一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種快速篩選植物中紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，利用填充有不同表面的未活化的碳纖維和活性炭纖維的微型柱對紅豆杉萃取物進行預(yù)分離，采用不同的流動相洗脫，得到不同極性的紫杉醇類活性物質(zhì)，經(jīng)在線離子化過程，實現(xiàn)以巴卡亭III、10?脫乙?；涂ㄍII、紫杉醇、7–木糖基?10脫乙酰基紫杉醇、7–木糖基?紫杉醇、三尖杉寧堿及7?表?10?脫乙?；仙即紴榇淼淖仙即碱惢钚晕镔|(zhì)的篩選，整個篩選過程只需5min且篩選的檢出限達到25ng/g的水平，所述方法減少分析的物質(zhì)用量、降低背景干擾，提高檢測靈敏度，且具有篩選成分不同的多種類型天然物樣品的高通用性。
【專利說明】
一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類 活性物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種具有抗癌作用的二萜類化合物，因其 獨特的抗癌機理及其顯著療效而受重視;紫杉醇同類物質(zhì)由于具有一定的藥用作用并含有 紫杉醇的基本骨架能夠通過有效方法轉(zhuǎn)化成紫杉醇，而越來越受到關(guān)注。
[0003] 目前，分離檢測植物中紫杉醇類物質(zhì)常用方法的具體過程為:采用乙醇進行萃取， 經(jīng)水和二氯甲烷溶劑震蕩分層，之后蒸干二氯甲烷層，加入正己烷和甲醇震蕩，甲醇層濃縮 后進入檢測器檢測;或萃取后經(jīng)固相柱凈化，用大量溶劑洗脫，濃縮后進入高效液相分離檢 測器檢測。這些方法不能在短時間內(nèi)分離難以實現(xiàn)高通量篩選痕量紫杉醇類活性物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種快速、高效篩選植物中紫杉醇類活性物質(zhì)的方 法，使所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時間內(nèi)同時分析極性差異較大的各種紫杉醇類活性物質(zhì)。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，包括如下步 驟：
[0007] (1)將植物樣品經(jīng)有機溶劑超聲萃取，得到植物萃取液；
[0008] (2)將所述步驟（1)得到的植物萃取液先后經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性炭纖 維，得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料；
[0009] (3)采用第一流動相洗脫所述步驟(2)得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活 化的碳纖維材料和活性炭纖維材料，得到第一組分洗脫液，將所述第一組分洗脫液在線進 行離子化，篩選得到第一紫杉醇前體物，所述第一紫杉醇前體物包括巴卡亭III和10-脫乙 ?；涂ㄍII;
[0010] 所述第一流動相包括體積終濃度為〇. 05~0.2 %的甲酸溶液與體積終濃度為8~ 12%的甲醇溶液；
[0011] (4)采用第二流動相洗脫所述步驟(3)得到活性炭纖維材料，得到第二組分洗脫 液，對所述第二組分洗脫液進行離子化，得到第二紫杉醇前體物，所述第二紫杉醇前體物包 括紫杉醇、7-木糖基-10脫乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿和7-表-10-脫乙酰 基紫杉醇；
[0012] 所述第二流動相包括體積終濃度為0.05~0.2 %的甲酸溶液與體積濃度為55~ 70%的甲醇終溶液。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟(1)中有機溶劑為甲醇；
[0014] 所述甲醇的體積濃度為99.9%。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中超聲萃取的溫度為18~25°C，所述超聲萃取的時間15min/ 次，萃取3次，每次間隔時間為5~1 Omin。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中超聲萃取后還包括:將所述萃取得到的物料經(jīng)過濾膜過 濾；
