專利名稱：含有胰島素類似物的藥物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)過(guò)在天然人胰島素B鏈的第29位氨基酸和其他可選擇位點(diǎn)的修改而得到的胰島素類似物。所說(shuō)的胰島素類似物不易于聚合或自我聯(lián)合成大分子形式，從而具有相對(duì)較快的活化作用，并且保留了天然人胰島素的生物活性。
本發(fā)明提供了具如下結(jié)構(gòu)式的胰島素類似物 其中A21是丙氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或絲氨酸；B1是苯丙氨酸、天門冬氨酸或者缺失；B2是纈氨酸或在B1不存在時(shí)缺失；B3是天門冬酰胺或天門冬氨酸；B9是絲氨酸或天門冬氨酸；B10是組氨酸或天門冬氨酸；B28是任一種氨基酸；B29是L-脯氨酸、D-脯氨酸、D-羥脯氨酸、L-羥脯氨酸、L-( N-甲基賴氨酸)、D-賴氨酸、L-(N-甲基精氨酸)或D-精氨酸；B30是丙氨酸、蘇氨酸或者缺失；Z是-OH、-NH2、-OCH3或-OCH2CH3；X是Arg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys、Lys-Arg或者缺失；而Y可以是只有當(dāng)X存在時(shí)才存在，如果存在，則可以是谷氨酸，或者是一個(gè)含有下列全部或部分順序的氨基酸順序-Glu-Ala-Glu-AsP-leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-，而且Y的順序以上述順序的N端谷氨酸為起點(diǎn)。
本文還公開和申請(qǐng)了一種治療高血糖癥的方法，該方法是在病人需要時(shí)給以有效量的結(jié)構(gòu)I的胰島素類似物。而且，本文還公開和申請(qǐng)了一些由有效量的結(jié)構(gòu)I的胰島素類似物和一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑組成的藥物組合物。
本文所提供的附圖沒(méi)有按實(shí)際比例描繪。


圖1是質(zhì)粒pKC283(～9.1kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖2是質(zhì)粒pKC283PX(～6.1kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖3是質(zhì)粒pKC283-L(～5.9kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖4是質(zhì)粒pKC283-LB(～5.9kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖5是質(zhì)粒pKC283-PRS(～4.0kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖6是質(zhì)粒pL32(～3.9kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖7是質(zhì)粒pNM789的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖8是質(zhì)粒120的結(jié)構(gòu)略圖。
圖9是質(zhì)粒pL47(～4.5kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖10是質(zhì)粒pPR12(～5.1kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖11是質(zhì)粒pPR12ARl(～5.1kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖12是質(zhì)粒pL110(～6.6kb)的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖13是質(zhì)粒pL110C的結(jié)構(gòu)略圖。
圖14是質(zhì)粒pCZR126S的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖15是合成的人胰島素原基因的核苷酸順序。
圖16是質(zhì)粒pRB145的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖17是質(zhì)粒pRB164A的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖18是質(zhì)粒pRB172的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖19是質(zhì)粒pRB173的切割位點(diǎn)和功能圖。
圖20是質(zhì)粒pRB175的切割位點(diǎn)和功能圖。
結(jié)構(gòu)式I代表本發(fā)明胰島素類似物的氨基酸順序略圖。氨基酸縮寫字母具有下列常規(guī)含義縮寫 氨基酸Abaα-氨基丁酸Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn門冬酰胺Asp天門冬氨酸
Cya磺基丙氨酸Cys半胱氨酸Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸Gly甘氨酸His組氨酸Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸Met蛋氨酸Nle正亮氨酸Nva正纈氨酸Orn鳥氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸B28可以是任何天然或非天然產(chǎn)生的氨基酸。所說(shuō)的氨基酸最好是天門冬氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在上述氨基酸中，其中優(yōu)選的亞組為天門冬氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、鳥氨酸或賴氨酸。賴氨酸是B28的最佳氨基酸選擇。B29最好是L-脯氨酸、D-脯氨酸、D-羥脯氨酸或L-羥脯氨酸。本發(fā)明的最佳胰島素類似物是一種B28是賴氨酸而B29是脯氨酸的胰島素類似物，也就是說(shuō)，將天然人胰島素B鏈氨基酸順序中的B28和B29位點(diǎn)進(jìn)行顛倒。
如上所述，另一種方案是，當(dāng)B28是L-脯氨酸時(shí)，位點(diǎn)B29優(yōu)選L-(N-甲基賴氨酸)、D-賴氨酸、L-(N-甲基精氨酸)或D-精氨酸。這種方案的最佳胰島素類似物中B28是L-脯氨酸而B29是L-(N-甲基賴氨酸)或D-賴氨酸。
下面還討論了本發(fā)明胰島素類似物的進(jìn)一步修改，也就是說(shuō)，在位點(diǎn)B28和B29以外的位點(diǎn)處對(duì)胰島素類似物進(jìn)行修改。尤其是希望用丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或絲氨酸在A鏈的21位點(diǎn)處(也即羧端)隨意地取代天冬酰胺殘基，如果進(jìn)行取代，最好用丙氨酸取代。同樣，可在B鏈的位點(diǎn)3處用天冬氨酸取代天冬酰胺殘基。這種可選擇地取代可以有效地增加胰島素類似物在pH極端狀態(tài)下的穩(wěn)定性，因?yàn)樘於０吩诘蚿H和高pH下都特別易于脫酰胺和出現(xiàn)重排反應(yīng)。熟練的技術(shù)人員也會(huì)認(rèn)為，胰島素類似物的谷氨酰胺基團(tuán)同樣易于脫酰胺和重排。因此，對(duì)谷氨酸進(jìn)行取代也屬本發(fā)明的范圍。另外，對(duì)本發(fā)明胰島素類似物的可選擇修改還包括(可與其他任何修改相結(jié)合)用天冬氨酸在B10位取代組氨酸；用天冬氨酸在B1位取代苯丙氨酸；用丙氨酸在B30位取代蘇氨酸；用天冬氨酸在B9位取代絲氨酸；單獨(dú)使B1位的氨基酸缺失(des-B1)或同時(shí)使B2位的氨基酸缺失(des-B2)；和B30位的蘇氨酸缺失(des-B30)。
對(duì)本發(fā)明的胰島素類似物的修改還可在B30末端加上任何一種下列氨基酸或二肽Arg、Arg-Arg、Lys、Lys-Lys、Arg-Lys或Lys-Arg。如果存在這些基團(tuán)，在結(jié)構(gòu)式I中用X表示。進(jìn)行這種延伸時(shí)，最好是用Arg-Arg。
另外，如果進(jìn)行上述B30處的伸展，還可以進(jìn)一步對(duì)該類似物進(jìn)行修改，方法是在得到的B30延伸后的末端加上谷氨酸或含有下列全部或部分順序的氨基酸順序-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-，該順序的N端以谷氨酸開始。如果加上這個(gè)氨基酸或順序，在結(jié)構(gòu)式I中以Y基團(tuán)表示。如果該順序只是上述順序的一部分，它可以是以該順序的N端為起點(diǎn)的任何部分，也就是說(shuō)以谷氨酸為起點(diǎn)。
在上述中，X或X與Y的結(jié)合代表了存在于人胰島素原中的全部或部分連接肽，人胰島素原是天然人胰島素形成中的生物學(xué)前體。
Y的優(yōu)選順序是-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-；-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-；和-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-.
