；細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗:即含有青霉素(1jOOOIU)和鏈霉素(10, 000 μ g/mL)在100倍的工作濃度的混合液(Hycolne);細(xì)胞培養(yǎng)用抗生素:恩諾沙星(用lmol/L氫氧化鈉配成20 μ g/mL，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司)和兩性霉素(用高壓過(guò)的超純水配成5yg/mL，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，用于新分離原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)避免污染使用；EDTA (配制0.5mol/L的母液稀釋1000倍使用，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司)，原代細(xì)胞制備當(dāng)天和消化液同時(shí)使用，既起到促進(jìn)組織消化的功能，又能螯合媽、鎂等離子；消化液:膠原酶(Worthington)，原代制備當(dāng)天分離細(xì)支氣管上皮使用，胰酶(Gibico)用于原代細(xì)胞及初步永生化細(xì)胞培養(yǎng)消化；基礎(chǔ)培養(yǎng)基:D/F12 (Gibico);南美胎牛血清(Gibico);添加因子:30 μ g/mL BPE (牛垂體提取物，Sciencecell)，10ng/mL EGF(人上皮生長(zhǎng)因子，Sigma)，0.5 μ g/mL 氫化可的松(Sigma)，
5μ g/mL人胰島素(Sigma)，6.7ng/mL三碘-L-甲狀腺原氨酸(Sigma)，0.lng/ml維甲酸(Sigma)，10 μ g/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma)。
[0055]3.犬細(xì)支氣管組織的分離、原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
[0056]①犬細(xì)支氣管組織的分離
[0057](I)速眠新前肢靜脈麻醉幼齡比格犬后，四肢固定，酒精消毒待處理表皮組織后立即用一套手術(shù)器械(剪刀、鑷子各兩把，眼科剪、眼科鑷各一把)腹部切口放血。
[0058](2)手術(shù)剪自喉部至胸部最后一根肋骨部位縱向剪開皮膚，沿兩側(cè)肋骨橫向剪開皮膚，分離皮膚。
[0059](3)用另一套器械分離喉部肌肉，暴露氣管，用剪刀沿分離好的皮膚邊緣，去除肋骨，暴露胸腔。
[0060](4)縱向剪斷氣管，提起氣管，自上而下，分離氣管及肺組織，止血鉗夾緊氣管上端后剪斷氣管，將剩余氣管連接完整肺臟置于準(zhǔn)備好的高壓完的玻璃平皿儲(chǔ)存器中(見圖1)，放入超凈工作臺(tái)，待進(jìn)一步的細(xì)支氣管分離。
[0061](5)將獲取的肺組織用平頭鑷子分成單個(gè)肺葉后，使用顯微鑷及顯微剪去除氣管周圍的肺組織，注意勿用力撕扯，分離出來(lái)的細(xì)支氣管形態(tài)見圖2。
[0062]②犬原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
[0063](I)細(xì)支氣管組織的消化
[0064]將分離好的細(xì)支氣管洗凈，剪碎，約Imm3大小后加入稀釋1000倍的0.5mol/L的EDTA lmL，膠原酶ImL和0.25%胰酶lmL，37°C消化作用30min。
[0065](2)培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件
[0066]I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:D/F12培養(yǎng)基。
[0067]2)細(xì)胞培養(yǎng)液:初代細(xì)胞貼壁前D/F12+10%胎牛血清；貼壁后D/F12+2%胎牛血清+添加因子。
[0068]3)終止液:D/F12+10%血清。
[0069]4)胰酶:0.125%胰酶(用 D-Hanks 液配制)，調(diào) pH 至 7.5-8.0。
[0070](3)犬原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
[0071]I)初代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
[0072]上述組織消化30min后，加入終止液終止消化。200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，100rpm離心5min，棄上清，沉淀用D/F12+10%胎牛血清重懸后接種在4個(gè)6cm dish中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，次日貼壁后換液為D/F12+2%胎牛血清+添加因子，以使原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中混雜的極少量平滑肌細(xì)胞無(wú)法生存，避免平滑肌細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。初代細(xì)胞長(zhǎng)成后形態(tài)見圖3。
[0073]2)原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的傳代