[0017] 所述濾膜的孔徑為 〇 · 22μηι、0 · 45μηι或 0 · 6μηι。
[0018] 優(yōu)選的，所述濾膜的孔徑為0·45μπι。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟⑶中第一流動相的流速為1.5~3.5mL/h;
[0020] 所述步驟(4)中第二流動相的流速為1.5~3.5mL/h。
[0021 ]優(yōu)選的，所述步驟(3)中第一流動相的流速為2.5mL/h;
[0022] 所述步驟(4)中第二流動相的流速為2.5mL/h。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟(3)中第一流動相的流速為2.5mL/h。
[0024] 優(yōu)選的，所述第一流動相包括體積終濃度為0.01 %的甲酸溶液與體積終濃度為 10%的甲醇溶液。
[0025] 優(yōu)選的，第二流動相包括體積終濃度為0.01 %的甲酸溶液與體積濃度為60%的甲 醇終溶液。
[0026] 本發(fā)明提供了一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，以未活化的碳 纖維材料和活性炭纖維材料依次對紫杉醇類活性物質(zhì)進行吸附，未活化的碳纖維材料通過 作用力、范德華力和疏水相互作用力等非共價作用力與色素、脂類等干擾物結(jié)合，去除 雜質(zhì);活性炭纖維材料，表面粗糙，具有許多含氧的官能團，增強了碳纖維的親水性，活性炭 纖維材料可以與極性較強的紫杉醇類物質(zhì)結(jié)合，同時極性最強的紫杉醇前體物與兩種炭纖 維的作用力均很弱，被第一流動相快速洗脫，經(jīng)過電噴霧離子源離子化，進入三重四級桿質(zhì) 譜分析檢測。組分分離與串聯(lián)質(zhì)譜離子化過程結(jié)合從各種植物中篩選多種紫杉醇類物質(zhì)， 能有效提高目標(biāo)物離子化效率，并減少同時分析的物質(zhì)降低背景干擾，提高檢測靈敏度，整 個篩選時間只需5min，且篩選的檢出限達到25ng/g的水平;且本發(fā)明提供的篩選方法快速， 操作簡便，對于不同種類植物樣品通用性好，消耗原料和有機溶劑量少且更經(jīng)濟環(huán)保。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實施例中篩選裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]圖2為本發(fā)明實施例1-3中對紅豆杉的紫杉醇類物質(zhì)分離檢測全掃描模式總離子 色譜圖；
[0029]圖3為本發(fā)明實施例1-3中對紅豆杉的紫杉醇類物質(zhì)分離檢測MRM模式總離子色譜 圖；
[0030] 圖4為本發(fā)明實施例1-3中對紅豆杉的紫杉醇類物質(zhì)分離檢測7種目標(biāo)物質(zhì)MRM色 譜圖；
[0031] 圖5為本發(fā)明實施例1-3中對紅豆杉的紫杉醇類物質(zhì)分離檢測7種目標(biāo)物質(zhì)MRM質(zhì) 譜圖。
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明提供了一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，包括如下步 驟：
[0033] (1)將植物樣品經(jīng)有機溶劑超聲萃取，得到植物萃取液；
[0034] (2)將所述步驟（1)得到的植物萃取液分別經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性炭纖 維材料，得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料； [0035] (3)采用第一流動相洗脫所述步驟(2)得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活 化的碳纖維材料和活性炭纖維材料，得到第一組分洗脫液和經(jīng)第一組分洗脫后的未活化的 碳纖維材料和活性炭纖維材料，將所述第一組分洗脫液在線進行離子化，篩選得到第一紫 杉醇前體物，所述第一紫杉醇前體物包括巴卡亭III和10-脫乙?；涂ㄍII;
