犬原代細支氣管上皮細胞及其在制備永生化細胞中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及犬原代細支氣管上皮細胞及其在制備永生化細胞中的應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]隨著人類文明程度的提高，伴侶動物如犬的疾病研宄早已成為獸醫(yī)學研宄的一個重點。對犬而言，傳染性疾病多發(fā)于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常發(fā)病，對犬的危害最大。目前多種病毒和細菌等微生物被認為是引起犬呼吸系統(tǒng)疾病的病原，如2004年爆發(fā)隨后陸續(xù)報道的犬流感病毒。然而，相較于畜禽病原，犬類病原研宄比較薄弱，特別是這些病原對犬呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生起著怎樣的作用，致病機理如何，尚不清楚。
[0003]氣道上皮是氣道與外界環(huán)境接觸的第一道防線，不僅是各種病原體、炎癥介質(zhì)作用的靶細胞，還作為效應細胞合成、釋放多種炎性介質(zhì)和細胞因子，從而參與氣道炎癥及免疫反應。在研宄人類以及畜禽呼吸道病原感染的致病機理方面，支氣管上皮細胞等已被廣泛用作細胞模型[Massin P, Kuntz-Simon G, Barbezange C，etal.Temperature sensitivity on growth and/or replicat1n of H1N1, HlN2and H3N2influenza A viruses isolated from pigs and birds in mammalian cells.VetMicrob1l, 2010，142:232 - 241.]，然而目前，對于犬類病原的研宄還缺乏合適的細胞模型。
[0004]犬流感病毒是近年來新發(fā)現(xiàn)的犬類病原。有研宄表明，犬感染犬流感病毒后會發(fā)生嚴重的氣管支氣管炎，受體結(jié)合試驗表明犬流感病毒在犬的支氣管和細支氣管上皮細胞中大量發(fā)現(xiàn)，而在氣管上皮細胞中鮮有發(fā)現(xiàn)[Song D, Kang B, Lee C，et al.Transmiss1nof avian influenza virus(H3N2)to dogs.Emerg Infect Dis,2008，14:741-746.]。同時感染犬的病理組織學檢查顯示，病變在下呼吸道即細支氣管和肺泡尤為嚴重，而在上呼吸道即氣管和支氣管病變則相對溫和[Jung K, Lee CS, Kang BK, et al.Pathologyin dogs with experimental canine H3N2 influenza virus infect1n.Res Vet Sci2010,88:523-527.]，說明細支氣管上皮細胞的獲得將對研宄犬流感病毒的致病機理具有相當大的價值。由于細支氣管上皮細胞在體外培養(yǎng)難以長期傳代生存，因此制備永生化的犬細支氣管上皮細胞具有重要意義。
[0005]細胞永生化是指細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后自發(fā)或受外界因素的影響脫離增殖衰老的危機，最終獲得無限增殖能力的過程。永生化自發(fā)生的幾率極低，因此通過導入外源基因的方法，使細胞永生化幾率得以提高，進而獲得永生化的細胞系。一般5代左右的細胞稱為原代細胞，超過20代的細胞可以稱為永生化細胞系[翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學(第4版)高等教育出版社.2011]。永生化細胞的檢測主要包括通過光學和電子顯微鏡與原代細胞進行形態(tài)學鑒定比較以及細胞表面抗原的檢測。目前在細胞的永生化上應用最多的是SV40大T抗原，但由于其永生化的細胞有致癌性，會改變原代細胞原有特性，因而用此種方法得到的永生化細胞研宄病毒感染細胞的致病機理不合適。
[0006]端粒是真核細胞染色體末端的特殊DNA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由一簡單重復的富含堿基鳥嘌呤G的高度保守的DNA序列及相關蛋白質(zhì)組成。隨著細胞分裂時染色體DNA復制的進行，端粒逐漸縮短，每次復制，由于“末端復制問題”的發(fā)生，DNA 5’端大概丟失50bp?200bp。由于其長度能夠反映出細胞的復制史和復制潛能，從而被稱為是細胞壽命的“有絲分裂鐘” [Haber DA.Telomeres, cance, and immortality.N Engl JMed, 1995，332(14):955-956.]。端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核蛋白酶，也是一種專一的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。