測(cè)量在通過(guò)SEC實(shí)驗(yàn)測(cè)定的鋅/六聚體窗口內(nèi)制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定 性。另外為測(cè)試氯化鈉的存在是否影響化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性。
[0174] 制劑 制劑包含:3.6 mM的化合物1、25 mM苯酚、25 mM甲酚pH 7.4。鋅和氯化鈉如下指示。
[0175] 表8 化合物1的包含鋅的制劑
制劑如下制備： 以制劑中最終濃度的大約2倍量，將化合物1粉末溶于mi 11 i -Q水成為儲(chǔ)液。將苯酚、甲 酚、乙酸鋅、氯化鈉和甘油以所提及的順序加入。得到的溶液具有約7.8的pH和使用0.2 N HC1調(diào)整至pH 7.4,導(dǎo)致氯離子濃度最終增加1.45 mM氯離子。
[0176] 將制劑無(wú)菌過(guò)濾，和裝入3 ml帶塞藥筒。
[0177] 物理穩(wěn)定性如下測(cè)量： 在硫磺素 T (THT)測(cè)定法中測(cè)量原纖維形成趨勢(shì)。導(dǎo)致可見(jiàn)顆粒形成的潛在沉淀測(cè)量 為濁度的潛在增加。低于2 μπι的顆粒形成通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量。高于2 μπι的顆粒形成 通過(guò)微流成像(MFI)測(cè)量。
[0178]化學(xué)穩(wěn)定性測(cè)量為高分子量顆粒(HMWP)的增加(按百分比計(jì))和純度降低，如通過(guò) 反相UPLC測(cè)量的。
[0179] 硫磺素 T測(cè)定法中的原纖維形成趨勢(shì) 化合物1的濃度根據(jù)W0 2013/153000中描述的方法測(cè)量。
[0180] 表9 在硫磺素 T測(cè)定法中以小時(shí)數(shù)測(cè)量滯后時(shí)間。原纖維形成的滯后時(shí)間作為制劑中鋅含 量的函數(shù)而增加。包含超過(guò)5.8個(gè)zn/六聚體的制劑未形成原纖維，因此具有高于45小時(shí)的 滯后時(shí)間。
[0181] 通過(guò)DLS探查的化合物1的靜止穩(wěn)定性 在4 °C、37 °C和45 °C儲(chǔ)存的以各種濃度的NaCl和乙酸鋅配制的化合物1的物理穩(wěn)定性通 過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)探查。
[0182] 方法 各樣品在DynaPro讀板器上在25°C通過(guò)記錄20次10秒鐘的采集，一式三份測(cè)量;數(shù)據(jù)報(bào) 告為三次測(cè)量的平均值。樣品不經(jīng)過(guò)過(guò)濾，而是它們以15 000 X g離心20 min，以僅除去最 大的絮凝物和聚集物，其否則將阻斷測(cè)量。此外，使用石蠟油封咖LS微量滴定板的各孔，代 替更常用的塑料薄膜。
[0183] ^1〇 蛋白寡聚物平均大小測(cè)量為對(duì)于在4°C、30°C、37 °C或45 °C孵育2-8周的不同制劑的流 體動(dòng)力直徑(HD) (nm)〇
[0184] H R:流體動(dòng)力半徑(nm) Diam:直徑（nm) St.D:標(biāo)準(zhǔn)偏差 用DLS測(cè)定的蛋白寡聚物平均大小范圍為3.8 nm (對(duì)于含有5,8個(gè)Zn/胰島素六聚體、 20mM NaCl的制劑，在37°C，在2周后）至5.95 nm (對(duì)于含有10.5個(gè)Zn/胰島素六聚體、75 mM NaCl的制劑，在4°C，在2周后）。對(duì)于在4°C貯存的樣品，流體動(dòng)力直徑平均起來(lái)降低1%，而對(duì) 于在37和45°C貯存的樣品，其分別增加1和4%。此外，所有記錄的自相關(guān)函數(shù)符合單峰顆粒 分布，表明缺少任何大的聚集體的相當(dāng)狹窄的大小分布。
[0185] 結(jié)論 盡管不同的制劑條件顯示顯著不同的平均寡聚體大小，但如果根本上存在的話，隨時(shí) 間的變化格外小，和在4°C、37 °C以及45°C在測(cè)試的8周期間內(nèi)所有制劑似乎物理上是穩(wěn)定 的。在這期間沒(méi)有聚集體形成。
[0186] 使用MFI的高于2 μπι的顆粒測(cè)量 以微米范圍使用微流成像(MFI ? )分析制劑的亞可見(jiàn)顆粒形成。顆粒計(jì)數(shù)通常低，顆粒 的大部分具有對(duì)硅酮油液滴預(yù)期的黑色球型外觀。然而，分別在45°C孵育2周后和在37°C孵 育8周后，包含10.5個(gè)Zn/六聚體和150mM或75mM的制劑出現(xiàn)大的半透明薄片樣顆粒。