另外，不論X是單獨(dú)還是與Y同時(shí)存在或不存在，末端基團(tuán)Z可以是下列基團(tuán)的任何一種-OH、-NH2、-OCH3或-OCH2CH3。最好是-OH。
如上所述，本發(fā)明還包括胰島素類似物的醫(yī)藥上可接受的鹽。這些鹽最好是它的鋅鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。
可以采用任何一種公認(rèn)的肽合成技術(shù)制備本發(fā)明的胰島素類似物，這些技術(shù)包括古典方法(溶液法)、固相法、半合成法和最近出現(xiàn)的DNA重組法。
在固相方法中，氨基酸順序的構(gòu)建是從一個(gè)起始的、不溶性的、樹脂支持的C端氨基酸依次進(jìn)行的。對(duì)固相法的描述見(jiàn)J.Stewart等，《固相肽合成》，F(xiàn)reeman and Co.，SanFrancisco，1969。
一般情況下，在固相方法中，將與所需肽的C端氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸固定于一個(gè)不溶的樹脂支持物上，然后即可從樹脂支持的C端氨基酸開始形成肽鏈。依次加上單個(gè)氨基酸直至得到所要求的氨基酸順序。也可以制備小的肽片段，然后按照所需順序加到肽鏈上。在整個(gè)合成過(guò)程中肽鏈保持固定于樹脂上，而當(dāng)肽鏈合成完成時(shí)，即將肽鏈從樹脂上分離下來(lái)。
可以通過(guò)在C端部分的羧基與樹脂基質(zhì)上作為連接點(diǎn)的特定亞甲基之間形成酯鍵，將肽鏈連接到聚苯乙烯樹脂上。
可用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法將氨基酸連接在一起以形成肽鍵。一種方法是，將氨基酸轉(zhuǎn)化成一種衍生物，使得羧基更易于和肽片段的自由N端氨基發(fā)生反應(yīng)。例如，可通過(guò)使保護(hù)的氨基酸與氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯或氯甲酸異丁酯發(fā)生反應(yīng)，而把氨基酸轉(zhuǎn)化成一種混合酐。也可以把氨基酸轉(zhuǎn)化成一種活性酯，如一種2，4，5-三氯苯酯、一種五氯苯酯、一種對(duì)硝基苯酯、一種N-羥基琥珀酰亞胺酯或一種由1-羥基苯并三唑形成的酯。
另外一種連接方法包括使用一種合適的連接劑，如N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)。其他合適的連接劑對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。見(jiàn)Schroder和Lubke，《肽》，Academic Press，1965，第3章，本文對(duì)此進(jìn)行了參考。
應(yīng)當(dāng)指出，在連接反應(yīng)中必須對(duì)肽合成中所用的每個(gè)氨基酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，以防止出現(xiàn)涉及活性α-氨基功能的副作用。還應(yīng)當(dāng)指出的是，某些氨基酸含有活性的側(cè)鏈功能團(tuán)(如硫氫基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羥基等)，而且在起始和依次連接步驟中必須對(duì)這些功能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。適宜的保護(hù)基團(tuán)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。例如，參見(jiàn)《有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)》，M.Mcomie，editor，Plenum Press，NY，1973和US4,617,149。本文對(duì)此進(jìn)行了參考。
在選擇某一特定保護(hù)基團(tuán)時(shí)，必須考慮到某些條件。一個(gè)α-氨基保護(hù)基團(tuán)(1)必須使得α-氨基在發(fā)生連接反應(yīng)的情況下不具備功能活性，(2)必須在完成連接反應(yīng)之后，在不去掉側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)和不改變肽片段結(jié)構(gòu)的情況下易于去除，(3)必須排除在連接之前活化時(shí)的消旋可能性。一個(gè)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)(1)必須使得側(cè)鏈功能團(tuán)在連接反應(yīng)中不具備活性，(2)必須在去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)的條件下處于穩(wěn)定狀態(tài)，(3)必須是在不改變肽鏈結(jié)構(gòu)的反應(yīng)條件下完成所需氨基酸順序后易于去掉的。
已知可用于肽合成的這些保護(hù)基團(tuán)對(duì)于去除它們時(shí)所用試劑的反應(yīng)活性各不相同，這對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。例如，某些保護(hù)基團(tuán)，象三苯甲基和2-(對(duì)-聯(lián)苯基)異丙基氧羰基都非常不穩(wěn)定，在輕度酸性條件下即可被切割下來(lái)。其他保護(hù)基團(tuán)，象t-丁基氧羰基、t-戊基氧羰基、金剛石基氧羰基和p-甲氧芐氧基羰基都較穩(wěn)定，需要稍強(qiáng)的酸，象三氟乙酸、鹽酸或三氟化硼乙酸才能將它們?nèi)コ＿€有一些保護(hù)基團(tuán)，象芐氧基羰基、鹵芐氧基羰基、對(duì)硝基芐氧基羰基、環(huán)烷氧基羰基和異丙基氧羰基甚至更穩(wěn)定，要去除它們，需要更強(qiáng)的酸，象氟化氫、溴化氫或在三氟乙酸中的三氟乙酸硼。
當(dāng)所需肽順序合成完畢后，要將已保護(hù)的肽從樹脂支持物上切割下來(lái)，并且去掉所有的保護(hù)基團(tuán)。切割反應(yīng)和保護(hù)基團(tuán)的去除可以同時(shí)進(jìn)行或逐步進(jìn)行。如果樹脂支持物是一種氯甲基化的聚苯乙烯樹脂，將肽固定于該樹脂上的鍵則是一種C端部分的自由羰基與樹脂上存在的許多氯甲基中的一種之間形成的酯鍵。
應(yīng)當(dāng)指出，可以用已知能夠切割酯鍵和能夠透過(guò)樹脂的試劑使固定鍵分離。一種尤其方便的方法是用液態(tài)的無(wú)水氟化氫進(jìn)行處理。這種試劑不僅可以將肽從樹脂上分離下來(lái)，而且還可以去掉所有的保護(hù)基團(tuán)。因此，使用這種試劑可以直接得到完全脫保護(hù)的肽。如果需要分離下肽而不去掉保護(hù)基團(tuán)，可以將保護(hù)的肽-樹脂進(jìn)行甲醇分析，而得到C端羧基甲基化的被保護(hù)肽。然后可將甲酯在輕度堿性條件下進(jìn)行水解，得到自由C端羧基。之后可用一種強(qiáng)酸如液態(tài)氟化氫進(jìn)行處理，去掉肽鏈上的保護(hù)基團(tuán)。一種尤為有用的甲醇分析法見(jiàn)G.Moore等人，《肽》，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman和J.Meienhofer編，John Wiley，NY，1977，pp.518-521，該方法是，在冠醚的存在下，用甲醇和氰化鉀對(duì)已保護(hù)的肽-樹脂進(jìn)行處理。
另一種方法是通過(guò)氨解作用或通過(guò)用肼進(jìn)行處理將已保護(hù)的肽從樹脂上分離下來(lái)。如果需要，可以將得到的C端酰胺或肼水解成自由C端羧基，并且將保護(hù)基團(tuán)按常規(guī)去掉。
還應(yīng)當(dāng)指出的是，最好在將保護(hù)的肽從樹脂支持物上分離下的同時(shí)或之前，就把N端α-氨基上的保護(hù)基團(tuán)去掉。
也可以通過(guò)DNA重組技術(shù)制備本發(fā)明的胰島素類似物的A和B鏈。在制備過(guò)程中，使用現(xiàn)有的常規(guī)合成技術(shù)制備可編碼A或B鏈所需肽的核苷酸順序。這些方法一般包括，制備一些可用于編碼那些所需編碼順序的片段及其互補(bǔ)順序的寡核苷酸。所設(shè)計(jì)的寡核苷酸能夠?qū)⒁粋€(gè)編碼順序的片段和兩個(gè)互補(bǔ)順序的片段進(jìn)行重迭，并且反過(guò)來(lái)也這樣。將寡核苷酸配對(duì)，并且連接在一起，最后制得所需基因順序。
