一患者，給予有需要的受試者治療有 效量的化合物1，其中當(dāng)前或重復(fù)用化合物1治療糖尿病持續(xù)超過2個(gè)月。
[0087] 43.根據(jù)條款26的方法，所述方法包括向同一患者，給予有需要的受試者治療有 效量的化合物1，其中當(dāng)前或重復(fù)用化合物1治療糖尿病持續(xù)超過3個(gè)月。
[0088] 44.根據(jù)條款26的方法，所述方法包括向同一患者，給予有需要的受試者治療有 效量的化合物1，其中當(dāng)前或重復(fù)用化合物1治療糖尿病持續(xù)超過1年(一年）。
[0089] 45.根據(jù)條款26的方法，所述方法包括向同一患者，經(jīng)胃腸外優(yōu)選皮下、肌內(nèi)或靜 脈內(nèi)給予有需要的受試者治療有效量的化合物1。
[0090] 46.根據(jù)條款26的方法，所述方法包括向同一患者，經(jīng)口服給予有需要的受試者 治療有效量的化合物1。
[0091] 47.包含化合物1的水溶液。
[0092] 48.包含化合物1和至少5個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0093] 49.包含化合物1和至少6個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0094] 50.包含化合物1和至少7個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0095] 51.包含化合物1和至少8個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0096] 52.包含化合物1和至少9個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0097] 53.包含化合物1和至少10個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0098] 54.包含化合物1和至少11個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0099] 55.包含化合物1和至少12個(gè)鋅離子/胰島素六聚體的水溶液。
[0100] 56.根據(jù)條款47-55中任一項(xiàng)的水溶液，其中pH范圍是7-8。
[0101] 57.根據(jù)條款47-55中任一項(xiàng)的水溶液，其中pH是約7.4。
[0102] 58.包含化合物1和一種或多種賦形劑的藥物組合物。
[0103] 59.包含化合物1和一種或多種賦形劑的藥物組合物，所述賦形劑選自稀釋劑、緩 沖劑、防腐劑、張力調(diào)節(jié)劑、螯合劑、表面活性劑、蛋白酶抑制劑、濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、 填充劑、金屬離子、油性溶媒、蛋白質(zhì)和/或兩性離子和穩(wěn)定劑。
[0104] 60.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少4.5個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0105] 61.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少5個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0106] 62.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少6個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0107] 63.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少7個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0108] 64.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少8個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0109] 65.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少9個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0110] 66.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少10個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0111] 67.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少11個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0112] 68.根據(jù)條款59的藥物組合物，包含至少12個(gè)鋅離子/胰島素六聚體。
