(或相同的）Fmoc保護(hù)的氨基酸和脫保護(hù)。合成序列通過(guò)偶聯(lián)單叔丁基保護(hù)的脂肪 (α，ω)二酸，即二十烷二酸單叔丁酯終止。使用稀酸例如0.5-5% TFA/DCM (含三氟乙酸的 二氯甲烷）、乙酸(例如10%，在DCM中；或HOAc/三氟乙醇/DCM 1:1:8)或含六氟異丙醇的DCM， 將化合物從樹(shù)脂上裂解（參見(jiàn)例如"Organic Synthesis on Solid Phase"，F(xiàn).Z. D6 rwald, Wiley-VCH, 2000.1 SBN 3-527-29950-5;"Peptides: Chemistry and Biology"， N. Sewald & H.-D. Jakubke， Wiley-VCH， 2002， ISBN 3-527-30405-3;和"The Combinatorial Cheemistry Catalog" 1999，Novabiochem AG;和其中引用的參考文獻(xiàn)）。 這確保在化合物中作為羧酸保護(hù)基團(tuán)存在的叔丁基酯未被脫保護(hù)。最后，將C-末端羧基(從 樹(shù)脂上釋放)活化，例如作為N-羥基琥珀酰亞胺酯(OSu)，和直接或在純化后作為偶聯(lián)試劑， 或在脫保護(hù)后用于連接A14E，B16E，B25H，desB30人胰島素。
[0128] 或者，?；噭?((幻-丨-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基 羰基甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸可通過(guò)液相合成制備： 將單叔丁基保護(hù)的脂肪二酸二十烷二酸單叔丁酯活化，例如作為下文所述的OSu-酯或 作為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它活化酯，例如HOBt-或HOAt-酯。該活性酯與谷氨酸α- 叔丁基酯在合適的溶劑例如THF、DMF、NMP (或溶劑混合物）中在存在合適的堿例如DIPEA或 三乙胺的情況下偶聯(lián)。中間體例如通過(guò)提取程序或通過(guò)色譜程序分離。將得到的中間體再 次進(jìn)行活化(如上文所述)和如上文所述與OEG-OEG ([2-(2-{2-[2-(2_氨基-乙氧基)-乙氧 基]-乙?；被鶀_乙氧基)_乙氧基]-乙酸)偶聯(lián)，接著用TSTU活化，得到?；噭?9-((S)_ 1 _駿基_3_{ 2-[2-({2-[2_(2，5-二氧代吡略燒-1-基氧基幾基甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲 ?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸。
[0129] 通過(guò)上述方法制備的?；噭┰诨罨癁镺Su酯后可以經(jīng)過(guò)叔丁基脫保護(hù)。這可通 過(guò)TFA處理OSu-活化的叔丁基保護(hù)的酰化試劑進(jìn)行。在將A14E，B16E，B25H，desB30人胰島素 酰化后，獲得產(chǎn)生的未保護(hù)的?；疉14E，B16E，B25H，desB30人胰島素，例如如實(shí)施例l中所 述。
[0130] 如果通過(guò)任何上述方法制備的試劑在活化為OSu酯后未經(jīng)叔丁基脫保護(hù)，則將 A14E，B16E，B25H，desB30人胰島素酰化得到相應(yīng)的叔丁基保護(hù)的?；疉14E，B16E，B25H， desB30人胰島素。為了獲得未保護(hù)的?；疉14E，B16E，B25H，desB30人胰島素，保護(hù)的胰島素 進(jìn)行脫保護(hù)。這可通過(guò)TFA處理進(jìn)行，得到未保護(hù)的?；疉14E，B16E，B25H，desB30人胰島素。
[0131] 或者，?；噭┛稍谌芤褐惺褂闷S基保護(hù)的羧酸基團(tuán)合成，如下文所述。
[0132] 19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基) 乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九烷酸； (替代名稱:二十烷二酰基-gGlu-〇EG-〇EG-〇Su) LCMS方法（LCMS) 在從Waters Alliance HT HPLC系統(tǒng)上洗脫后，使用Waters Micromass ZQ質(zhì)譜儀以鑒 定樣品質(zhì)量。