[0036] 所述第一流動相由體積終濃度為0.05~0.2%的甲酸溶液與體積終濃度為8~ 12%的甲醇溶液組成；
[0037] (4)采用第二流動相洗脫所述步驟(3)得到第一次洗脫后的活性炭纖維材料，得到 第二組分洗脫液，對所述第二組分洗脫液進行離子化，得到第二紫杉醇前體物，所述第二紫 杉醇前體物包括紫杉醇、7-木糖基-10脫乙?；仙即?、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿和7-表兌乙?；仙即?；
[0038] 所述第二流動相由體積終濃度0.05~0.2%的甲酸溶液與體積濃度為55~70%的 甲醇終溶液組成。
[0039] 本發(fā)明提供了一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，利用未活化的 碳纖維材料和活化的炭纖維材料進行分離，減少分析的物質(zhì)降低背景干擾，提高檢測靈敏 度，整個篩選過程只需5min且篩選的檢出限達到25ng/g的水平。
[0040] 本發(fā)明將植物樣品經(jīng)有機溶劑超聲萃取，得到植物萃取液。
[0041] 在本發(fā)明中，所述植物樣品的種類優(yōu)選為喬木、草本植物及食用菌類。在本發(fā)明中 采用紅豆杉、牽牛和平菇為分析樣品，所述植物樣品的部位優(yōu)選為針葉。本發(fā)明對所述紅豆 杉的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的紅豆杉的來源即可。所述植物樣品 無需前處理過程。
[0042]在本發(fā)明中，所述超聲萃取的溫度優(yōu)選為室溫，更優(yōu)選為20°C;所述超聲萃取的時 間優(yōu)選為10~20min，更優(yōu)選為15min。
[0043] 本發(fā)明中，所述超聲萃取的間隔時間優(yōu)選為5~lOmin，更優(yōu)選為7min。
[0044] 本發(fā)明對所述超聲萃取的頻率沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)超聲萃取 頻率即可。
[0045] 在本發(fā)明中，所述超聲萃取所用的有機溶劑優(yōu)選為甲醇、氯仿、乙腈，所述有機溶 劑的體積濃度優(yōu)選>99.9%。所述甲醇的體積濃度優(yōu)選為大于98%，更優(yōu)選為甲醇濃度 99.9%〇
[0046]在本發(fā)明中，所述植物樣品與萃取溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選為1 g: 5mL~1 g: 15mL，更 優(yōu)選為lg:l〇mL。
[0047] 在本發(fā)明中，所述超聲萃取后優(yōu)選還包括:將所述萃取得到的物料經(jīng)過濾膜過濾。 所述濾膜的孔徑優(yōu)選為〇. 22、0.45或0.6μηι，更優(yōu)選為0.45μηι。
[0048] 得到植物萃取液，本發(fā)明使所述植物萃取液先后經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性 炭纖維材料，得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材 料。
[0049] 附圖1為本發(fā)明植物萃取液篩選所用裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，1、第一流動相試劑瓶;2、 第二流動相試劑瓶;3、第三流動相試劑瓶;4、栗1; 5、栗2; 6、栗3; 7、控制器;8、進樣閥；9、閥 1; 10、閥2; 11、填充有未活化的碳纖維材料微型柱；12、閥3; 13、填充有活性炭纖維的微型 柱;14、閥4; 15、廢液筒;16、質(zhì)譜儀；
[0050] 附圖1展示了A、B、C、D 4種不同進樣狀態(tài)的情況：
[0051] A狀態(tài)為第一流動相對填充有未活化的碳纖維材料微型柱和填充有活性炭纖維的 微型柱潤洗的過程，第一流動相進入裝置內(nèi)，在控制器7的作用下，設(shè)置一定流速，其中將閥 1和閥4斷開，閥2和閥3閉合，使第一流動相先后通過填充有未活化的碳纖維材料的微型柱 11和填充有活性炭纖維的微型柱13,用廢液筒15收集排出的廢液，達到潤洗未活化的碳纖 維材料的微型柱11和填充有活性炭纖維的微型柱13的目的；