[0113] 69.根據(jù)條款59-68中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中pH范圍是7-8。
[0114] 70.根據(jù)條款59-68中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中pH是約7.4。
[0115] 71.根據(jù)條款59-68中任一項(xiàng)的藥物組合物，其呈水溶液的形式。
[0116] 72.根據(jù)條款59-68中任一項(xiàng)的藥物組合物，其呈片劑的形式。
[0117] 73.根據(jù)條款59-68中任一項(xiàng)的藥物組合物，其呈包含在膠囊例如軟膠囊或硬膠 囊中的固體、半固體或液體制劑的形式。
[0118] 74.通過本文所述的特征和/或權(quán)利要求和/或特征和/或權(quán)利要求的組合定義的 任何新產(chǎn)品、裝置、方法或用途。
[0119] 本文所述的兩個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的任何組合被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 實(shí)施例
[0120] 本發(fā)明進(jìn)一步參考以下實(shí)施例進(jìn)行說明，其并不意圖以任何方式限制所要求保護(hù) 的本發(fā)明的范圍。
[0121] 本文使用以下縮寫： Mia是β-丙氛醜基； Aoc是8-氨基辛酸； tBu是叔丁基； DCM是二氯甲烷； DIC是二異丙基碳二亞胺； DIPEA = DIEA是N，N-二異丙基乙胺； DMF是N，N-二甲基甲酰胺； DMS0是二甲基亞砜； EtOAc是乙酸乙酯； Fmoc是9-荷基甲基氧基羰基； yGlu (gGlu)是YL-谷氨酰基； DyGlu (DgGlu)是 yD-谷氨酰基； HC1是鹽酸； HOAc是乙酸； HOBt是1-羥基苯并三唑； NMP是N-甲基吡咯烷酮； MeCN是乙臆； 0EG是[2-(2-氨基乙氧基）乙氧基]乙基羰基； Su是琥珀酰亞胺基-1-基=2,5_二氧代-吡咯烷-1-基； 〇Su是琥珀酰亞胺基-1-基氧基=2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基； RPC是反相色譜； RT是室溫； TFA是三氟乙酸； THF是四氫呋喃； TNBS是2，4，6-三硝基苯磺酸； TRIS是三(羥基甲基)氨基甲烷;和 TSTU是0-(N-琥珀酰亞胺基)-1，1，3，3_四甲基脲儀四氟硼酸鹽。
[0122] 以下實(shí)施例和通用程序涉及在本說明書中和在合成方案中鑒定的中間體化合物 和終產(chǎn)物。本發(fā)明的化合物的制備使用以下實(shí)施例詳細(xì)描述，但所述的化學(xué)反應(yīng)按照它們 對(duì)制備本發(fā)明的化合物的一般適用性而公開。有時(shí)，所述反應(yīng)可能不如所述地適用于在本 發(fā)明所公開的范圍內(nèi)包括的每種化合物。發(fā)生這種情況的化合物將容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人 員識(shí)別。在這些情況下，反應(yīng)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)改變成功進(jìn)行，所述常規(guī)改 變?yōu)橥ㄟ^對(duì)阻礙基團(tuán)的合適保護(hù)，通過改變成其它常規(guī)試劑，或通過反應(yīng)條件的常規(guī)改變。 或者，本文公開的其它反應(yīng)或以其它方式常規(guī)的其它反應(yīng)將適合于制備本發(fā)明相應(yīng)的化合 物。在所有的制備方法中，所有原料是已知的，或可容易地自已知原料制備。所有溫度以攝 氏度表示，和除非另外說明，否則當(dāng)涉及收率時(shí)所有部分和百分比為按重量計(jì)，和當(dāng)涉及溶 劑和洗脫液時(shí)所有部分為按體積計(jì)。
[0123] 胰島素類似物的載體的構(gòu)建、酵母表達(dá)、處理和純化可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易 識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。制備胰島素類似物的一個(gè)非限制性的實(shí)例之前有所描述(Glendorf T， Sorensen AR， Nishimura E， Pettersson I， & Kjeldsen T: Importance of the Solvent-Exposed Residues of the Insulin B Chain α-Helix for Receptor Binding; Biochemistry 2008 47 4743-4751)。簡言之，使用重疊延伸PCR將突變引入胰島素編碼載 體。胰島素類似物作為具有Ala-Ala-Lys小C-肽的前胰島素樣融合蛋白在釀酒酵母菌株 MT663中表達(dá)。使用水解無色桿菌(A. lyticus)內(nèi)切蛋白酶，單鏈前體經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化為雙鏈 desB30類似物。完全轉(zhuǎn)化成雙鏈desB30類似物通過MALDI-TOF MS驗(yàn)證，和其純度通過在酸 性和中性pH下RP-HPLC進(jìn)行測(cè)量。