[0133] 洗脫液:A:含0.1%三氟乙酸的水 B:含0.1%三氟乙酸的乙腈 柱：Phenomenex，Jupiter C4 50 X 4.60 mm, id: 5 μπι 梯度：10%-90% B，經(jīng)7.5 min，1.0 mL/min 柱:Phenomenex，Jupiter 5μ C4 30〇A 50 x 4.60 mm LC方法：10-90% B lOmin: A: 0.1% CH3CN B: CH3CN: 0-7.5 min: 10-90% B 7.5- 8.5 min: 90-10% B 8.5- 9.5 min 10% B 流速：1 mL/min 9.5 - 10.00 min 10% B 流速:0.1 mL/min 二十烷二酸叔丁基酯N-羥基琥珀酰亞胺酯
將二十烷二酸單叔丁酯（5 g, 12.54 mmol)和TSTU (4.53g, 15.05 mmol)在THF (50 mL)中混合，加入DIPEA (2.62 mL)和得到的渾濁混合物在室溫下攪拌2h，然后加入DMF ( 30 mL)，產(chǎn)生澄清溶液，其進(jìn)一步攪拌過(guò)夜。將得到的混合物蒸發(fā)至幾乎干燥，和將殘余物 與冷的乙腈混合，導(dǎo)致沉淀物沉淀。將其濾出，和真空干燥過(guò)夜，得到6.01 g (97%)的二十 烷二酸叔丁基酯N-羥基琥珀酰亞胺酯。
[0134] MS (電噴射）：m/z: 440 (M-56 (tBu))。
[0135] 0)-2-( 19-叔丁氧基羰基十九烷?；被?戊二酸1-叔丁酯
將二十烷二酸叔丁基酯2,5_二氧代-吡咯烷-1-基酯（6.01g，12.124 mmol)溶于THF (150 mL)和與H-Glu-〇tBu (2.71 g, 13.33 mmol)在DMF/水（1/1，40 mL)中的漿液混合。 這產(chǎn)生凝膠樣溶液，將其加熱得到澄清溶液，將該溶液在室溫下攪拌3小時(shí)。然后蒸發(fā)溶液， 加入100 mL的水和將混合物加熱至60°C，這產(chǎn)生溶液，其在冷卻時(shí)結(jié)晶。將沉淀物自乙腈重 結(jié)晶和將結(jié)晶在真空干燥。收率6.82 g (96%)。
[0136] MS (電噴射）：m/z 584 (M+1)。
[0137] (S)-2_(19-叔丁氧基羰基十九烷?；被?戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯 烷-1-基)酯
將(S)-2-(19-叔丁氧基羰基十九烷?；被?戊二酸1-叔丁酯(6.52g，11.17 mmol) 溶于THF (100 mL)，加入DIPEA (2.14 mL)，接著加入含TSTU (3.70 g, 12.29 mmol)的乙 腈(25 mL)溶液。在室溫下攪拌混合物過(guò)夜，然后將其蒸發(fā)，得到褐色殘余物，將其自乙腈重 結(jié)晶。在5°C冷卻過(guò)夜后，形成粉末。將其溶于THF和用MgS0 4干燥，過(guò)濾和蒸發(fā)至干，得到 6.17 g (81%)的標(biāo)題化合物。
[0138] MS (電噴射）：m/z: 681 (M+1)。
[0139] 19-{(S)_1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2_{ [2-(2-羧基甲氧基乙氧基）乙基氨基甲酰 基]甲氧基}乙氧基）乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十九烷酸叔丁基酯； (替代名稱:tBu-二十烷二酰基-gGlWOtBiQ-OEG-OEG-OH)
向含2-(19-叔丁氧基羰基十九烷?；被?戊二酸1-叔丁酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.50 g)和[2-(2-{2-[2-(2_氨基乙氧基）乙氧基]乙?；被鶀乙氧基）乙氧基]乙酸 (替代名稱：H-0EG-0EG-OH)(1.47 g)的乙醇(40 mL)溶液中加入DIPEA (1.26 mL)。將混合 物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后真空濃縮。向殘余物中加入含水0.1 N HC1 (150 mL)和乙酸乙 酯（200 mL)。分離各層，和水層用乙酸乙酯（100 mL)萃取。合并的有機(jī)層用水和鹽水洗滌， 干燥(硫酸鎂)和真空濃縮，得到油狀物，其靜置結(jié)晶。
