免疫原性裂解物的制備方法、獲得的裂解物、負(fù)載有該裂解物的樹(shù)突狀細(xì)胞以及含有該裂 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種從間皮瘤腫瘤細(xì)胞中制備免疫原性裂解物的方法，如此獲得的裂 解物，以及負(fù)載有所述裂解物的樹(shù)突狀細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供了一種含有該裂解物或樹(shù) 突狀細(xì)胞的藥物組合物。而且，本發(fā)明還提供了所述裂解物、樹(shù)突狀細(xì)胞或藥物組合物在預(yù) 防或治療間皮瘤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胸膜腔的惡性間皮瘤是一種高致命的腫瘤。從癥狀發(fā)作起，平均存活持續(xù)時(shí)間為 9-15個(gè)月，預(yù)后較差。到目前為止，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的根治性治療（curativetherapy)惡性胸膜 間皮瘤（下稱：間皮瘤）的手段。如胸膜切除術(shù)和胸膜外全肺切除術(shù)的手術(shù)方法會(huì)導(dǎo)致高 的局部復(fù)發(fā)率和可疑的生存希望（questionablesurvivalbenefit)。唯一經(jīng)美國(guó)食品和 藥物管理局（FDA)核準(zhǔn)的治療為培美曲塞（pemetrexed)(艾寧達(dá)Alimta)/順鉑，具有三個(gè) 月的平均生存希望。由于目前治療方式的有限成就，迫切需要新的治療方案。利用免疫系 統(tǒng)的特異性和效力的可能性成為了癌癥免疫治療中與日倶增的興趣的基礎(chǔ)。一種激活患者 免疫系統(tǒng)的方法是使用樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)呈現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原，從而產(chǎn)生抗腫瘤特異性的應(yīng)答。 [0003]樹(shù)突狀細(xì)胞是位于機(jī)體與它所處的環(huán)境的戰(zhàn)略性位置的高運(yùn)動(dòng)性和非常有效的 抗原呈遞細(xì)胞。在這些位置，它們收集抗原并將抗原輸送到二級(jí)淋巴器官，在這里，它們指 導(dǎo)和控制自然殺傷細(xì)胞，B和T淋巴細(xì)胞的活化，并有效地激活它們以對(duì)抗抗原[1]。該屬 性使得他們成為對(duì)癌癥的治療策略中有吸引力的候選者[2-3]。樹(shù)突狀細(xì)胞可以在體外大 量的產(chǎn)生，繞過(guò)由免疫抑制腫瘤環(huán)境引起的抗原呈遞缺陷[4-7]，并隨后以成熟狀態(tài)注入以 誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答[8-11]。
[0004] 已發(fā)現(xiàn)，基于樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫療法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類的某些癌癥，比如腎細(xì)胞 癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肺癌中能夠誘導(dǎo)保護(hù)性和抗腫瘤免疫性[12]。這在間皮瘤中也 被證明。特別地發(fā)現(xiàn)，基于樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫療法在惡性間皮瘤的小鼠模型中的生存率和 腫瘤生長(zhǎng)的減慢上具有有益效果[13]。
[0005]基于這些在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的臨床前發(fā)現(xiàn)，已啟動(dòng)臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估，在間皮瘤患者中， 脈沖的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的安全性和可行性[14]。10例患 者接受化療（培美曲塞/順鉑），然后進(jìn)行三次自體腫瘤裂解物負(fù)載的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突 狀細(xì)胞的疫苗接種。如較早在小鼠中發(fā)現(xiàn)的那樣，在接種樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗之前化療，以減少 腫瘤負(fù)荷，從而潛在地增加接種的功效。從該研究中能夠清楚的知道，在間皮瘤患者化療后 注射自體腫瘤裂解物負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞是安全和耐受性良好的。
[0006] 但是，使用自體腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞具有一定的理論和實(shí)際的缺點(diǎn)。 與自體的途徑相關(guān)聯(lián)的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是，來(lái)自于胸惡性腫瘤的切除腫瘤材料的腫瘤細(xì)胞， 特別是間皮瘤（胸水或活組織檢查）的數(shù)量是非常有限的。作為一個(gè)例子，第一次使用樹(shù) 突狀細(xì)胞的基于免疫治療間皮瘤的人臨床試驗(yàn)中，大多數(shù)患者被排除參與[14]。在總數(shù)為 57位的間皮瘤患者中，只有10例患者能提供足夠的腫瘤材料，雖然所有患者在CT/MRI掃描 中有高腫瘤負(fù)荷。
