SEQIDNO: 1、SEQIDN0:3和/或SEQ IDNO: 5具有95 %或更高同一性的核酸的至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。一些 實施方案涉及與本文中的HIF-a核酸序列的片段具有96%或更高同一性的片段。一些實 施方案涉及與本文中的HIF-a核酸序列的片段具有97%或更高同一性的片段。一些實施 方案涉及與本文中的HIF-a核酸序列的片段具有98%或更高同一性的原性片段。一些實 施方案涉及與本文中的HIF-a核酸序列的片段具有99%或更高同一性的片段。在一些實 施方案中，片段可包含編碼前導(dǎo)序列，例如免疫球蛋白前導(dǎo)序列諸如IgE前導(dǎo)序列的序列。 在一些實施方案中，片段可不含編碼前導(dǎo)序列的編碼序列。
[0072]可提供SEQIDN0:2、SEQIDN0:4 和SEQIDN0:6 的片段。片段可包含SEQID N0:2、SEQIDN0:4 和 / 或SEQIDN0:6 的至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。在 一些實施方案中，片段包括前導(dǎo)序列，例如免疫球蛋白前導(dǎo)序列，諸如IgE前導(dǎo)序列。在其 它實施方案中，片段可不含前導(dǎo)序列。
[0073] 可提供具有與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的片段具有同一性 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的片段。此類片段可包含與SEQIDN0:2,SEQIDN0:4和/或SEQ IDNO: 6具有95 %或更大的同一性的蛋白質(zhì)的至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。 一些實施方案涉及與本文中的HIF-1a蛋白質(zhì)序列的片段具有96%或更大的同一性的片 段。一些實施方案涉及與本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有97%或更大的同一性的片 段。一些實施方案涉及與本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有98%或更大的同一性的片 段。一些實施方案涉及與本文中的HIF-1a蛋白序列的片段具有99%或更大的同一性的片 段。在一些實施方案中，片段包含前導(dǎo)序列，例如免疫球蛋白的前導(dǎo)序列，諸如IgE前導(dǎo)序 列。在其它實施方案中，片段可以不含前導(dǎo)序列。
[0074] b?載體
[0075] 所述治療劑可包含一種或多種包含編碼所述藥劑的異源核酸的載體。所述一種或 多種載體可以能夠表達(dá)藥劑。所述載體可包含編碼所述藥劑的異源核酸。所述載體可具有 含有復(fù)制起始點的核酸序列。所述載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染 色體。所述載體可以是自主復(fù)制的染色體外載體或整合進(jìn)宿主基因組的載體。
[0076] 所述一個或多個載體可以是表達(dá)構(gòu)建體，其通常是用于將特定基因引入靶細(xì)胞的 質(zhì)粒。一旦表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)，由所述基因編碼的蛋白質(zhì)由細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機器核糖體復(fù) 合物產(chǎn)生。所述質(zhì)粒通常被工程化以含有充當(dāng)增強子和啟動子區(qū)域調(diào)控序列并導(dǎo)致表達(dá)載 體上攜帶的基因的高效轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的載體表達(dá)大量穩(wěn)定的信使RNA，從而表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0077] 所述載體可具有表達(dá)信號諸如強啟動子、強終止密碼子、啟動子與克隆的基因之 間的距離的調(diào)整以及轉(zhuǎn)錄終止序列和PTIS(可攜帶的翻譯起始序列）的插入。
[0078] (1)表達(dá)載體
[0079] 所述載體可以是環(huán)狀質(zhì)?；蚓€性核酸。所述環(huán)狀質(zhì)粒和線性核酸能夠在適當(dāng)?shù)闹?題細(xì)胞中指導(dǎo)特定核苷酸序列的表達(dá)。所述載體可具有有效地連接于編碼藥劑的核苷酸序 列的啟動子，所述編碼抗原的核苷酸序列可有效地連接于終止信號。所述載體還可含有核 苷酸序列的正確翻譯所需的序列。包含目標(biāo)核苷酸序列的載體可以是嵌合的，這意味著其 組件的至少一個對于其至少一個其它組件是異源的。表達(dá)盒中的核苷酸序列的表達(dá)可在組 成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制之下，僅當(dāng)將宿主細(xì)胞暴露于一些特定的外部刺激物時 所述誘導(dǎo)型啟動子才啟動轉(zhuǎn)錄。在多細(xì)胞生物體的情況下，所述啟動子還可于對特定的組 織或器官或發(fā)育階段是特異性的。
[0080] (2)環(huán)狀和線性載體
[0081] 所述載體可以是環(huán)狀質(zhì)粒，其可通過整合進(jìn)細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞或存在于染色 體外（例如，具有復(fù)制起始點的自主復(fù)制質(zhì)粒）。
[0082] 所述載體可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能夠表達(dá)編碼抗原的DNA或佐劑并 使得細(xì)胞能夠?qū)⑺鲂蛄蟹g成被免疫系統(tǒng)或佐劑識別的抗原的任何其它表達(dá)載體。