能夠以自身RNA為模板，從端粒DNA 3’ -OH末端延伸或合成新的端粒DNA，從而補償細胞分裂造成的染色體末端的縮短，使細胞不會在端粒耗盡時出現(xiàn)凋亡。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其主要作用是與自身攜帶的RNA模板合成端粒重復DNA序列，并加到端粒末端而維持端粒的長度，以抵消或延緩端粒隨細胞分裂的不斷縮短。端粒酶不但可以保持染色體完整，還是細胞生存期限的關鍵性調(diào)控因子，同時還可以提高細胞對毒性因子和應激原等的耐受能力，在細胞的永生化進程中起重要作用。目前研宄比較透徹的人類的端粒酶是由端粒酶RNA、端粒酶相關蛋白以及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶組成的[Danielle R, Li L, Stephen F，et al.Characterizat1n of Growth and Differentiat1nin a Telomerase-1mmortalized Human Corneal Epithelial Cell Line.1nvestigativeOphthalmology and Visual Science, 2005，46:470-478.]。在原代培養(yǎng)的細胞中，轉(zhuǎn)入外源性的hTERT基因能夠誘導端粒酶活性，穩(wěn)定端粒的長度，從而使細胞壽命延長或永生化。hTERT能激活端粒酶，因此可能是新生和永生化細胞端粒酶的活化過程中的一個主要因素。
[0007]到目前為止，通過轉(zhuǎn)染hTERT基因已建立了許多永生化的細胞系，如Georg1s等在2005年將hTERT基因轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞[Michailidis G, Saretzki G, HallJ.Endogenous and ectopic express1n of telomere regulating genes in chickenembryonic fibroblasts.B1chem B1phys Res Commun.2005, 335(I):240 — 246.]，2009年吳慶俠等導入外源hTERT進山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞等[吳慶俠，王愛華，司永嘉等.山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞轉(zhuǎn)pC1-neo-hTERT質(zhì)粒后的永生化.中國獸醫(yī)學報，2010, 30(2):228-232.]。本發(fā)明通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染端粒酶基因獲得永生化的犬細支氣管上皮細胞，為研宄犬流感病毒等犬類病原的感染機制提供了重要的生物材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]技術問題
[0009]本發(fā)明的目的在于制備犬原代細支氣管上皮細胞，通過轉(zhuǎn)染端粒酶基因制備永生化的犬細支氣管上皮細胞，使其穩(wěn)定傳代至20代以上，為研宄犬流感病毒等犬類病原的感染機制提供了重要的生物材料。
[0010]技術方案
[0011]一種犬原代細支氣管上皮細胞，該細胞株CBEl于2014年12月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC:C2014223，分類命名:犬原代細支氣管上皮細胞。
[0012]所述的犬原代細支氣管上皮細胞通過轉(zhuǎn)染端粒酶真核表達載體獲得永生化的犬細支氣管上皮細胞。其特征在于:
[0013]I)真核表達載體重組質(zhì)粒pEGFP-hTERT的構(gòu)建
[0014]按照質(zhì)粒DNA小提中量純化試劑盒步驟提取質(zhì)粒PC1-neo-hTERT，經(jīng)質(zhì)量比I %瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定正確后用EcoR I和Sal I雙酶切重組質(zhì)粒，利用小量膠回收試劑盒純化回收3.5kb的片段，即為hTERT ；
[0015]用EcoR I和Sal I雙酶切熒光真核表達載體pIRES2_EGFP，酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，與hTERT按摩爾比4:1的比例加入目的片段和載體，然后加入I yL T4DNA Ligase，配制10 μ L連接體系，混勻后于PCR儀16°C過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性篩