[0187] ^11 在4°C、30°C、37°C或45°C孵育2-20周的不同制劑的顆粒濃度(mL)。將具有圓形度*縱橫 比*強(qiáng)度STD >75和E⑶〈3μπι的顆粒從分析中排除，因?yàn)槠淇赡艽砉柰汀?br>[01 bo」 衣丄z
在4°C、30 °C、37 °C或45°C孵育2-20周的不同制劑的顆粒體積分?jǐn)?shù)(nL顆粒/mL樣品體 積）。將具有圓形度*縱橫比*強(qiáng)度STD >75和ECD〈3μπι的顆粒從分析中排除，因?yàn)槠淇赡艽?表硅酮油。
[0189] 物理穩(wěn)定性結(jié)論 在ThT測(cè)定法中，物理穩(wěn)定性測(cè)量為作為鋅/六聚體增加的函數(shù)的滯后時(shí)間，鋅含量從 5.8增加至8.1個(gè)Zn/胰島素六聚體。通過(guò)DLS測(cè)量的平均寡聚體大小變化顯示在任何制劑中 寡聚體大小未改變和無(wú)聚集體形成。通過(guò)MFI測(cè)量的顆粒測(cè)量顯示在包含10.5個(gè)Zn/六聚體 和75 mM NaCl的制劑中顆粒形成增加。
[0190] 因此，在包含高于5.8和低于10.5個(gè)Zn/胰島素六聚體的制劑中物理穩(wěn)定性是最佳 的。
[0191] 化學(xué)穩(wěn)定性 使用凝膠過(guò)濾柱在無(wú)乙酸的洗脫液中測(cè)量HMWP形成，如W0 2013/153000中所述。將貯 存在4°C的樣品的HMWP從貯存在30°C或37°C的樣品的HMPW中減去。
[0192] ^13 在4 °C、30 °C或37 °C孵育2-8周的不同制劑的HMWP形成。
[0193」 結(jié)論
包含5.8個(gè)Zn/胰島素六聚體的制劑比包含等于或多于8.1個(gè)Zn/胰島素六聚體的制劑 具有更多的HMWP形成。
[0194] 純度損失 純度損失相對(duì)于起始進(jìn)行測(cè)量。將對(duì)于在4°C貯存的樣品通過(guò)反相色譜測(cè)量的純度從 對(duì)于貯存在30°C或37°C的樣品測(cè)量的純度中減去。使用相對(duì)于W0 2013/153000中描述的方 法略微修改的UPLC純度方法。在本實(shí)例中，使用Waters CSH，C18柱，其在該情況下改進(jìn)在 其必須更換之前柱上允許的注射物的分離和數(shù)量。
[0195] ^14 在4°C、30°C或37°C孵育2-8周的不同制劑的純度損失(％)。
[0196」結(jié)論
包含5.8個(gè)Zn/胰島素六聚體的制劑具有最高的降解。包含等于或多于8.1個(gè)Zn/胰島素 六聚體的制劑具有較低的降解。因此，在具有等于或多于8.1個(gè)鋅/六聚體的制劑中化學(xué)穩(wěn) 定性是最佳的。在包含75 mM NaCl的制劑的穩(wěn)定性高于包含20 mM NaCl的制劑。
[0197] 實(shí)施例10 本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)大小排阻色譜法研究作為制劑中NaCl含量的函數(shù)的寡聚化，所述 制劑包含以4.2 mM胰島素的比較化合物A (即N{e-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-( 19-羧基十九烷酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙 氧基]乙?；鵠-[GluA14，HisB16，HisB25]，des-ThrB30-胰島素（人） ；替代名稱：A14E， B16H，B25H，Β29Κ(Νε二十烷二?；?gGlu-2x0EG)，desB30人胰島素）和固定的鋅/胰島素 六聚體。此外，目的是測(cè)量物理和化學(xué)穩(wěn)定性。
[0198] 制劑 在約8的pH值下將化合物A溶于milli-Q水。將苯酚、甲酚、乙酸鋅(Zn)和甘油以所提及 順序加入，產(chǎn)生最終制劑，其包含:4.5個(gè)Zn/6個(gè)胰島素、25 mM苯酚、25 mM甲酚、pH 7.4和 4.2 mM的胰島素濃度和下表中所示的氯化鈉(NaCl)、乙酸鋅和甘油。
[0199] 通過(guò)測(cè)量以下評(píng)價(jià)物理穩(wěn)定性： 1. 原纖維形成趨勢(shì)。通過(guò)硫磺素 T測(cè)定法測(cè)量。原纖維形成趨勢(shì)在硫磺素 T (THT)測(cè)定 法中測(cè)量為原纖維形成的滯后時(shí)間。按所述，THT測(cè)定法在新鮮制備的樣品上測(cè)量;和 2. 通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的寡聚體半徑(nm)和低于4 μπι的聚集體形成。
[0200] 制劑的化學(xué)穩(wěn)定性測(cè)量為在37°C貯存4個(gè)周(4w)后胰島素相關(guān)雜質(zhì)中高分子量蛋 白（HMWP)相對(duì)于在4°C貯存后HMWP的量的增加。
[0201] 使用W0 2013/153000中描述的HMWP方法2測(cè)量HMWP。
