脂質(zhì)滅菌方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種磷脂懸浮液的滅菌方法，可用于制備包括磷脂穩(wěn)定化的全氟丁烷 微泡的超聲造影劑前體。該方法提供了無菌保證，未將磷脂過度熱降解。該方法也適用于 工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。還提供了制備結(jié)合本發(fā)明的滅菌方法的試劑盒和超聲造影劑的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 基于全氟化碳（例如全氟丙烷或全氟丁烷）的磷脂穩(wěn)定化微泡的超聲造影 劑，在本領(lǐng)域中是公知的[參見例如Wheatley等J.DrugDel.Sci.Technol.，23 (1)， 57-72(2013)]〇
[0004] WO97/11683公開了磷脂經(jīng)歷水解，并解決了對于在高壓滅菌期間穩(wěn)定這樣的細 合物的需求（第6頁第1整段）。W0 97/11683教導(dǎo)了使用pH小于或等于9. 5的穩(wěn)定緩沖 液，以試圖阻止磷脂在高壓滅菌過程中降解。
[0005] W0 97/29782教導(dǎo)了在冷凍干燥穩(wěn)定劑的存在下，可以通過凍干全氟化碳微泡制 備在室溫下穩(wěn)定的超聲造影劑前體，所述冷凍干燥穩(wěn)定劑選自：蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉子 糖或水蘇糖，優(yōu)選蔗糖。W0 97/29782還教導(dǎo)了在熱滅菌過程中可以減少用于穩(wěn)定這種造影 劑的磷脂酰絲氨酸磷脂的含量。
[0006] W0 99/08715公開了一種包含含氣囊泡的水分散體的藥物組合物的制備方法，其 中膜包含兩親性成膜材料，所述方法包括：
[0007] (i)由包含兩親性成膜材料的混合物生成含氣囊泡的分散液；
[0008] (ii)凍干含所述含氣囊泡的分散液；
[0009] (iii)用無菌含水液體重構(gòu)步驟（ii)的凍干產(chǎn)物，以產(chǎn)生含氣囊泡的水分散體； 和
[0010] (iv)處理步驟⑴或步驟（iii)的水分散體產(chǎn)物或步驟（ii)的凍干產(chǎn)物，以產(chǎn)生 基本上無聚集無菌的含氣囊泡的水分散體。
[0011] EP1228770A1教導(dǎo)了一種制備包含氣體微泡的凍干超聲造影劑的方法，其中凍干 前體小瓶在減壓的頂部空間氣體下密封。所述減壓被認為有助于控制前體小瓶的重構(gòu)后形 成的水性微泡組合物的粒徑。
[0012] Feshitan等人[J.Coll.Interf.Sci.，329,316_324( 2009)]報道，與表面活性劑 包覆的微泡相比，脂質(zhì)包覆的微泡在離心之后是穩(wěn)定的，且該脂質(zhì)外殼是高粘性的，并且相 對不透氣。Feshitan等人報道了尺寸范圍4-5微米的全氟丁烷微泡可以穩(wěn)定至少2天，但 在2周后就趨于碎裂成更小尺寸的微泡t
[0013] 對于摻有磷脂的試劑的超聲凍干前體制備方法仍存在需要，其對產(chǎn)品的無菌性進 行控制。這種磷脂的滅菌方法需要經(jīng)得起工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的檢驗，并且以滿足規(guī)范要求（例 如美國藥典和ICH指南）的均勻小瓶含量和安全特性產(chǎn)生前體產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]預(yù)期用于哺乳動物腸胃外給藥的磷脂穩(wěn)定化氣體微泡超聲造影劑需要以無菌形 式制備。終端滅菌對于這種造影劑不是一種合適的技術(shù)，因此需要無菌形式的磷脂懸浮液 以允許無菌生產(chǎn)。工業(yè)規(guī)模的造影劑生產(chǎn)要求必須將大的體積（多升）滅菌。