[0052] B狀態(tài)為紫杉醇前體物I的洗脫過程，植物萃取液樣品均由進樣閥8手動進樣進入 裝置內(nèi)，在控制器7的作用下，設(shè)置一定流速，其中將閥1和閥4斷開，閥2和閥3閉合，使第一 流動相先后通過填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11和填充有活性炭纖維的微型柱13， 得到的第一組分洗脫液在線進行離子化得到紫杉醇前體物I質(zhì)譜圖，填充有未活化的碳纖 維材料的微型柱11結(jié)合弱極性雜質(zhì)，填充有活性炭纖維的微型柱13結(jié)合上第二紫杉醇前體 物；
[0053] C狀態(tài)為第二紫杉醇前體物的洗脫過程，第二流動相在控制器7的作用下到達進樣 閥8,設(shè)置一定流速，其中將閥2和閥4斷開，閥1和閥3閉合，使第二流動相僅通過填充有活性 炭纖維的微型柱13,使結(jié)合在填充有活性炭纖維的微型柱13的第二紫杉醇前體物洗脫下 來，得到的第二組分洗脫液在線進行離子化得到第二紫杉醇前體物質(zhì)譜圖；
[0054] D狀態(tài)為弱極性雜質(zhì)的洗脫過程，第三流動相在進樣閥8的作用下進入裝置中，在 控制器7設(shè)置一定流速，將閥2和閥4閉合，閥1和閥3斷開，使第三流動相僅通過填充有未活 化的碳纖維材料的微型柱11，使結(jié)合在填充有未活化的碳纖維材料的微型柱11上的弱極性 雜質(zhì)洗脫下來，得到的第三組分洗脫液在線進行離子化得到弱極性雜質(zhì)質(zhì)譜圖。
[0055] 在本發(fā)明中，所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的表面是不同的。所述未活 化的碳纖維材料表面未經(jīng)過修飾，所述活性炭纖維的表面為是經(jīng)表面修飾氧元素。本發(fā)明 中對所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟 知的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維的來源即可。在本發(fā)明實施例中，所述未活化的碳 纖維材料和活性炭纖維是商業(yè)化產(chǎn)品。
[0056] 所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料優(yōu)選作為填充材料填充到微型柱中， 將植物萃取液依次通過填充有未活化的碳纖維材料的微型填充柱和填充有活性炭纖維材 料的微型填充柱。所述微型柱的長度優(yōu)選為5cm，所述微型柱的內(nèi)經(jīng)優(yōu)選為0.75_。
[0057]在本發(fā)明中，所述填充碳纖維材料的填充度優(yōu)選為6000~8000根，更優(yōu)選為7000 根;所述填充活性炭纖維材料的填充度優(yōu)選為3000~4000根，更優(yōu)選為3500根）。
[0058] 得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料后， 本發(fā)明用第一流動相先后對所述未活化的碳纖維材料和進行第一次洗脫，得到第一組分洗 脫液和經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料。
[0059] 在本發(fā)明中，所述第一流動相優(yōu)選采用注射栗導(dǎo)入。所述的注射栗為多通道單獨 調(diào)控的低壓注射栗，在低壓下實現(xiàn)高效分析。
[0060]在本發(fā)明中，所述第一流動相優(yōu)選包括體積終濃度為0.1 %的甲酸溶液和體積終 濃度為10 %的甲醇溶液。
[0061 ]在本發(fā)明中，所述第一流動相的流速優(yōu)選為1.5~3.5mL/h，更優(yōu)選為2.5mL/h。 [0062] 在本發(fā)明中，所述第一次洗脫時間優(yōu)選為0.5~1.5min，更優(yōu)選為lmin。
[0063] 得到第一組分洗脫液后，本發(fā)明優(yōu)選將所述第一組分洗脫液導(dǎo)入串聯(lián)質(zhì)譜中，完 成離子化過程，得到紫杉醇前體物I。
[0064] 在本發(fā)明中，所述離子化過程的條件優(yōu)選滿足如下條件：
[0065] 離子源條件:ESI離子源正離子MRM模式檢測，毛細管電壓優(yōu)選為3500~4500V，更 優(yōu)選為4000V，干燥氣流速優(yōu)選為8~14L/min，更優(yōu)選為llL/min，噴霧器電壓優(yōu)選為10~ 25psi;更優(yōu)選為15psi，干燥氣溫度優(yōu)選為250~320°C，更優(yōu)選為300°C;