將該順序插到一個(gè)克隆載體的某個(gè)位置以使它所編碼的肽產(chǎn)物得以表達(dá)。一個(gè)合適的克隆載體至少含有一部分某種基因的表達(dá)控制順序。
還可以使用DNA重組方法，用一種胰島素原樣前體制備本發(fā)明胰島素類似物的A和B鏈。見(jiàn)Frank等，《多肽合成-結(jié)構(gòu)-功能》，Proc.7th Am.Pept.Symp.，Eds.D.Rich和E.Gross編(1981)，本文對(duì)此進(jìn)行了參考。
將不管怎樣制備的單個(gè)A鏈和B鏈結(jié)合在一起，可以采用Chance等人的方法，見(jiàn)Chance等，《多肽合成，結(jié)構(gòu)和功能第七屆美國(guó)肽專題論文集》，1981，本文對(duì)此進(jìn)行了參考。
下列實(shí)例作為對(duì)本發(fā)明的解釋，但不限制本發(fā)明。實(shí)例1 Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素A.用重組法制備A鏈通過(guò)DNA重組法制備人胰島素A鏈，即化學(xué)合成編碼A鏈的基因并使其在大腸桿菌中表達(dá)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是通過(guò)磷酸酯片段法，用各種三核苷酸合成10-15核苷酸長(zhǎng)度的合成片段以制備A鏈基因。這個(gè)基因具有EcoRI和BamHI限制性核酸內(nèi)切酶的單鏈粘性末端。將它插到一個(gè)含有β-半乳糖苷酶基因(β-gal)的適宜表達(dá)載體中，可得到一個(gè)使A鏈通過(guò)蛋氨酸密碼連接到β-半乳糖苷酶基因上的嵌合質(zhì)粒。最好用色氨酸合成酶基因(trpLE′)替代β-半乳糖苷酶基因作為啟動(dòng)子以達(dá)到更高水平的表達(dá)。將嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌內(nèi)以表達(dá)前體蛋白，即β-gal-met-A鏈(或當(dāng)使用色氨酸啟動(dòng)子系統(tǒng)時(shí)是trpLE′-met-A鏈)。在純化后用溴化氰對(duì)該前體蛋白進(jìn)行處理以切斷蛋氨酸鍵，得到人胰島素A鏈。通過(guò)氧化型亞硫酸解(sulfitolysis)可以得到S-磺化的A鏈，用它和下面所說(shuō)的B鏈(S-磺化)進(jìn)行結(jié)合。
有關(guān)人胰島素A鏈基因化學(xué)合成的全部詳細(xì)情況見(jiàn)Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 755765-5769，1978以及該文所引用的參考文獻(xiàn)。本文參考了這些文獻(xiàn)。有關(guān)人胰島素A鏈的化學(xué)合成基因在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的全部詳細(xì)資料見(jiàn)Goeddel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76101-110，1979以及該文中所引用的參考文獻(xiàn)。本文對(duì)此進(jìn)行了參考。B.制備B鏈類似物〔Lys(B28)，Pro(B29)〕使用Applied Biosystems公司的430A型肽合成儀(包括軟件轉(zhuǎn)換1.4)來(lái)制備粗制肽基樹脂。使用0.5毫摩爾(mmol)的起始固相樹脂(t-BOC-Thr(Bzl)OCH2Pam樹脂)(0.76mmol/g×0.658g)。所使用的全部氨基酸用BOC進(jìn)行保護(hù)，而且除谷氨酸和組氨酸外，所有氨基酸可以在買來(lái)后直接使用(也就是Applied Biosystems公司的儲(chǔ)存管，每個(gè)儲(chǔ)存管容有大約2mmol的保護(hù)氨基酸)。從國(guó)際肽公司(peptides International Corporation)得到谷氨酸和組氨酸，并將它們轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存管中，使每個(gè)儲(chǔ)存管容有大約2mmol的所需保護(hù)氨基酸。將粗制肽基樹脂干燥(在真空室溫下過(guò)夜)后，測(cè)定其重量，并與起始重量比較以確定合理的重量增值。取一小部分樣本進(jìn)行氨基酸分析，以確保所要的氨基酸是以正確數(shù)量加入的。
通過(guò)在含有10份(V/W)HF(含有5％V/V乙硫醇和5％V/V間甲酚)和1份肽基樹脂的溶液中在0℃下攪拌大約1小時(shí)，將肽從肽基樹脂上分離下來(lái)并去除對(duì)側(cè)鏈的保護(hù)。利用真空將大部分HF去掉后在乙醚中使肽沉淀。用乙醚沖洗幾次后進(jìn)行真空過(guò)濾，將肽溶于大約200ml的含有0.1M Tris，0.1MNa2SO3和0.01M Na2S4O6的7M去離子尿素中。用5NNaoH將溶液pH調(diào)至8.5，并在4℃下有力地?cái)嚢柽^(guò)夜。
在室溫下將得到的S-磺化肽溶液置于一個(gè)5×215cm的Sephadex G-25柱(細(xì))上。用50mM碳酸氫銨在室溫下以20ml/分的速度洗脫樣品。在276nm監(jiān)測(cè)流出液。收集20ml的組分，合并所需組分，如下面所述用高效液相層析(HPLC)進(jìn)一步純化。
將所需組分的合并液抽到2.5×30cm DupontC8，9-12μm HPLC的柱上，并在室溫下用在100mM碳酸氫銨中含有以線性梯度增加的乙腈的溶液洗脫(2.6ml/min)。在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出液。收集25ml的組分。用分析型HPLC對(duì)選擇組分進(jìn)行分析，確定哪些組分需要保留。合并所需組分并凍干，以便在與上述制備的A鏈結(jié)合時(shí)使用。C.制備Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素用上述Chance等人的方法將A和B鏈進(jìn)行結(jié)合。在環(huán)境溫度下，分別將700mg的DNA重組法制備的A鏈S-磺化物和140mg合成的Lys(B28)，Pro(B29)B鏈S-磺化物(二者都如上述得到)分別溶于70ml和14ml0.1M甘氨酸緩沖液中。用5N NaOH將每個(gè)緩沖液調(diào)至pH10.5，然后冷卻到5℃。在環(huán)境溫度下，在0.1M甘氨酸緩沖液中以10.5mg/ml濃度制備6ml的二硫蘇糖醇(DTT)溶液，并用5N NaOH調(diào)至pH10.5，然后冷卻到5℃。
將A和B鏈溶液混合，然后快速加入5.21ml DTT溶液(SH/SSO3-＝0.90)。將反應(yīng)液在敞開的200ml玻璃離心瓶中在5℃下攪拌2.5小時(shí)。再加入45ml冰乙酸并將該溶液在5℃放置過(guò)夜。
將得到的沉淀混合物在5℃下以2000rpm離心20分鐘。將上清液和沉淀物的1M乙酸洗滌液混合，在5℃下置于在1M乙酸中的5×200cm SephadexG-50(超細(xì))柱上，靠重力洗脫。在三天內(nèi)收集20分鐘的組分。在276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)組分，有些則用分析型HPLC分析。將含有胰島素類似物L(fēng)ys(B28)，Pro(B29)順序的組分合并，凍干后得到125mg樣品。通過(guò)反相HPLC將此樣品進(jìn)一步純化(使用2.12×25cm Du-pont C8柱，在室溫下以2.6ml/分的速度，用0.1MNaH2PO4中含有以線性梯度增加的乙腈的pH2.2溶液洗脫)。在276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出液。將選擇的組分用分析型HPLC進(jìn)行測(cè)定。合并所需組分，并用下述的pH7的HPLC進(jìn)一步純化。
將低pH HPLC制備中的合并液用0.1M(NH4)2HPO4在冰浴中稀釋大約2倍。用冷卻的2N NaOH在冰浴中將pH調(diào)至7。使用低pH制備中所用的相同條件，將該樣品置于同樣的HPLC柱上洗脫，只是洗脫緩沖液改為0.1M pH7(NH4)2HPO4/乙腈。