[0083] 本文中還提供了能夠經(jīng)由電穿孔被有效地遞送至受試者，并且表達(dá)期望的藥劑的 線性核酸或線性表達(dá)盒（"LEC"）。所述LEC可以是不存在任何磷酸主鏈的任何線性DNA。 所述DNA可編碼藥劑。所述LEC可含有啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和/或多腺苷酸化信 號。所述藥劑的表達(dá)可受啟動子控制。所述LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸 主鏈。所述LEC可以不含與期望的藥劑基因表達(dá)無關(guān)的其它核酸序列。
[0084] 所述LEC可來源于任何能夠被線性化的質(zhì)粒。所述質(zhì)?？梢阅軌虮磉_(dá)藥劑。所述 質(zhì)?？梢允莗NP(PuertoRico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。所述質(zhì)?？梢允荳LV009、 pVAX、pcDNA3. 0或provax，或任何其它能夠表達(dá)編碼所述藥劑的DNA并使得細(xì)胞能夠?qū)⑺?述序列翻譯成藥劑的表達(dá)載體。
[0085] 所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分別來源于 pNP(PuertoRico/34)和pM2(NewCaledonia/99)〇
[0086] (3)啟動子、內(nèi)含子、終止密碼子和多腺苷酸化信號
[0087] 所述載體可具有啟動子。所述啟動子可以是能夠驅(qū)動基因表達(dá)和調(diào)控分離的核酸 表達(dá)的任何啟動子。此類啟動子是經(jīng)由DNA依賴性RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄所需的順式作用序列 元件，所述RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄本文中描述的藥劑序列。用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動子的選 擇取決于特定應(yīng)用?？蓪幼釉谳d體中置于離轉(zhuǎn)錄起始位點與其在天然背景中離轉(zhuǎn)錄起 始位點的距離大約相同的距離。然而，在不喪失啟動子功能的情況下，可接受該距離的變 化。
[0088] 所述啟動子可有效地連接于編碼所述藥劑和轉(zhuǎn)錄物的高效多腺苷酸化所需的信 號、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止的核酸序列。所述啟動子可以是CMV啟動子、SV40早期啟 動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、 多角體蛋白啟動子或顯示對于在真核細(xì)胞中的表達(dá)是有效的另一種啟動子。
[0089] 所述載體可包含增強子和具有功能性剪接供體和受體位點的內(nèi)含子。所述載體可 含有在結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供高效終止。所述終止區(qū)可獲自與啟動子序列相同 的基因或可獲自不同的基因。
[0090] c.賦形劑和治療劑的其它組分
[0091] 治療劑還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是功能性分 子諸如媒介物、載體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，其可包括表面活 性劑，諸如免疫刺激復(fù)合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐劑（Freundsincompleteadjuvant)， LPS類似物，包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物、囊泡諸如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、 脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒，或其它已知的轉(zhuǎn)染促進(jìn) 劑。
[0092] 轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是多聚陰離子、多聚陽離子，包括聚-L-谷氨酸鹽（LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染 促進(jìn)劑是聚-L-谷氨酸鹽，并且所述聚-L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的濃度存在于治療劑 中。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑還可包括表面活性劑諸如免疫刺激復(fù)合物（ISC0MS)、弗氏不完全佐劑，LPS 類似物，包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物和囊泡諸如角鯊烯和角鯊烯，并且還可將透 明質(zhì)酸與基因構(gòu)建體結(jié)合施用。所述DNA質(zhì)粒治療劑還可包括轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，諸如脂質(zhì)、脂質(zhì) 體，包括卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域中已知的其它脂質(zhì)體，作為DNA-脂質(zhì)體混合物（參見例如 W09324640)、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒，或其它已知的轉(zhuǎn)染促進(jìn) 劑。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是聚陰離子、聚陽離子，包括聚-L-谷氨酸鹽（LGS)或脂質(zhì)。治療劑中的轉(zhuǎn) 染劑的濃度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0. 750mg/ml、低于0. 500mg/ml、低 于 0. 250mg/ml、低于 0. 100mg