一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹(shù)突狀細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，特別一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹(shù)突狀細(xì) 胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多、靶向殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來(lái)殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的 細(xì)胞，打破免疫耐受、激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。細(xì)胞免疫 治療具有副作用小、靶向治療、作用范圍更加廣泛等特點(diǎn)，在臨床研宄中備受關(guān)注。據(jù)報(bào)道， 經(jīng)過(guò)多個(gè)療程的細(xì)胞免疫治療，能夠有效殺除患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)康復(fù)，改善患者的生 活質(zhì)量。樹(shù)突狀細(xì)胞療法是目前研宄最多的細(xì)胞免疫治療療法之一。
[0003] 樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presentingcell，APC)，一方面，其能夠刺激初始的T細(xì)胞增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；另一方面， 樹(shù)突狀細(xì)胞還能夠呈遞抗原給MHC-I類(lèi)限制性⑶8+和MHC-II類(lèi)限制性⑶4 +T淋巴細(xì)胞，誘 導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱(chēng)為"天然免疫佐劑"，因此，樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特 的地位。近年來(lái)，以DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床應(yīng)用中得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，是國(guó) 內(nèi)外研宄的熱點(diǎn)。
[0004] 隨著研宄的深入，發(fā)現(xiàn)充足的DC細(xì)胞成為了DC細(xì)胞免疫治療研宄中的技術(shù)瓶頸。 現(xiàn)有的DC細(xì)胞制備方法中，大多采用抽取外周血培養(yǎng)，分離出造血干細(xì)胞，之后在多種細(xì) 胞因子存在下培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得造血干細(xì)胞，制備獲得DC細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程操作復(fù)雜，并且因?yàn)?細(xì)胞來(lái)源數(shù)量低、所得造血干細(xì)胞的數(shù)量也少，最終影響了DC細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量，導(dǎo)致治療 效果不理想。所以，十分有必要需找新的DC細(xì)胞的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供了一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹(shù)突 狀細(xì)胞。本發(fā)明利用間充質(zhì)干細(xì)胞，成功制備獲得了樹(shù)突狀細(xì)胞，為樹(shù)突狀細(xì)胞的制備提供 了一種新的制備方法，且操作簡(jiǎn)單，可用于樹(shù)突狀細(xì)胞的大量制備。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟：
[0008] 步驟1 :獲得間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0009] 步驟2 :取所得間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后，得貼壁細(xì)胞；
[0010] 步驟3 :培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得貼壁細(xì)胞，收集樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0011] 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSC)，是一類(lèi)多能干細(xì)胞，源于發(fā)育早 期的中胚層和外胚層。主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，由 于骨髓是其主要來(lái)源，因此統(tǒng)稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于非終末分化細(xì)胞， 它既有間質(zhì)細(xì)胞，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征。間充質(zhì)干細(xì)胞在體外特定的誘導(dǎo)條件 下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島0細(xì)胞和內(nèi)皮等多種組織細(xì) 胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質(zhì) 干細(xì)胞，一般都不會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)。由于間充質(zhì)干細(xì)胞具備的這種免疫學(xué)特性，使其 在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過(guò)自體移植可以 重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且可避免免疫排斥反應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中 的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明 的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明 以間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后，誘導(dǎo)所得貼壁細(xì)胞，即制備獲得樹(shù)突狀細(xì)胞，操 作簡(jiǎn)單，可用于樹(shù)突狀細(xì)胞的大量制備。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中的誘導(dǎo)所用誘導(dǎo)試劑包括第一誘導(dǎo) 試劑和第二誘導(dǎo)試劑；
[0013] 該第一誘導(dǎo)試劑包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；
[0014]該第二誘導(dǎo)試劑包括TNF-a。