將在pH7HPLC制備中的合并液在冰浴中冷卻，并用0.1％三氟乙酸水溶液(TFA)將其稀釋2倍。加入1N HCl(冷的，將樣品置于冰浴中)使pH降至3。將該樣品置于Vydac C4或Dupont C8 HPLC柱上(2.12×25cm)，并用乙腈濃度以線性梯度增加的0.1％TFA水溶液洗脫。在214nm波長(zhǎng)下或276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出液。合并所需組分并凍干，經(jīng)過(guò)反相HPLC純化，得到41mg所需類似物，純度大于97％。實(shí)例2 Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素第二種制備Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素的方法是使用酶促半合成法(反向蛋白水解法)，用一種合成的八肽與缺八肽胰島素(A1-21-B1-22)結(jié)合。該缺八肽胰島素可通過(guò)將天然豬或人胰島素用胰蛋白酶消化而獲得。有關(guān)描述見(jiàn)Bromer和Chance“缺八肽胰島素的制備和特征”，Biochim.Biophys.Acta133219-223(1967)，本文對(duì)此進(jìn)行了參考。通過(guò)上述的自動(dòng)固相合成方法可制備合成八肽，Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr。
將缺八肽胰島素(435mg)和465mg合成的Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr在15ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇(1，4-butanediol)和1份0.25M pH7.3的Tris乙酸鹽緩沖液的溶液中結(jié)合。通過(guò)在電爐上加熱溶液使多肽完全溶解。然后在37℃保溫該溶液，加入90mg豬胰蛋白酶。在37℃下不時(shí)地?cái)嚢柙撊芤?0分鐘。向溶液中加入135ml0.05N HCl以終止該反應(yīng)。
將含有類似物的酸化溶液置于一個(gè)2.5×25cm C8Zorbax HPLC柱上，用乙腈濃度呈線性梯度增加的0.1M磷酸二氫鈉pH2.2緩沖液洗脫，以純化本實(shí)例的胰島素類似物。在276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出液。合并所需組分，用水稀釋2倍，然后置于1×25cm C8 Ultrasphere HPLC柱上。用乙腈濃度呈線性增加的0.5％TFA水溶液洗脫胰島素類似物。在276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出物。再合并所需組分并凍干，得到125mg的純胰島素類似物。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)來(lái)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5809.2(理論值5808.7)用VG-ZAB-25E雙聚焦質(zhì)譜儀在大約1500的分辨率下進(jìn)行快速原子轟擊——質(zhì)譜分析測(cè)定。將人胰島素類似物溶于由甘油和含草酸的硫甘油組成的混合溶液中。用碘化銫進(jìn)行從m/z5300到m/z6500的磁掃描以校準(zhǔn)該儀器。所測(cè)得數(shù)據(jù)以平均值+1表示。實(shí)例3 Aba(B28)，Pro(B29)人胰島素在含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25MTris pH7.3緩沖液的13ml溶液中，在37℃下將豬缺八肽胰島素(384mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba-Pro-Thr(362mg)結(jié)合。加入豬胰蛋白酶75mg。充分混合該溶液，并于37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)將該混合液加到137ml 0.05N HCl中終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C8 Zorbax柱子上，并用含有低(shallow)乙腈梯度的0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的適當(dāng)?shù)慕M分，用水稀釋2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液從該柱子中對(duì)脫鹽蛋白進(jìn)行洗脫。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干，得到59mg胰島素類似物。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)來(lái)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5765.7(理論值5765.6)實(shí)例4 Ala(B28)，Pro(B29)人胰島素在10ml含有1份二甲亞砜、2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中，在37℃下使豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr(310mg)結(jié)合。加入豬胰蛋白酶60mg。將該溶液充分混合，并在3 7℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)將該反應(yīng)液加到90ml0.05N HCl中終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上，用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純胰島素類似物的組分并凍干得到43mg。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5752.3(理論值5751.6)實(shí)例5 Arg(B28)，Pro(B29)人胰島素在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中，于37℃下使豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro-Thr(310mg)結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(60mg)。將該溶液充分混合，并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)將該混合液加到90ml0.05N HCl中終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純胰島素類似物的組分并凍干得到103mg。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)來(lái)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5836.1(理論值5836.7)實(shí)例6 Asn(B28)，Pro(B29)人胰島素在14ml含有1份二甲亞砜、2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中，在37℃下使豬缺八肽胰島素(409mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro-Thr(398mg)結(jié)合。加入豬胰蛋白酶81mg。將該溶液充分混合并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該混合溶液加到136ml 0.05N HCl中終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.5％三氟乙酸溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到56mg。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5794.7(理論值5794.6)實(shí)例7 Asp(B28)，Pro(B29)人胰島素在13ml含有l(wèi)份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中，在37℃下使豬缺八肽胰島素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr(388mg)結(jié)合。加入豬胰蛋白酶78mg。