[0066] 質(zhì)譜檢測條件：各目標(biāo)物母離子及相應(yīng)子離子如表所示，F(xiàn)ragmented為毛細管出 口電壓(單位:V)，CE為碰撞能(單位:eV)，Delta為掃描頻率
[0067] 表1目標(biāo)物質(zhì)離子化條件及MRM模式檢測參數(shù)
[0068]
[0069]本發(fā)明中，所述紫杉醇前體物I主要成分包括巴卡亭III和10-脫乙?；涂ㄍ?III。所述巴卡亭III和10-脫乙酰基巴卡亭III為強極性紫杉醇前體物。
[0070] 得到經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料后，本發(fā)明用第二 流動相對經(jīng)第一次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料進行第二次洗脫，得到 第二組分洗脫液和第二次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料。
[0071] 在本發(fā)明中，所述第二流動相優(yōu)選采用注射栗導(dǎo)入。所述的注射栗為多通道單獨 調(diào)控的低壓注射栗，在低壓下實現(xiàn)高效分析。
[0072] 在本發(fā)明中，所述第二流動相優(yōu)選包括體積濃度0.1 %的甲酸溶液和體積濃度為 55~60%的甲醇溶液。
[0073]在本發(fā)明中，所述第二流動相的流速優(yōu)選為1.5~3.5mL/h，更優(yōu)選為2.5mL/h。
[0074]得到第二組分洗脫液，本發(fā)明將所述第二組分洗脫液作為離子化試劑進入串聯(lián)質(zhì) 譜完成離子化過程，得到紫杉醇系列物Π 。在本發(fā)明中，所述紫杉醇系列物Π 的主要成分包 括紫杉醇、7-木糖基-10脫乙?；仙即肌?-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿和7-表-10-脫乙酰 基紫杉醇。所述的紫杉醇、7-木糖基-10脫乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿和 7-表-10-脫乙?；仙即紴橹械葮O性的紫杉醇提取物。
[0075] 在本發(fā)明中，所述未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用優(yōu)選在 常壓下實現(xiàn)在線聯(lián)用，操作環(huán)境安全。
[0076] 得到第二次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料，本發(fā)明優(yōu)選還包 括:將第三流動相通過第二次洗脫后的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料，去除結(jié)合 在未活化的碳纖維材料上的弱極性雜質(zhì)，同時沖洗、平衡纖維材料，以便下次循環(huán)篩選時使 用。
[0077] 在本發(fā)明中，所述第三流動相優(yōu)選包括體積濃度為0.05~0.2%甲醇溶液，更優(yōu)選 為0.1%的甲醇溶液。所述第三流動相的洗脫時間優(yōu)選為2~3min，更優(yōu)選為2min。
[0078] 在本發(fā)明中，所述第三流動相的流速為4.0~5.5mL/h，更優(yōu)選為5. OmL/h。
[0079] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種快速篩選植物中紫杉醇類活性物質(zhì)的方法 進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0080] 實施例1