[0124] 本發(fā)明的化合物可通過使用本領(lǐng)域內(nèi)典型的一個(gè)或多個(gè)以下程序進(jìn)行純化。如果 需要的話，可關(guān)于梯度、PH、鹽、濃度、流速、柱等改變這些程序。根據(jù)因素例如雜質(zhì)特征、所 述胰島素衍生物的溶解度等，這些改變可容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別和實(shí)現(xiàn)。
[0125] 在酸性HPLC或脫鹽后，化合物通過冷凍干燥純的流分進(jìn)行分離。在中性HPLC或陰 離子交換色譜后，將化合物脫鹽，在等電點(diǎn)pH下沉淀，或通過酸性HPLC純化。
[0126] 典型的純化程序 HPLC系統(tǒng)是由以下組成的Gilson系統(tǒng):Model 215液體操作器、Model 322-H2栗和 Model 155 UV檢測(cè)器。通常在210 nm和280 nm進(jìn)行檢測(cè)。Akta Purifier FPLC系統(tǒng) (Amersham Biosciences)由以下組成：Model P-900栗、Model UV-900 UV檢測(cè)器、Model pH/C-900 pH和電導(dǎo)率檢測(cè)器、Model Frac-950流分收集器。通常在214 nm、254 nm和276 nm進(jìn)行UV檢測(cè)。Akta Explorer Air FPLC系統(tǒng)（Amersham BioGE Health Caresciences)由 以下組成:Model P-900栗、Model UV-900 UV檢測(cè)器、Model pH/C-900 pH和電導(dǎo)率檢測(cè)器、 Model Frac-950流分收集器。通常在214 nm、254 nm和276 nm進(jìn)行UV檢測(cè)。
[0127] 酸性 HPLC 柱:Phenomenex，Gemini , 5μ , C18, 110 A, 250x30 cm 流速:20 mL/min 洗脫液:A:含0.1% TFA的水 B:含0.1% TFA的CH3CN 梯度:0-7.5 min: 10% B 7.5- 87.5 min: 10% B至60% B 87.5- 92.5 min: 60% B 92.5- 97.5 min: 60% B至100% B 中性HPLC 柱:Phenomenex，Gemini , C18, 5μηι 250 x 30.00 mm, 110 A 流速:20 mL/min 洗脫液:A:含20% CH3CN的含水lOmM TRIS + 15mM (NH4)S〇4 pH = 7.3 B: 80% CH3CN, 20%水 梯度:0-7.5 min: 0% B 7.5- 52.5 min: 0% B至60% B 52.5- 57.5 min: 60% B 57.5- 58 min: 60% B至100% B 58-60 min: 100% B 60-63 min: 10% B 陰離子交換色譜 柱：150 mL (2.6x28cm) Poros 50HQ 流速：25 mL/min 洗脫液:A緩沖液:含15 mM TRIS, 50 mM乙酸銨的50%乙醇，pH 7.5 (1.6 mS/cm) B緩沖液:含 15 mM TRIS, 500 mM乙酸銨的50%乙醇，pH 7.5 (14 mS/cm) 梯度:0-80% B，經(jīng)20CV 固相合成 19-( (S)-l_駿基-3-{2-[2_( {2-[2_(2，5-二氧代P比略燒-1-基氧基幾基甲氧基)乙氧 基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲?；?十九烷酸； (替代名稱:二十烷二酰基-gGlu-OEG-OEG-OSu) 19-( (S)-l_駿基-3-{2-[2_( {2_[2_(2，5-二氧代R比略燒-1-基氧基幾基甲氧基）乙氧 基]乙基氨基甲?；鶀甲氧基）乙氧基]乙基氨基甲?；鶀丙基氨基甲?；┦磐樗峥稍诠?體支持物上使用固相肽合成領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的程序合成。該程序例如包括將Fmoc 保護(hù)的氨基酸連接至聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯樹脂。所述連接可例如使用游離N-保護(hù)的氨 基酸在存在叔胺例如三乙胺或N，N-二異丙基乙基胺時(shí)進(jìn)行(見下文的參考文獻(xiàn)）。該氨基酸 的C-末端(其與樹脂連接)在合成序列的末端，所述合成序列與本發(fā)明的母體胰島素偶聯(lián)。 在將Fmoc氨基酸連接至樹脂后，使用例如仲胺如哌啶或二乙胺將Fmoc基團(tuán)脫保護(hù)，接著偶 聯(lián)另一