將該溶液充分混合并在37℃不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該混合溶液加到137ml 0.05N HCl中終止其反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zobax柱子上，并用含有低乙腈梯度的0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的適當(dāng)?shù)慕M分，用水稀釋4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用含有乙腈梯度的0.1％三氟乙酸溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到85mg。通過(guò)氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5795.7(理論值5795.6)實(shí)例8 Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素A.制備Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素B鏈?zhǔn)褂肁pplied Biosystems公司的430A型肽合成儀(包括軟件轉(zhuǎn)換1.4)來(lái)制備粗制肽基樹脂。使用0.5mmol的起始固相樹脂(t-BOC-Thr(Bzl)OCH2Pam樹脂)(0.72mmol/g×0.705g)。所用全部氨基酸用BOC保護(hù)，除谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸外，所有氨基酸可以在買來(lái)后直接使用(也即Applied Biosystems公司的儲(chǔ)存管；每個(gè)儲(chǔ)存管含有大約2mmol的保護(hù)氨基酸)。從商業(yè)上得到谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸，并轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存管中，使每個(gè)儲(chǔ)存管含有大約2mmol的所需保護(hù)氨基酸。將粗制肽基樹脂在真空室溫下干燥過(guò)夜，并將其重量與起始重量加以比較以確定合理的重量增值。取一小部分樣品進(jìn)行氨基酸分析以保證所需氨基酸是以正確比例加上的。
通過(guò)將10份(V/W)HF(含有5％V/V對(duì)硫甲酚和5％V/V間甲酚)和1份肽基樹脂一起在0℃下攪拌約1小時(shí)，把肽從肽基樹脂上分離下來(lái)，并去除對(duì)側(cè)鏈的保護(hù)。通過(guò)真空將大部分HF去除后使肽在乙醚中沉淀。用乙醚沖洗幾次后經(jīng)真空過(guò)濾，然后將肽溶于大約120ml含有0.1M Tris，35mg/ml Na2SO3和25mg/ml Na2S4O6的8M鹽酸胍pH11溶液中。用5N NaOH將該溶液調(diào)至pH8.8，并在室溫下有力地?cái)嚢?小時(shí)。
將得到的S-磺化肽溶液在室溫下置于5×215cm的Sephadex G-25柱子上(中等)。用50mM碳酸氫銨在室溫下以21ml/分的速度洗脫該樣品。在276nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)流出液。收集每25ml一份的組分，將所需組分匯集在一起用下述高效液相色譜分析(HPLC)進(jìn)一步純化。
把收集的所需組分抽到2.5×30cm DuPont C8，9-12μ HPLC柱子上，并且用乙腈以線性梯度增加的100mM碳酸氫銨在室溫下洗脫(2.6ml/分)。在280nm下監(jiān)測(cè)流出液。收集25ml一份的組分。對(duì)所選擇的組分進(jìn)行分析型HPLC分析以確定哪部分需要保留。將所需組分合并在一起并凍干，以用于下一步與A鏈的結(jié)合。B.使Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素B鏈和人胰島素A鏈結(jié)合用上述Chance等人的方法進(jìn)行A和B鏈的結(jié)合。在環(huán)境溫度下將2g的DNA重組法得到的A鏈S-磺化物和400mg合成的Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)B鏈S-磺化物分別溶于200ml和40ml的0.1M甘氨酸緩沖液中，用5N NaOH將每個(gè)溶液調(diào)至pH10.5，然后冷卻至5℃。在環(huán)境溫度下用0.1M甘氨酸緩沖液制備濃度為15.5mg/ml的DTT溶液，用5N NaOH調(diào)至pH10.5，然后冷卻至5℃。
將A和B鏈溶液進(jìn)行結(jié)合，然后快速加入15.9ml DTT溶液(SH/SSO3-＝1.0)。在4℃下于一個(gè)敞開的200ml玻璃離心瓶中將該溶液攪拌19.6小時(shí)。加入冰乙酸(129ml)，并將該溶液在4℃下放置1小時(shí)。
將得到的沉淀混合物在4℃下以2000rpm離心30分鐘。取上清液與292ml的milli-Q水和73ml乙腈混合，并通過(guò)反相HPLC(用2.5×30cm Vydac C18柱子，在室溫下用0.1M NaH2PO4中乙腈以線性梯度增加的pH2.1的溶液以2.6ml/分的速度洗脫)進(jìn)一步純化。在280nm下監(jiān)測(cè)流出液。用分析型HPLC對(duì)所選擇組分進(jìn)行測(cè)定，合并所需組分，用0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液稀釋2倍，然后置于Ultrasphere octyl HPLC柱(1.0×25cm)，用含乙腈線性梯度增加的0.1％TFA水溶液洗脫，在280nm下監(jiān)測(cè)流出液。用分析型HPLC對(duì)所選擇組分進(jìn)行測(cè)定，合并所需組分，用上述同樣的柱子和條件，只是乙腈的梯度略有不同，進(jìn)行再純化。合并合適的組分并凍干，得到65mg胰島素類似物，通過(guò)反相HPLC得到的純度大于93％。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5786.1(理論值5786.7)實(shí)例9 Cya (B28)，Pro(B29)人胰島素用過(guò)甲酸氧化將八肽中的半胱氨酸轉(zhuǎn)化成磺基丙氨酸。在一個(gè)冰冷卻的瓶子中，將合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cys-Pro-Thr(363mg)溶于36ml新制備的過(guò)甲酸中，并輕輕攪拌1小時(shí)。用水將氧化物稀釋10倍并凍干。該凍干物用于半合成過(guò)程。
在37℃下將缺八肽豬胰島素(222mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Cya-Pro-Thr(225mg)在18ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶45mg。充分混合該溶液，并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
將該反應(yīng)液加到242ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。把全部溶液置于一個(gè)21×250mm C-8 Zorbax柱子上，用0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液中含有低乙腈梯度的溶液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的適當(dāng)?shù)慕M分，用水稀釋2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到16mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5831.5(理論值5831.7)實(shí)例10 GIn(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下使豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gln-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(60mg)。充分混勻該溶液并在37℃下不時(shí)攪拌60分鐘。