[0202] 胰島素相關(guān)雜質(zhì)例如脫酰胺化合物的形成使用反相色譜法(UPLC)測(cè)量。
[0203]單體的量在非變性凝膠過(guò)濾中使用W0 2013/153000中描述的方法2在沒(méi)有苯酚的 洗脫液中測(cè)量。
[0204]表15 在化合物A的THT測(cè)定法中HMWP形成和原纖維形成的滯后時(shí)間
結(jié)論 化合物A單體的量作為氯化鈉濃度的函數(shù)降低，加入剛好至多50 mM NaCl具有大的影 響。在所有制劑中測(cè)量為HMWP形成和雜質(zhì)形成的化學(xué)降解低，不管單體含量如何。THT滯后 時(shí)間隨鋅含量和氯化鈉含量增加。
[0205]表16 平均流體動(dòng)力半徑Rh avg. (nm)和標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度In_ avg. (106計(jì)數(shù)/秒）（4°C)。注 意:在t=0未測(cè)量樣品。
[0206] Rh avg. (nm):平均流體動(dòng)力半徑(nm) In_ avg. (106 cts):標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度（106計(jì)數(shù)/秒）（37°C) 表17 平均流體動(dòng)力半徑Rh avg. (nm)和標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度In_ avg. (106計(jì)數(shù)/秒）（37°C)。注 意:在t=0未測(cè)量樣品。
[0207] Rh avg. (nm):平均流體動(dòng)力半徑(nm) In_ avg. (106 cts):標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度（106計(jì)數(shù)/秒）（37°C) 結(jié)論 流體動(dòng)力半徑隨鹽濃度增加而增加。除了7個(gè)Zn/胰島素六聚體時(shí)之外，Zn濃度對(duì)大小 具有較小影響。孵育溫度對(duì)寡聚體大小和物理穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1· A14E, B16E, B25H, Β29Κ(Ν(ε)-二十烷二?；?gGlu-2xOEG), desB30人胰島素 (化合物1)。2. 權(quán)利要求1的化合物，其用作藥物。3. 權(quán)利要求1的化合物，其用作用于治療糖尿病的藥物。4. 權(quán)利要求1的化合物，其用于治療糖尿病，其中所述化合物以每隔一天或更低頻率給 予同一患者，并且平均起來(lái)，在至少1個(gè)月、6個(gè)月或1年的時(shí)間期間，所述化合物不以更高頻 率給予同一患者。5. 權(quán)利要求1的化合物，其用于治療糖尿病，其中所述化合物以一周兩次或更低頻率給 予，并且平均起來(lái)，在至少1個(gè)月、6個(gè)月或1年的時(shí)間期間，所述化合物不以更高頻率給予同 一患者。6. 權(quán)利要求1的化合物，其用于治療糖尿病，其中所述化合物以每周一次或更低頻率給 予，并且平均起來(lái)，在至少1個(gè)月、6個(gè)月或1年的時(shí)間期間，所述化合物不以更高頻率給予同 一患者。7. 包含權(quán)利要求1的化合物的水溶液。8. 權(quán)利要求7的水溶液，其包含至少5個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。9. 權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的水溶液，其中pH范圍為7-8。10. 包含權(quán)利要求1的化合物和一種或多種賦形劑的藥物組合物。11. 權(quán)利要求10的藥物組合物，其包含至少4.5個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。12. 治療或預(yù)防糖尿病的方法，所述方法包括給予有需要的受試者治療有效量的權(quán)利 要求1的化合物。
【專利摘要】本發(fā)明提供人胰島素的類似物的新衍生物，其可用于治療糖尿病。
【IPC分類】C07K14/62, A61K38/28
【公開(kāi)號(hào)】CN105636979
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480055375
【發(fā)明人】P.馬德森, T.M.塔格莫塞, H.納維, T.B.克杰德森
【申請(qǐng)人】諾和諾德股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2014年10月3日
【公告號(hào)】CA2926701A1, WO2015052088A1