[0074]初代細(xì)胞經(jīng)6天后，每個(gè)dish細(xì)胞生長(zhǎng)情況不一，將兩個(gè)長(zhǎng)滿80%的6cm dish細(xì)胞用于一傳二傳代，另兩個(gè)細(xì)胞較少的dish合并為一個(gè)dish。不可直接消化吹打傳代，需加800 μ L 0.125%胰酶消化后放入37°C培養(yǎng)箱，每Imin觀察一次細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞變圓，立即加入終止液，槍頭輕輕吹打后移入15ml離心管，100rpm離心后棄上清，沉淀用含2%胎牛血清和添加因子的細(xì)胞培養(yǎng)液一傳二至6cm dish中靜置培養(yǎng)。經(jīng)傳代后的第三代犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)見圖4。
[0075](4)原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的鑒定
[0076]由于從犬活體內(nèi)分離組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)不可避免會(huì)有一些其他組織的殘留，分離的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞里混有極少量的平滑肌細(xì)胞，通過(guò)降低血清濃度及添加上皮細(xì)胞添加因子的方法傳代使平滑肌細(xì)胞不能生存，為了進(jìn)一步地確定原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的純度，對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。
[0077]I)形態(tài)學(xué)鑒定
[0078]體外傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞由一個(gè)中心向外延伸突觸，呈柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)。胰酶消化后，細(xì)胞變圓成一個(gè)個(gè)單獨(dú)的小圓形。
[0079]2)間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定
[0080]1.間接免疫熒光試驗(yàn)所需試劑:
[0081]①抗體稀釋液:吸取2mL FBS溶于18mL PBS中，配成含有10% FBS的PBS，備用。
[0082]②PBST:吸取 50 μ L Tween-20 溶于 10mL ?85，配成0.05% Tween-20，備用。
[0083]③封閉液:1%BSA。
[0084]④通透液:吸取0.5mL Triton X-1OO 溶于 10mL PBS，配成 0.5% Triton X-100溶液。
[0085]⑤抗體:一抗為抗角蛋白18的單抗，用于對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。
[0086]I1.具體試驗(yàn)步驟:
[0087]傳至第三代的犬原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞板中。
[0088]①用PBS清洗生長(zhǎng)良好細(xì)支氣管上皮細(xì)胞3次，然后加入固定液(4%多聚甲醛)固定15min ；
[0089]②吸掉固定液用PBS清洗3次，然后加入封閉液(含I % BSA的PBS)封閉2h ；
[0090]③吸掉封閉液，PBST清洗3次，每次5min，按每孔加入10yL抗角蛋白18的單抗(稀釋500倍)，而后4°C過(guò)夜；
[0091]④吸出一抗，PBST (含I % Tween-20的PBS)漂洗3次，每次5min，每孔加入200 μ L的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(稀釋1000倍)，于37°C避光孵育Ih ；
[0092]⑤最后PBST清洗，加DAPI染色15min，緩沖甘油封片，鏡檢。
[0093]細(xì)支氣管上皮細(xì)胞間接免疫熒光雙染法鑒定見圖5，其中染成紅色的是細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，染成藍(lán)色的是細(xì)胞核(包括雜細(xì)胞的細(xì)胞核)，可見所獲原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的純度很高，達(dá)90%以上。
[0094]( 二)真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒pEGFP-hTERT的構(gòu)建
[0095]1.試驗(yàn)材料
[0096]重組質(zhì)粒PC1-neo-hTERT及空白質(zhì)粒pIRES2-EGFP，購(gòu)自B1vector中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心。
[0097]2.真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT的構(gòu)建
[0098]按照質(zhì)粒DNA小提中量純化試劑盒(Takara)步驟提取質(zhì)粒PC1-neo-hTERT，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定正確后用EcoR I和Sal I (Takara)雙酶切重組質(zhì)粒，利用小量膠回收試劑盒(Takara)純化回收3.5kb的片段，即為hTERT。
[0099]用EcoR I和Sal I (Takara)雙酶切熒光真核表達(dá)載體pIRES2_EGFP，酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，與hTERT按摩爾比4:1的比例加入目的片段和載體，然后加入IyL T4 DNA Ligase(Takara)，配制10 yL連接體系，混勻后于PCR儀16°C過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