把反應(yīng)液加到90ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉pH2緩沖液中含有低乙腈梯度的溶液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，然后抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到87mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5809.4(理論值5808.6)實(shí)例11 Glu(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下使缺八肽豬胰島素(402mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr(398mg)在14ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(80mg)。充分混勻該溶液并在37℃下不時(shí)攪拌120分鐘。
將反應(yīng)液加到136ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到59mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5809.6(理論值5809.6)實(shí)例12 Gly(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(412mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr(376mg)在13ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(79mg)。充分混勻該溶液，并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?80分鐘。
將該反應(yīng)液加到147ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子上洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到11mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5737.2(理論值5737.6)實(shí)例13 His(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-His-Pro-Thr(398mg)在13ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(79mg)。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)將該反應(yīng)液加到237ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。把全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到79mg。用氨基酸(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5816.9(理論值5817.7)實(shí)例14 Ile(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(409mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ile-Pro-Thr(398mg)在13ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(81mg)。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到136ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C8 Zorbax柱子上。并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，然后抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到57mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5793.7(理論值5793.7)實(shí)例15 Leu(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(418mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Leu-Pro-Thr(410mg)在14ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合，加入豬胰蛋白酶(83mg)。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到136ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到74mg，用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5793.8(理論值5793.7)實(shí)例16 Nle(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nle-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(60mg)。充分混合該溶液，并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)將該反應(yīng)液加到90ml0.05N HCl中以終止反應(yīng)。把整個(gè)溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分得到54mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5794.6(理論值5793.7)實(shí)例17 D-Lys(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(392mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-D-Lys-Thr(387mg)在13.5ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶78mg。充分混合該溶液并在37℃不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把反應(yīng)液加到136.5ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將整個(gè)溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到94mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5809.0(理論值5808.7)實(shí)例18 Met(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(350mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Met-Pro-Thr(366mg)在12ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶71mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)攪拌120分鐘。