[0015]GM-CSF為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，是一種細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供 的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中GM-CSF的濃度100ng/mL?200ng/mL。在本發(fā)明的一些實(shí)施 例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF的濃度為100ng/mL。在本發(fā)明 的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF為rhGM-CSF。
[0016]IL-4為白細(xì)胞介素4,是一種細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一 誘導(dǎo)試劑中IL-4的濃度為30ng/mL?50ng/mL。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的 制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的IL-4的濃度為30ng/mL。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本 發(fā)明提供的制備方法中，IL-4為rhIL-4。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中胎牛血清的濃度為10%。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中，谷氨酰胺的濃度為2mmol/L?4mmol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中，谷氨 酰胺的濃度為2mmol/L。
[0019] TNF-a是一種腫瘤壞死因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第二誘導(dǎo)試劑 中，TNF-a的濃度為500UI/mL?150〇n/mL。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制 備方法中，第二誘導(dǎo)試劑中，TNF-a的濃度為l〇〇〇n/mL。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中培養(yǎng)、誘導(dǎo)包括：
[0021] 向所得貼壁細(xì)胞中加入含第一誘導(dǎo)試劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)；在補(bǔ)加含第一誘導(dǎo)試劑 的培養(yǎng)液之后，再加入含第二誘導(dǎo)試劑的培養(yǎng)液；之后，進(jìn)行檢測(cè)，收集樹(shù)突狀細(xì)胞，即得。
[0022] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中所述培養(yǎng)、誘導(dǎo)具 體為：
[0023] 向所得貼壁細(xì)胞中加入含第一誘導(dǎo)試劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)；
[0024]在培養(yǎng)的第三天補(bǔ)加半量該含第一誘導(dǎo)試劑的培養(yǎng)液；
[0025]在培養(yǎng)的第六天，半量離心，補(bǔ)加含第二誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，
[0026] 在培養(yǎng)的第七天，進(jìn)行檢測(cè)，收集樹(shù)突狀細(xì)胞，即得。
[0027]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述收集樹(shù)突狀細(xì)胞為：將誘導(dǎo)并促熟后的DC細(xì)胞離 心清洗后吸去上清，加入lmL細(xì)胞凍存液，混勻后凍存于2mL的凍存管中，置于凍存盒中，放 入-80 °C冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮保存；所述細(xì)胞凍存液包括20%人血白蛋白、無(wú)血清培養(yǎng)基和DMSO,所述20%人血白蛋白、無(wú)血清培養(yǎng)基和DMSO的體積比為5:4:1。
[0028] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟1中獲得間充質(zhì)干細(xì) 胞的方法具體為：
[0029] 獲得沃爾頓膠，種植于含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)液中，組織塊貼壁法培養(yǎng)，即獲得間充質(zhì) 干細(xì)胞。
[0030] 間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法優(yōu)選但不限定為本發(fā)明提供的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以根據(jù)實(shí)際情況選擇制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0031] 本發(fā)明提供了一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹(shù)突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的樹(shù)突 狀細(xì)胞的制備方法包括：獲得間充質(zhì)干細(xì)胞；取所得間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后，得貼壁細(xì) 胞；培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得貼壁細(xì)胞，收集樹(shù)突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備方法利用間充質(zhì)干細(xì)胞 作為種子細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)后，誘導(dǎo)所得貼壁細(xì)胞，即制備獲得樹(shù)突狀細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，可用于 樹(shù)突狀細(xì)胞的大量制備，使該制備方法更利于推廣和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的制 備方法成功制備獲得了樹(shù)突狀細(xì)胞，所得樹(shù)突狀細(xì)胞與常規(guī)方法所得樹(shù)突狀細(xì)胞相比，形 態(tài)及功能上并無(wú)差異，說(shuō)明該方法可用于樹(shù)突狀細(xì)胞的大量制備。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1示實(shí)施例2所得間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分析結(jié)果；其中，圖1-A為間充質(zhì)干細(xì)胞的 流式圖；圖1-B為間充質(zhì)干細(xì)胞的倒置顯微鏡下形態(tài)圖；
[0033] 圖2示實(shí)施例2中所得樹(shù)突狀細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果；其中，DC代表樹(shù)突狀細(xì) 胞；
[0034] 圖3示實(shí)施例2中所得樹(shù)突狀細(xì)胞的HLA-DR+CD86+的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
[0035] 圖4示實(shí)施例2中所得樹(shù)突狀細(xì)胞的⑶83+CD86+的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
[0036] 圖5示實(shí)施例2中所得