一種懸浮-貼壁法制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼養(yǎng)層（Feeder)細(xì)胞的制備方法，具體涉及一種懸浮-貼壁法制備飼 養(yǎng)層細(xì)胞的方法，屬于體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs)很多特性與胚 胎干細(xì)胞極為相似，能分化為幾乎所有的成體細(xì)胞，由于其可通過(guò)細(xì)胞重編程技術(shù)從終末 分化的成體細(xì)胞得到，因此可獲得患者特異性或疾病特異性的iPSCs，促使其成為研究疾病 發(fā)生機(jī)制、個(gè)體化藥物治療、藥物篩選和細(xì)胞治療的熱點(diǎn)，進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病 治療的距離。iPSCs在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中容易發(fā)生分化和核型不穩(wěn)定情況，在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中 維持iPSCs正常不分化狀態(tài)和自我更新能力是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作。而長(zhǎng)期培養(yǎng)在飼養(yǎng) 層體系中是維持iPSCs不分化狀態(tài)和核型穩(wěn)定最簡(jiǎn)單、直接和有效的方法，因此制備高質(zhì) 量的Feeder成為培養(yǎng)iPSCs的關(guān)鍵技術(shù)。
[0003] 目前，F(xiàn)eeder制備方法主要有射線照射法和絲裂霉素（Mitomycin C，MMC)處 理法：Y射線法的優(yōu)點(diǎn)是可大批量處理細(xì)胞，但是由于Y射線存在放射性污染及儲(chǔ)存監(jiān) 管程序繁瑣，費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，世界上很多地區(qū)已找不到放射源，因此多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究仍采用 MMC法來(lái)制備Feeder。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，是最 常用的Feeder細(xì)胞來(lái)源；而CF-1 MEFs是培養(yǎng)人iPSCs (hiPSCs)最常用的Feeder細(xì)胞來(lái) 源，具有增殖能力極強(qiáng)、可覆層生長(zhǎng)、密度依賴性高、低密度時(shí)易發(fā)生老化等特點(diǎn)。
[0004] 傳統(tǒng)MMC法制備CF-1 MEF Feeder時(shí)，通常需要將細(xì)胞以較低密度鋪至細(xì)胞培養(yǎng) 皿/瓶中，待其長(zhǎng)至<100%融合(保證細(xì)胞為單層存在)時(shí)，用MMC抑制其有絲分裂，在這一 過(guò)程中存在諸多問(wèn)題：1) MEFs的生物學(xué)行為易受影響：由于MEFs低密度時(shí)易發(fā)生老化，分 泌hiPSCs必需營(yíng)養(yǎng)因子的能力就會(huì)下降，可能影響到hiPSCs的生長(zhǎng)狀態(tài)；2)有絲分裂抑制 不充分或得到的Feeder質(zhì)量不高：MEFs增長(zhǎng)速度過(guò)快，易出現(xiàn)覆層生長(zhǎng)，若此時(shí)用MMC直 接處理MEFs，部分細(xì)胞可能由于與MMC接觸不充分、甚至接觸不到MMC，產(chǎn)生細(xì)胞增殖抑制 不充分的現(xiàn)象，或需要延長(zhǎng)MMC處理時(shí)間，而長(zhǎng)時(shí)間接觸MMC會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，進(jìn)而影響 所得Feeder支持hiPSCs的能力；3)處理時(shí)間受限：為了充分抑制細(xì)胞增殖并保證Feeder 的質(zhì)量，最好在細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%融合時(shí)用MMC處理，但MEFs增殖速度很快，易出現(xiàn)覆層 生長(zhǎng)從而錯(cuò)過(guò)最佳處理時(shí)間。因此，急需一種方法，既能獲得高質(zhì)量Feeder細(xì)胞，又能使操 作靈活方便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種懸浮-貼壁法制備 飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法；該方法可克服傳統(tǒng)MMC法制備MEFFeeder時(shí)易出現(xiàn)細(xì)胞有絲分裂抑制 不充分、所得Feeder質(zhì)量不高、MEFs增殖速度過(guò)快、最佳處理時(shí)間不易掌握等技術(shù)缺陷；本 發(fā)明方法既能充分抑制細(xì)胞有絲分裂，又能篩選出狀態(tài)良好的細(xì)胞作為Feeder，可提高所 制備Feeder的質(zhì)量，制備時(shí)間更為靈活方便。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種懸浮-貼壁法制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法，包括CF-1MEFs原代獲取、CF-1MEFs傳 代培養(yǎng)和懸浮-貼壁法CF-1MEFFeeder制備三個(gè)步驟，制備CF-1MEFFeeder時(shí)采用懸 浮-貼壁法，具體包括以下步驟： (1)CF-1MEFs原代（P0)獲?。?I、 取孕12. 