此時(shí)將反應(yīng)液加到118ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上。并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到72mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5811.8(理論值5811.7)實(shí)例19 Orn(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃將豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Orn-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶60mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到90ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將整個(gè)溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到89mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5795.2(理論值5794.7)實(shí)例20 Phe(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(290mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Phe-Pro-Thr(310mg)在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶60mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到90ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到17mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5827.9(理論值5827.7)實(shí)例21 Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(339mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Pro-Thr(363mg)在9ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶(70mg)。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?0分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到108ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到10×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到10×250mm C-8 Ultrasphere柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到97mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5778.6(理論值5777.6)實(shí)例22 Ser(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(412mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ser-Pro-Thr(390mg)在13ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶80mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到137ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到37mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5768.1(理論值5767.6)實(shí)例23 Thr(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(437mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Thr-Pro-Thr(420mg)在14.5ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M TrispH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶86mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到135.5ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用一種0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到78mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5781.9(理論值5781.6)實(shí)例24 Trp(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(310mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Trp-Pro-Thr(325mg)在10.5ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M TrispH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合，加入豬胰蛋白酶64mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把反應(yīng)液加到140ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到47mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5866.2(理論值5866.7)實(shí)例25 Tyr(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(391mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Tyr-Pro-Thr(400mg)在13ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶79mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)將該反應(yīng)液加到137ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到30mg。用氨基酸分鐘(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5843.7(理論值5843.7)實(shí)例26 Val(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽胰島素(400mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Val-Pro-Thr(383mg)在12ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶78mg。充分混合該溶液并在37℃下不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到238ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋4倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.1％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并涼干得到74mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5780.0(理論值5779.6)實(shí)例27 Nva(B28)，Pro(B29)人胰島素在37℃下將豬缺八肽豬島素(292mg)和合成八肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Nva-Pro-Thr(279mg)在10ml含有1份二甲亞砜，2份1，4-丁二醇和1份0.25M Tris pH7.3緩沖液的溶液中結(jié)合。加入豬胰蛋白酶57mg。充分混合該溶液并在37℃不時(shí)地?cái)嚢?20分鐘。
此時(shí)把該反應(yīng)液加到240ml0.05N HCl中以終止該反應(yīng)。將全部溶液抽到21×250mm C-8 Zorbax柱子上，并用0.1M磷酸二氫鈉中含有低乙腈梯度的pH2緩沖液洗脫該產(chǎn)物。