[0015] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，氫化卵磷脂酰絲氨酸中磷脂的熱降解可以在高壓滅菌時發(fā)生。因 此，磷脂是熱敏的，并且可以在高溫下長時間加熱時降解。此外，如果在嘗試滅菌過程中發(fā) 生過多降解，所需的氣體微泡的超聲特性可受到損害。因而，在實現(xiàn)徹底滅菌而不使磷脂過 度熱降解中存在問題。
[0016] 這一問題在多升規(guī)模上加重，因為更大的體積使得更難確保在整個體系中的均勻 熱分布一一具有任何局部過熱或長時間暴露將導(dǎo)致發(fā)生更高水平的磷脂降解的風險。
[0017] 在通常在夾套式鋼制容器中進行的標準高壓滅菌過程中，通過使熱媒（通常是蒸 汽）通過容器外面的夾套，將熱量傳遞到主體材料，所述夾套與滅菌系統(tǒng)的內(nèi)部隔離。因 此，這種系統(tǒng)利用顯熱來傳遞獲得可接受的滅菌所需的能量。然而，在這種情況下，滅菌系 統(tǒng)的端點例如進口、用于排氣的無菌過濾器和容器頂蓋，在比更接近熱源的材料主體在較 晚的時間點接收熱量。封閉系統(tǒng)的所有部件必須被滅菌，并且在端點的無菌屏障到達可接 受的最低水平之前，這通常導(dǎo)致材料主體非常高的熱負荷（和F。值）。
[0018] 因此，利用標準的加熱方案，總的熱負荷和因此磷脂的化學降解可變得難以承受 地高。因此，需要快速且均勻地加熱/冷卻整個滅菌系統(tǒng)（即包含于無菌屏障之間容積）。
[0019] 本發(fā)明提供了這一問題的解決方法。本發(fā)明的方法包括將蒸汽注入到磷脂懸浮液 本身中和/或所述懸浮液上方的頂部空間中。利用潛熱（蒸汽加熱）進行熱傳遞比來自例 如外部夾套的顯熱更有效的多，因為更高量的能量在更短的時間段內(nèi)釋放。此外，蒸汽注入 頂部空間特別使得能夠快速加熱端點，例如進口、無菌過濾器和容器頂蓋，因此減小了主體 材料上的總熱負荷。使用頂部空間蒸汽加熱提供以下優(yōu)點：
[0020]
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 第一方面，本發(fā)明提供了一種磷脂懸浮液的滅菌方法，其包括：
[0023] (i)在夾套式容器中將所述磷脂與丙二醇一起在水性生物相容性載體中混合，以 得到水性磷脂懸浮液；和
[0024] (ii)將來自步驟（i)的水性磷脂懸浮液高壓滅菌，其中所述高壓滅菌能夠使滅菌 系統(tǒng)的所有部分的F。值達到大于15,并且其中除了來自加熱所述容器夾套的顯熱之外，加 熱還包括將蒸汽加入至：
[0025] (a)步驟⑴的容器的頂部空間；或
[0026] (b)步驟⑴的水性磷脂懸浮液；或
[0027] (c) (a)和（b)的組合；
[0028] (iii)冷卻來自步驟（ii)的熱懸浮液至15_30°C以得到無菌磷脂懸浮液；
[0029] 其中所述磷脂為氫化卵磷脂酰絲氨酸（Η-EPS)。
[0030] 術(shù)語"滅菌"具有其常規(guī)含義，并且是指消滅微生物以獲得無菌、無熱原的組合物 的過程。術(shù)語"高壓滅菌"具有其常規(guī)含義，并且是指使用過熱蒸汽滅菌的一種特定的滅 菌方法。高壓滅菌和其它滅菌方法描述于《在醫(yī)學和藥物產(chǎn)品中實現(xiàn)無菌》（Achieving SterilityinMedicalandPharmaceuticalProducts)中，N.HAlls(CRC出版，1994)。
[0031] 術(shù)語"滅菌系統(tǒng)"是指高壓滅菌裝置主體的滅菌屏障（即進口和出口）內(nèi)包含的 容積。