[0140] 收率96% (3.1 ghLCMS:理論質(zhì)量：874.2。實(shí)測(cè)：874.49。
[0141] 19-((S)-1-叔丁氧基羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基 甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；?十九 烷酸叔丁基酯； (替代名稱：tBu-二十烷二?；?gGli^QtBiO-OEG-OEG-OSu)
向含19-{(S)-1-叔丁氧基羰基-3-[2-(2-{ [2-(2-羧基甲氧基乙氧基）乙基氨基甲酰 基]甲氧基}乙氧基）乙基氨基甲?；鵠丙基氨基甲?；鶀十九烷酸叔丁基酯（3.1 g)的乙腈 (50 mL)溶液中加入TSTU (1.39 g)和DIPEA (0.91 mL)。在室溫下將混合物攪拌過(guò)夜，然后 真空濃縮。向殘余物中加入含水0.1 N HC1 (100 mL)和乙酸乙酯(200 mL)。分離各層，和水 層用乙酸乙酯（50 mL)萃取。合并的有機(jī)層用水和鹽水洗滌，干燥(硫酸鎂)和真空濃縮，得 到油狀物。
[0142] 收率99% (3.4 ghLCMS:理論質(zhì)量:971.2。實(shí)測(cè):971.8。
[0143] 19-((S)-1-羧基-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基) 乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸； (替代名稱：二十烷二酰基-gGlu-〇EG-〇EG-〇Su)
將19-( (S)_l_叔丁氧基幾基-3_{2-[2_( {2_[2_(2，5_二氧代-吡略燒-1-基氧基幾基甲 氧基)_乙氧基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲酰基）十九 烷酸叔丁基酯(3.4 g)在TFA (75 mL)中攪拌45 min，然后真空濃縮。將殘余物用甲苯共濃 縮3次，得到固體。將殘余物在2-丙醇中結(jié)晶和過(guò)濾，得到白色結(jié)晶化合物。
[0144] 收率80% (2.4 ghLCMS:理論質(zhì)量:859.03。實(shí)測(cè)：859.44。
[0145] 為了將A14E，B16E，B25H，desB30人胰島素的位置B29 (在ε位置上）的賴氨酸殘 基?；?，酰化優(yōu)選在堿性pH (例如pH 10、10.5或11)下進(jìn)行。這在本文的實(shí)施例1中說(shuō)明。
[0146] 實(shí)施例1 N{e-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷?；被┒□?基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[GluA14，GluB16, HisB25] ,des-ThrB30-胰島素（人）； (替代名稱:A14E, B16E, B25H, B29K(Ne二十烷二?；?gGlu-2xOEG), desB30人胰島 素;化合物1)
將A14E, B16E, B25H, desB30人胰島素（3.0 g, 0.53 mmol)溶于 150 mM含水Na2C03 (40 mL)和加入5 mL THF。用1M含水NaOH調(diào)節(jié)pH值至11.0。在劇烈攪拌下，在1分鐘期間將 19-( (S)-l_駿基_3-{2-[2-( {2_[2_(2，5-二氧代吡略燒-1-基氧基幾基甲氧基）乙氧基]乙 基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；┦磐樗幔?41 mg， 0.75 mmol，按上文所述制備)溶于1.5 mL THF和1.5 mL DMF的混合物中。在加入的同時(shí)，通 過(guò)加入1N含水NaOH保持pH恒定在10.5-11。將混合物攪拌1小時(shí)