[0007] 此外，從患有間皮瘤的患者獲得的自體腫瘤材料在腫瘤總數(shù)上是非常不同的，并 被其它細(xì)胞"污染"。這導(dǎo)致高度可變的腫瘤細(xì)胞裂解物，使得標(biāo)準(zhǔn)化非常困難。當(dāng)這樣的 腫瘤材料被負(fù)載到自體樹(shù)突狀細(xì)胞時(shí)，表型和刺激能力的不同結(jié)果是可以預(yù)見(jiàn)的。此外，為 每個(gè)單獨(dú)的患者制備自體腫瘤材料是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。此外，還需要對(duì)每個(gè)病人的裂解物批次 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使得基于自體腫瘤裂解物的樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫治療過(guò)程是非常昂貴的。
[0008] 與使用自體間皮瘤腫瘤細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的另一局限是在體外操作腫瘤來(lái)源的細(xì)胞的 難度。用以優(yōu)化制備腫瘤細(xì)胞衍生物（凋亡或壞死碎片）、增加免疫原性或通過(guò)蛋白質(zhì)分級(jí) 富集、以及其他重要的以增加療效的步驟的不同方法不能直接在腫瘤的自體材料上進(jìn)行實(shí) 施。離體培養(yǎng)自體細(xì)胞直到細(xì)胞數(shù)量足夠用以操縱是不合適的，因?yàn)榧词惯M(jìn)行短期培養(yǎng)間 皮瘤細(xì)胞，大多數(shù)也未能產(chǎn)生細(xì)胞系。另一個(gè)使用自體腫瘤細(xì)胞是不可行的原因是需要相 對(duì)長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，而在此期間，患者的疾病會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。
[0009] 在現(xiàn)有技術(shù)中，已有建議使用凋亡的同種異體間皮瘤腫瘤細(xì)胞用于負(fù)載自體樹(shù)突 狀細(xì)胞。在這方面，參考了Ebstein等人2003年在AmericanJournalofRespirationand CriticalCareMedicine雜志上的文章。在本文中，將來(lái)源于一種細(xì)胞系的完整凋亡的、同 種異體間皮瘤腫瘤細(xì)胞用于體外研究，其中自體樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載有所述完整凋亡的腫瘤細(xì) 胞。
[0010] 雖然在本研究結(jié)果中表明，用過(guò)表達(dá)凋亡熱休克蛋白的間皮瘤細(xì)胞培養(yǎng)樹(shù)突狀 細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，Ebstein的方法和所使用的細(xì)胞在臨床上并不可用。 Ebstein使用的細(xì)胞來(lái)源于一種細(xì)胞系，因而呈遞給樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原將是相對(duì)有限的，因 此將嚴(yán)重降低其臨床用途。這還可以通過(guò)以下事實(shí)例證：如果腫瘤細(xì)胞之前已經(jīng)進(jìn)行了熱 休克處理，使用的細(xì)胞系只表現(xiàn)出積極的結(jié)果。更重要的是，Ebstein使用的僅僅是用UV-B 輻射誘導(dǎo)凋亡的完整的腫瘤細(xì)胞。因?yàn)樵S多細(xì)胞可以在這種UV-B輻射處理下存活，因此它 們不適合給藥于患者。在這方面可以參考查ChalmersA.H等人1976年在CancerResearch 和SalucciS?等人2013 年在InternationalJournalofMolecularSciences上的報(bào)道。
[0011] 因此，仍然需要提供一種安全可靠的方法用于治療間皮瘤患者，以及提供用于預(yù) 防或治療間皮瘤的用途的藥物和藥物組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種用于制備免疫原性裂解物的方法，該包括以下步 驟：
[0013] i)提供來(lái)自至少兩種不同細(xì)胞系的同種異體間皮瘤腫瘤細(xì)胞；
[0014] ii)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡；
[0015] iii)裂解壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞，以獲得裂解物。
[0016] 在本發(fā)明的方法中，來(lái)自至少兩種不同的細(xì)胞系的同種異體間皮瘤腫瘤細(xì)胞第一 次被用于制備可用于免疫治療具有間皮瘤增加風(fēng)險(xiǎn)的人群或患者的裂解物。
[0017] 由于不同的抗原表達(dá)發(fā)生在患者不同的間皮瘤腫瘤細(xì)胞系中，因此，提供給患者 負(fù)載有僅來(lái)自一種細(xì)胞系的樹(shù)突狀細(xì)胞是不足夠的。相反，重要的是，用充足的腫瘤抗原來(lái) 源來(lái)負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞，以使得細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答被誘導(dǎo)以抵抗種類繁多的間皮瘤腫瘤。