[0081] 稱取紅豆杉針葉樣品0.25g，經(jīng)甲醇超聲萃取，萃取液過0.45μπι濾膜后，直接由微 量注射器注入到進樣器內(nèi)，搬動進樣器閥門，完成進樣；斷開閥門1和閥門2，調(diào)節(jié)注射栗控 制器令栗1推動第一流動相，流速為2.5mL/h，樣品在第一流動相的帶動下進入到由未活化 的碳纖維微型柱和活化的炭纖維微型柱，紅豆杉針葉甲醇萃取液中不同極性的組分與兩個 微型柱的作用機理不同，分別被選擇性地保留在不同的微型柱上；（3)第一流動相洗脫后， 得到第一組分洗脫液，并在線進入串聯(lián)質(zhì)譜完成離子化過程，實現(xiàn)強極性紫杉醇前體物的 篩選；（4)關(guān)閉閥門1、斷開閥門2并調(diào)節(jié)注射栗令栗2推動第二流動相洗脫活化的炭纖維微 型柱，流速為2.5mL/h進行洗脫得到第二組分洗脫液，將得到的第二組分洗脫液作為離子化 試劑進入串聯(lián)質(zhì)譜完成離子化過程，實現(xiàn)中等極性紫杉醇活性物質(zhì)的篩選；（5)斷開閥門1、 關(guān)閉閥門2并調(diào)節(jié)注射栗令栗3推動第三流動相，流速調(diào)節(jié)至5. OmL/h，調(diào)節(jié)MS/MS檢測器狀 態(tài)為waste，進行去除弱極性脂質(zhì)色素等雜質(zhì)，并完成沖洗、平衡微型柱過程，以便下次循環(huán) 篩選時使用。
[0082] 實施例2
[0083]稱取平菇樣品0.25g，經(jīng)甲醇超聲萃取，萃取液過0.22μπι濾膜后，直接由微量注射 器注入到進樣器內(nèi)，搬動進樣器閥門，完成進樣;斷開閥門1和閥門2,調(diào)節(jié)注射栗控制器令 栗1推動第一流動相，流速為1.5mL/h，樣品在第一流動相的帶動下進入到由未活化的碳纖 維微型柱和活化的炭纖維微型柱，平菇甲醇萃取液中不同極性的組分與兩個微型柱的作用 機理不同，分別被選擇性地保留在不同的微型柱上；（3)第一組分洗脫液在線進入串聯(lián)質(zhì)譜 完成離子化過程，實現(xiàn)強極性紫杉醇前體物的篩選；（4)關(guān)閉閥門1、斷開閥門2并調(diào)節(jié)注射 栗令栗2推動第二流動相洗脫活化的炭纖維微型柱，流速為3.5mL/h進行洗脫，得到第二組 分洗脫液，將得到的第二組分洗脫液作為離子化試劑進入串聯(lián)質(zhì)譜完成離子化過程，實現(xiàn) 中等極性紫杉醇活性物質(zhì)的篩選；（5)斷開閥門1、關(guān)閉閥門2并調(diào)節(jié)注射栗令栗3推動第三 流動相，流速調(diào)節(jié)至4. OmL/h，調(diào)節(jié)MS/MS檢測器狀態(tài)為waste，進行去除弱極性脂質(zhì)色素等 雜質(zhì)，并完成沖洗、平衡微型柱過程，以便下次循環(huán)篩選時使用。
[0084] 實施例3
[0085] 稱取牽牛樣品0.25g，經(jīng)甲醇超聲萃取，萃取液過0.65μπι濾膜后，直接由微量注射 器注入到進樣器內(nèi)，搬動進樣器閥門，完成進樣;斷開閥門1和閥門2,調(diào)節(jié)注射栗控制器令 栗1推動第一流動相，流速為3.5mL/h，樣品在第一流動相的帶動下進入到由未活化的碳纖 維微型柱和活化的炭纖維微型柱，牽牛甲醇萃取液中不同極性的組分與兩個微型柱的作用 機理不同，分別被選擇性地保留在不同的微型柱上；（3)第一流動相第一組分洗脫液并在線 進入串聯(lián)質(zhì)譜完成離子化過程，實現(xiàn)強極性紫杉醇前體物的篩選；（4)關(guān)閉閥門1、斷開閥門 2并調(diào)節(jié)注射栗令栗2推動第二流動相洗脫活化的炭纖維微型柱，流速為1.5mL/h進行洗脫 得到第二組分洗脫液，將得到的第二組分洗脫液作為離子化試劑進入串聯(lián)質(zhì)譜完成離子化 過程，實現(xiàn)中等極性紫杉醇活性物質(zhì)的篩選；（5)斷開閥門1、關(guān)閉閥門2并調(diào)節(jié)注射栗令栗3 推動第三流動相，流速調(diào)節(jié)至5.5mL/h，調(diào)節(jié)MS/MS檢測器狀態(tài)為waste，進行去除弱極性脂 質(zhì)色素等雜質(zhì)，并完成沖洗、平衡微型柱過程，以便下次循環(huán)篩選時使用。
[0086] 將實施例1-3分離得到的強極性紫杉醇前體物經(jīng)檢測，其活性物質(zhì)種類為巴卡亭 III和10-脫乙?；涂ㄍII，將實施例1-3分離得到的中極性紫杉醇系列物經(jīng)檢測，其活 性物質(zhì)種類為紫杉醇、7-木糖基-10脫乙?；仙即?、7-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿及7-表-10-脫乙?；仙即?種。為了驗證該結(jié)果是否準(zhǔn)確，采用全掃描模式對方案的整個過程 進行檢測，其中流動相3洗脫，得到的洗脫液結(jié)果如圖2所示，5-8min所檢出的物質(zhì)為弱極性 脂質(zhì)色素等雜質(zhì)，篩選結(jié)果如圖3至圖5所示，7種紫杉醇類物質(zhì)均能被很好的檢出，檢出限 達到25ng/g的水平。