5天的CF-1小鼠，脫頸處死、無(wú)菌條件下取出胚胎，用10mlPBS(即磷酸鹽 緩沖液）清洗后放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中；去除胚胎頭部和內(nèi)臟，用l〇mlPBS清洗2次； II、 將剩余組織移至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌剪刀將組織剪碎，每個(gè)胚胎加入lml消 化液，同時(shí)吹打數(shù)次，放入培養(yǎng)箱中消化5min;加入與消化液等體積的培養(yǎng)液終止消化后 充分吹打盡量分散為單細(xì)胞； III、 將上述細(xì)胞懸液混勻后，每個(gè)T75培養(yǎng)瓶添加2個(gè)胚胎的細(xì)胞懸液和13ml培養(yǎng) 液，然后將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶上注明細(xì)胞名稱、代次P0及日期。
[0007] (2)CF-1MEFs傳代培養(yǎng)： ① 、P0代CF-1MEFs培養(yǎng)3天后，倒置顯微鏡下觀察MEFs長(zhǎng)滿T75培養(yǎng)瓶底時(shí)，吸棄 培養(yǎng)液，用l〇mlPBS清洗細(xì)胞一遍，然后加入2ml消化液將其混至覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底部； ② 、培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中孵育3分鐘，用手輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)壁使MEFs細(xì)胞脫落；用2ml培 養(yǎng)液終止消化，同時(shí)輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液； ③ 、將上述細(xì)胞懸液均分到3個(gè)175培養(yǎng)瓶中（即為1 :3傳代培養(yǎng))，用培養(yǎng)液補(bǔ)至15ml 進(jìn)行傳代，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； ④ 、用此方法，將細(xì)胞傳至第3代。
[0008] (3)、懸浮-貼壁法CF-1 MEF Feeder制備： A、CF-1MEFs傳代至第3代的第4天后，吸棄培養(yǎng)液，用10mlPBS清洗細(xì)胞一遍，添加 2ml消化液于培養(yǎng)箱中消化3分鐘，然后用手輕拍側(cè)壁使細(xì)胞脫落，再用2ml培養(yǎng)液中止消 化，同時(shí)輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞收集到離心管中后計(jì)數(shù)； B、 將步驟A中收集的細(xì)胞按照8X104個(gè)/cm2~11X104個(gè)/cm2的密度轉(zhuǎn)移至直徑10cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液將總體積補(bǔ)至6ml，充分混勻； C、 將裝有細(xì)胞的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，細(xì)胞會(huì)逐漸貼至培養(yǎng)皿底壁，從放入培養(yǎng)箱 內(nèi)開(kāi)始計(jì)時(shí)，2~3小時(shí)后避光條件下將MMC加至上述培養(yǎng)皿中，將MMC濃度調(diào)整至lOPg/ml， 充分混勻后放回培養(yǎng)箱； D、 在培養(yǎng)箱中MMC處理0. 5小時(shí)~3. 5小時(shí)后，迅速吸棄培養(yǎng)皿中含MMC的培養(yǎng)液及未 貼壁細(xì)胞； 整個(gè)懸浮-貼壁過(guò)程是從步驟C中的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中開(kāi)始，到步驟D中的MMC處理 結(jié)束為止，整個(gè)懸浮-貼壁過(guò)程(貼壁處理2~3小時(shí)+MMC處理時(shí)間)總時(shí)間要求彡3. 5小時(shí) ~4. 5小時(shí)，可保證狀態(tài)良好的細(xì)胞在3. 5小時(shí)~4. 5小時(shí)內(nèi)貼壁；MMC最佳處理時(shí)間為0. 5 小時(shí)~3. 5小時(shí)，因此在合理時(shí)間范圍內(nèi)加入MMC可以盡可能的讓狀態(tài)好的細(xì)胞貼壁，從而 篩選出狀態(tài)良好的細(xì)胞作為Feeder，提高Feeder的質(zhì)量和回收細(xì)胞量； E、 貼壁細(xì)胞用6~8mlPBS沖洗7次，棄掉因沖洗脫落下來(lái)的細(xì)胞及PBS; F、 仍貼壁的細(xì)胞用lml消化液于培養(yǎng)箱中消化3分鐘后，用手輕拍側(cè)壁使細(xì)胞脫落； 用lml培養(yǎng)液終止消化，同時(shí)輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液，將其收集到離心管中，1000轉(zhuǎn)/分 鐘條件下離心5分鐘后棄掉上清液，沉淀細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br>[0009] 優(yōu)選的，懸浮-貼壁法制備CF-1MEFFeeder時(shí)，步驟B中，所述的細(xì)胞按照9X104 個(gè)/cm2~10X104個(gè)/cm2的密度轉(zhuǎn)移至直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
[0010] 優(yōu)選的，懸浮-貼壁法制備CF-1MEFFeeder時(shí)，步驟F中，凍存液配方各成分體 積比為為培養(yǎng)液：胎牛血清（FBS):二甲基亞砜（DMS0)