[0018] 本發(fā)明中，這通過(guò)使用來(lái)自于至少兩種不同的細(xì)胞系的同種異體間皮瘤腫瘤細(xì)胞 裂解物負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)使用不同的細(xì)胞系，因此，在裂解物中呈現(xiàn)出了大量的 抗原，所述裂解物可以用于負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞。這樣一來(lái)，患者的間皮瘤腫瘤通過(guò)下調(diào)特定抗 原來(lái)逃避的機(jī)會(huì)將減少。
[0019] 此外，使用所述腫瘤細(xì)胞的裂解物來(lái)負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞是本發(fā)明的本質(zhì)。由于使用 了腫瘤細(xì)胞的裂解物，可以獲得更好的來(lái)自不同腫瘤細(xì)胞系的不同抗原的混合物。這樣，負(fù) 載著所述裂解物的樹(shù)突狀細(xì)胞可以呈遞來(lái)自不同腫瘤細(xì)胞系的所有抗原。而這通過(guò)使用完 整的細(xì)胞系（intact)是（同種異體腫瘤細(xì)胞）不可能實(shí)現(xiàn)的。使用裂解物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn) 是，它更容易大量生產(chǎn)，這更容易處理和包裝，并且其質(zhì)量可以被相對(duì)容易的監(jiān)控。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"間皮瘤腫瘤細(xì)胞"是指來(lái)源于惡性間皮瘤的細(xì)胞。
[0021] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"同種異體"具有其正常的科學(xué)意義，是指腫瘤細(xì)胞來(lái) 源的個(gè)體與將根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的裂解物進(jìn)行后續(xù)給藥的個(gè)體不同。從同種異體間皮 瘤腫瘤細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞裂解物提供了更加標(biāo)準(zhǔn)化和簡(jiǎn)單的方法，繞過(guò)了需要單獨(dú)制備 自體腫瘤裂解物。它也提供了選擇最佳的來(lái)源（凋亡或壞死）、劑量和呈遞到樹(shù)突狀細(xì)胞或 進(jìn)行增加細(xì)胞免疫原性操作的機(jī)會(huì)。強(qiáng)大和有效的大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程的利用也要求較少的產(chǎn) 品批次用以質(zhì)量控制測(cè)試，如一致性（identity)、純度、數(shù)量和無(wú)菌/安全測(cè)試。相比于自 體，同種異體途徑的主要優(yōu)點(diǎn)是，腫瘤細(xì)胞可以被優(yōu)化，大容量存儲(chǔ)，和及時(shí)制造/質(zhì)量控 制，由于供給已經(jīng)存在，因此，不影響患者的直接疾病進(jìn)展。
[0022] 按照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"壞死"具有其正常的科學(xué)意義，是指細(xì)胞的形態(tài)變化。壞死，例 如，特別是以細(xì)胞膜的"泄漏"為特征，即，增加的滲透性，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)容物外排和擾動(dòng)細(xì) 胞穩(wěn)態(tài)和離子的平衡的物質(zhì)的涌入，DNA片段化，最終產(chǎn)生來(lái)源于瓦解的細(xì)胞的粒狀結(jié)構(gòu)， 例如細(xì)胞碎片。通常，壞死導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌到周圍環(huán)境，當(dāng)在體內(nèi)發(fā)生時(shí)，導(dǎo)致促炎反應(yīng)。
[0023] 測(cè)定細(xì)胞是否壞死的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇哪種方法 并不重要，因?yàn)椴煌姆椒ㄊ且阎摹?br>[0024] 根據(jù)本發(fā)明，壞死細(xì)胞可以被確定，例如，通過(guò)光、熒光或電子顯微技術(shù)，使用例如 臺(tái)盼藍(lán)的經(jīng)典染色，憑借壞死細(xì)胞吸收該染料，因此被染成藍(lán)色，或通過(guò)包括喪失膜完整 性、細(xì)胞器的崩解和/或染色質(zhì)的絮凝區(qū)的形態(tài)變化區(qū)分壞死細(xì)胞。其他方法包括流式細(xì) 胞術(shù)，例如通過(guò)用碘化丙錠染色壞死細(xì)胞。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"凋亡"具有其正常的科學(xué)意義，是指程序性細(xì)胞死亡。如果細(xì) 胞凋亡，細(xì)胞中會(huì)發(fā)生各種變化，如細(xì)胞皺縮、核破碎、染色質(zhì)濃縮、染色體DNA片段化。