[0087] 由以上實施例可知，本發(fā)明提供的一種快速篩選植物中紫杉醇類活性物質(zhì)的方 法，利用不同表面的未活化的纖維微型柱和活化炭纖維微型柱對紅豆杉萃取物進行分離， 采用不同的流動相洗脫，得到不同極性的紫杉醇類活性物質(zhì)，經(jīng)在線離子化過程，實現(xiàn)巴卡 亭III、10-脫乙?；涂ㄍII、紫杉醇、7-木糖基-10脫乙酰基紫杉醇、7-木糖基-紫杉醇、 三尖杉寧堿及7-表-10-脫乙?；仙即?類不同紫杉醇活性物質(zhì)的篩選，整個篩選時間只 需5min且篩選的檢出限達到能25ng/g的水平，所述方法減少分析的物質(zhì)降低背景干擾，提 高檢測靈敏度。
[0088] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種快速篩選植物中痕量紫杉醇類活性物質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將植物樣品經(jīng)有機溶劑超聲萃取，得到植物萃取液； (2) 將所述步驟（1)得到的植物萃取液先后經(jīng)過未活化的碳纖維材料和活性炭纖維，得 到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的碳纖維材料和活性炭纖維材料； (3) 采用第一流動相洗脫所述步驟(2)得到吸附有植物紫杉醇類活性物質(zhì)的未活化的 碳纖維材料和活性炭纖維材料，得到第一組分洗脫液，將所述第一組分洗脫液在線進行離 子化，篩選得到第一紫杉醇前體物，所述第一紫杉醇前體物包括巴卡亭III和10-脫乙?；?巴卡亭III; 所述第一流動相包括體積終濃度為〇. 05~0.2 %的甲酸溶液與體積終濃度為8~12 % 的甲醇溶液； (4) 采用第二流動相洗脫所述步驟(3)得到活性炭纖維材料，得到第二組分洗脫液，對 所述第二組分洗脫液進行離子化，得到第二紫杉醇前體物，所述第二紫杉醇前體物包括紫 杉醇、7-木糖基-10脫乙?；仙即肌?-木糖基-紫杉醇、三尖杉寧堿和7-表-10-脫乙?；?杉醇； 所述第二流動相包括體積終濃度為〇. 05~0.2%的甲酸溶液與體積濃度為55~70%的 甲醇終溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中有機溶劑為甲醇； 所述甲醇的體積濃度為99.9 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中超聲萃取的溫度為18~ 25°C，所述超聲萃取的時間15min/次，萃取3次，每次間隔時間為5~1 Omin。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中超聲萃取后還包括:將 所述萃取得到的物料經(jīng)過濾膜過濾； 所述濾膜的孔徑為〇. 22μπι、0.45μπι或0.6μπι。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述濾膜的孔徑為0.45μπι。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中第一流動相的流速為1.5~ 3.5mL/h； 所述步驟(4)中第二流動相的流速為1.5~3.5mL/h。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中第一流動相的流速為 2·5mL/h〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中第二流動相的流速為 2·5mL/h〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一流動相包括體積終濃度為0.01 % 的甲酸溶液與體積終濃度為10 %的甲醇溶液。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于，第二流動相包括體積終濃度為0.01 % 的甲酸溶液與體積濃度為60 %的甲醇終溶液。
【文檔編號】C07D305/14GK106008407SQ201610423808
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】李東浩, 馬標(biāo), 鄒依霖
【申請人】延邊大學(xué)