[0032] 保證滅菌通常通過術(shù)語F。描述，定義為"與121°C下通過滅菌過程傳遞給產(chǎn)物的相 等的時間量，以分鐘計"（FDA"提議的規(guī)則"6月1日，1976(b)，212. 3部）。在高壓滅菌周 期中，F(xiàn)。值被計算為：
[0033] F〇=ΔtΣ10(TTb)/Z
[0034] 其中：
[0035] At是測量間隔，
[0036]T是加熱溫度（傳感器測得的溫度），
[0037] Tb是121. 1°C(蒸汽巴氏殺菌的規(guī)定溫度），和
[0038] Z是對數(shù)滅菌能力變化的溫度常數(shù)，通常設(shè)定為10°C。
[0039] 在高壓滅菌周期中，甚至在低溫下，F(xiàn)。將因此隨時間增加，但增加速率非常依賴于 溫度。根據(jù)美國藥典/歐洲藥典，作為無菌保證的可接受的F。的最小要求為F。〉15。
[0040] 術(shù)語"頂部空間"具有其常規(guī)含義，并且指的是容器內(nèi)部和在容器液體和/或固體 內(nèi)容物（在本情況下為水性磷脂懸浮液）上方的氣相。
[0041 ] 術(shù)語"水性磷脂懸浮液"是指磷脂在水性溶劑中的懸浮液，所述水性溶劑包括水和 /或水混溶劑。水性溶劑是合適的生物相容性載體。術(shù)語"生物相容性載體"是指一種流體， 特別是液體，使得該組合物是生理上可以耐受的，即可被給予到哺乳動物身體上，沒有毒性 或過度的不適感。生物相容性載體合適地是注射載液，例如無菌、無熱原的注射用水；水溶 液如鹽水（其可以有利地被平衡，使得用于注射的終產(chǎn)物是等滲的）；包含生物相容緩沖劑 的水性緩沖溶液（例如磷酸鹽緩沖液）；一種或多種張力調(diào)節(jié)物質(zhì)（例如血漿陽離子與生 物相容性抗衡離子的鹽）、糖（例如葡萄糖或蔗糖）、糖醇（例如山梨糖醇或甘露糖醇）、二 醇（例如甘油）或其它非離子多元醇材料（例如聚乙二醇、丙二醇等）的水溶液。優(yōu)選生 物相容性載體是無熱原的注射用水（WFI)、等滲鹽水和磷酸鹽緩沖液。因此水性懸浮液適宜 地不包括與水不混溶的有機溶劑。
[0042] 貫穿于本申請，術(shù)語"包含"或"包括"具有其常規(guī)含義并且意味著該試劑或組合 物必須具有列出的必要特征或組分，但其它的特征或組分可另外存在。術(shù)語"包含"包括作 為優(yōu)選的子集的"基本上由...組成"，其表示該組合物具有列出的組分，而沒有其它特征 或組分存在。
[0043] 優(yōu)選的實施方案
[0044] 在第一個方面的方法中，優(yōu)選向步驟（i)的容器的頂部空間添加蒸汽。因此，雖然 蒸汽直接注入到液體懸浮液中是可能的，但加入頂部空間賦予了更加可控的加熱效應(yīng)一一 因為注入到液體可以導(dǎo)致局部的顯著降解。
[0045] 優(yōu)選實施第一方面的方法以使達到的F。值為至少15且不大于25。因此，本發(fā)明 者已經(jīng)確定，更長的高壓滅菌加熱時間（其中F。達到30)導(dǎo)致磷脂的過度降解。這進而對 由此制得的PFB微泡的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。
[0046] 磷脂酰絲氨酸的熱降解被認為以方案1所示發(fā)生：
[0047] 方案 1
[0048]
[0049] 其中：
[0050] PS=磷脂酰絲氨酸；
[0051] PA=磷脂酸；
[0052] S=絲氨酸；
[0053] FFA=游離脂肪酸；
[0054]LA=溶解-PA;
[0055]LS=溶解-PS。
[0056] 主要反應(yīng)是PS水解為PA和S，如方案2所示：
[0057] 方案 2
[0059] 其中每個R=n-C16鏈。
[0060] 不希望受理論的限制，相信降解的增加意味著PA的水平增加，PA是一種酸。這比 PS(母