[0026] 凋亡細(xì)胞可被確定，例如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，例如使用膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)實(shí)現(xiàn)，用熒光：氟化鈉紅（Flura-red)，奎因-2 (Quin-2)，7-氨基放線菌素 D(7-AAD)，羅丹明123積累的減少，由核酸內(nèi)切酶：TUNEL-方法（末端核苷酸轉(zhuǎn)移引起的 X-UTP缺口標(biāo)記）檢測(cè)的DNA片段化；通過(guò)用赫斯特（Hoechst) 33258染料染色利用光學(xué)顯 微鏡；通過(guò)免疫印跡（Westernblot)分析，例如通過(guò)用特定的抗體標(biāo)記89kDa產(chǎn)物檢測(cè)細(xì) 胞凋亡蛋白酶3(caspase3)的活性，或者通過(guò)用特定的抗體標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞色素C的流出； 或者利用特定DNA梯度，通過(guò)瓊脂糖凝膠DNA分析對(duì)典型的DNA片段進(jìn)行檢測(cè)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"裂解"涉及本領(lǐng)域用于打開(kāi)/破壞細(xì)胞的公知的各種方法。原 則上，任何可以實(shí)現(xiàn)裂解腫瘤細(xì)胞的方法都可以使用。適當(dāng)?shù)姆椒梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員 在現(xiàn)有技術(shù)中選擇。例如，可以通過(guò)酶促、化學(xué)或物理的方法打開(kāi)/破壞細(xì)胞?？捎糜诹呀?腫瘤細(xì)胞的酶和酶混合物的實(shí)例可以是蛋白酶，如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶。化學(xué)物質(zhì)的非 限制性的實(shí)例為例如尼格羅霉素（nigromycin)的離子載體，例如十二烷基硫酸鈉的洗滌 劑、酸或堿；和物理方法的非限制性的實(shí)例是例如弗氏壓碎器（Frenchpressing)的高壓， 摩爾滲透壓濃度，溫度如熱或冷。裂解細(xì)胞的首選方法是使細(xì)胞凍融。另外，除了蛋白水解 酶、酸、堿等，也可以使用合適的酶的組合。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"裂解物"是指含有通過(guò)裂解腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白和因子的 水溶液或懸浮液。這樣的裂解物可以包括大分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、脂類 等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂質(zhì)酸等，或來(lái)自裂解的細(xì)胞的碎片。存在于所述裂解物 中的細(xì)胞碎片可以是平滑的或粒狀的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述水介質(zhì)是水，生理鹽水或緩沖液。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的所述裂解物不限于裂解的壞死細(xì)胞。例如，由于處理的細(xì)胞的不同 敏感性，或由于處理?xiàng)l件，如UVB輻射，裂解的凋亡細(xì)胞也可以形成裂解物或成為裂解物的 一部分。
[0030] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"裂解物"也包括從上述裂解物中獲得的制劑或片段。這些片段 可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法獲得，例如色譜法，包括，例如親和層析、離子交換層 析、大小排阻層析、反相層析和其它位于層析柱或分批法中的材料的層析，其它分級(jí)方法， 例如過(guò)濾方法，例如超濾、透析、離心中尺寸排阻透析和濃縮、密度梯度或階梯陣矩（step matrices)離心、沉淀，例如親和沉淀，鹽溶或鹽析（硫酸銨沉淀），醇沉淀，或其它蛋白質(zhì)化 學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，免疫學(xué)，化學(xué)或物理方法來(lái)分離上述裂解物的組分。在一種優(yōu)選 的實(shí)施方案中，優(yōu)選那些比其他具有更強(qiáng)的免疫原性的片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇 合適的方法，并通過(guò)上述的一般說(shuō)明和本文實(shí)施例中的具體說(shuō)明，如果有必要，并適當(dāng)?shù)匦?改或改變這些方法來(lái)確定其免疫原性潛力。
[0031] 優(yōu)選地，在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)壞死或凋亡之前，將間皮瘤腫瘤細(xì)胞的免疫原性增強(qiáng)。 這種免疫原性的增加可以通過(guò)在41. 2°C或更高溫度下孵育同種異體腫瘤細(xì)胞1-120分鐘， 優(yōu)選20-50分鐘，最優(yōu)選約30分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)。另一種增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性的方法是通過(guò) 將腫瘤細(xì)胞暴露于氧化修飾，例如將細(xì)胞暴露于次氯酸或過(guò)氧化氫中來(lái)實(shí)現(xiàn)。同種異體腫 瘤細(xì)胞的免疫原性也可通過(guò)將細(xì)胞暴露于組蛋白脫乙酰酶抑制劑，如丙戊酸或辛二酰苯胺 異輕S虧酸（suberoylanil