合并用分析型HPLC確定的合適的組分，用水稀釋2倍，并抽到25×300mm C-18 Vydac柱子上。用0.5％三氟乙酸中含有乙腈梯度的溶液從柱子中洗脫去鹽蛋白。合并含有純化胰島素類似物的組分并凍干得到51mg。用氨基酸分析(表I)和質(zhì)譜分析(MS)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。
MS5780.0(理論值(5779.6)實(shí)例28用前面所述方法，制備下列其他胰島素類似物(a)Asp(B1)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(b)脫(Phe-B1)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(c)脫(Phe-B1)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(d)脫(Phe-B1，Val-B2)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(e)脫(Phe-B1，Val-B2)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(f)Gly(A21)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(g)Ala(A21)，Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(h)脫(Thr-B30)，Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素(i)Asp(B10)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰島素(j)Ala(A21)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰島素(k)Asp(B1)，Arg(B28)，Pro(B29)人胰島素實(shí)例29 Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素重組載體和宿主的構(gòu)建A.質(zhì)粒pCZR126S的構(gòu)建1.分離質(zhì)粒pKC283以保藏號(hào)NRRL-B15830從Peoria，Illinois61604，北部地區(qū)研究室得到大腸桿菌K12BE1201/pKC283的親液膠體。將該親液膠體倒入含有10ml LB基質(zhì)(10g Bacto-胰蛋白陳5g Bacto-酵母膏和10gNaCl/升；調(diào)至pH7.5)的試管中，并在32℃下保溫2小時(shí)，此時(shí)在培養(yǎng)液中加入50μg/ml氨芐青霉素，然后在32℃下保溫過(guò)夜。因?yàn)榇竽c桿菌K12BE1201/pKC283細(xì)胞中含有一個(gè)整合在細(xì)胞DNA中的溫度敏感型cI阻遏物基因，將該細(xì)胞在32℃下進(jìn)行培養(yǎng)。如果在此質(zhì)粒分離過(guò)程中使用含有野生型λpL阻遏物基因或不含有λpL啟動(dòng)子的細(xì)胞，則如下面的實(shí)例所述，保溫溫度是37℃。
取一小部分過(guò)夜的培養(yǎng)液，將它置于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB-瓊脂(帶有15g/lBacto-瓊脂的LB基質(zhì))平板上，以得到大腸桿菌K12BE1201/pKC283的單菌落分離物。將得到的單菌落接種到10ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB基質(zhì)中，并在32℃有力震動(dòng)下保溫過(guò)夜。將10ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種到500ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB基質(zhì)中，并在32℃有力震動(dòng)下保溫直至該培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期。
下述方法是Maniatis等的修改方法(1982，Molecular Cloning，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。
在4℃下以4000g離心10分鐘以收集細(xì)胞，并去除上清液。將細(xì)胞沉淀物在100ml冰冷的STE緩沖液(0.1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.8，1mM EDTA)中洗滌。洗滌之后，將細(xì)胞沉淀物再懸浮于10ml含有5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM葡萄糖；25mM Tris-HCl pH8.0，和10mM EDTA)中，并于室溫下放置10分鐘。然后將20ml溶液2(0.2N NaOH和1％SDS)加到溶菌酶處理過(guò)的細(xì)胞溶液中，并通過(guò)倒置輕輕地混合該溶液。將該混合液在冰上保溫10分鐘。
將15ml冰冷的5M乙酸鉀pH4.8加到溶解細(xì)胞的混合液中，并通過(guò)倒置混合該溶液。把該溶液置于冰上保溫10分鐘。將11.5ml冰乙酸加到28.5ml水和60ml5M乙酸鉀中，以制備5M乙酸鉀溶液；所得到的溶液有3M的鉀和5M乙酸。
將溶解細(xì)胞混合液用Beckman SW27(或其等同物)在4℃以20,000rpm離心20分鐘。細(xì)胞DNA和碎片在試管的底部形成沉淀。回收到36ml上清液，加入0.6體積的異丙醇，混勻，將所得到的溶液置于室溫下15分鐘。通過(guò)在室溫下以12,000g離心30分鐘收集質(zhì)粒DNA。去除上清液，用70％乙醇在室溫下洗滌該DNA沉淀。傾析乙醇沖洗物，并將沉淀在真空干燥器中進(jìn)行干燥。再將沉淀懸浮于8ml TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。
將8g氯化銫(CsCl)加到DNA溶液中。在每10mlCsCl-DNA溶液中加入約0.8ml 10mg/ml的溴化乙錠水溶液。該溶液最終濃度是大約1.55g/ml，而溴化乙錠的濃度大約是600μg/ml。將該溶液轉(zhuǎn)移到Beckman Type50的離心管中，用石蠟油裝滿，密封，在20℃以45,000rpm離心24小時(shí)。離心之后，在正常光線下可看到兩個(gè)DNA帶。去掉離心管的蓋，用帶21號(hào)皮下注射針頭的注射器插入離心管的側(cè)壁取出下面的DNA帶。
用水飽和的丁醇經(jīng)過(guò)幾次提取去除溴化乙錠。通過(guò)TE緩沖液透析去除氯化絕。用緩沖酚提取后，再用氯仿提取，然后用70％乙醇沉淀和洗滌，并干燥。得到大約1mg的質(zhì)粒pKC283，然后以大約1μg/μl的濃度在4℃下儲(chǔ)存于TE緩沖液中。附圖1給出了質(zhì)粒pKC283的切割位點(diǎn)和功能圖。
2.構(gòu)建質(zhì)粒pKC283PX將大約10μl實(shí)例1中制備的質(zhì)粒pKC283DNA與20μl10X基質(zhì)鹽限制緩沖液(500mM NaCl；100mMTris-HCl pH7.5；100mM MgCl2；和10mMDTT)，20μl1mg/mlBSA，5μl限制酶PvuII(～50單位，由Bethesda Research Laboratories(BRL)定義，這里所用的全部限制酶都來(lái)自該公司)和145μl水混合。將所得到的反應(yīng)液在37℃下保溫2小時(shí)。通過(guò)常規(guī)的酚和氯仿提取終止這里所說(shuō)的限制酶反應(yīng)，接著使DNA沉淀，用乙醇沖洗，然后再將DNA懸浮于TE緩沖液中。如上所說(shuō)的PvuII消化終止之后，使PvuII消化的質(zhì)粒pKC283DNA沉淀，并將它再懸浮于5μl的TE緩沖液中。
在含有10μl5×激酶緩沖液(300mM Tris-HCl，pH7.8；50mM MgCl2和25mM DTT)，5μl5mM ATP，24μl水，0.5μl的T4多核苷酸激酶(按P-L Biochemicals公司的規(guī)定大約為2.5單位)，5μl1mg/ml BSA，和5μl 10mM亞精胺的混合液中，通過(guò)在37℃下使該混合液與大約600微微(10-12)摩爾(pM)的Xho I人工接頭(5′-CCTCGAGG-3′)保溫30分鐘而使之激活。
將大約12.5μl激活的XhoI人工接頭加到5μl PvuII消化的質(zhì)粒pKC283 DNA中，然后向DNA中加入2.5μl10X連接酶緩沖液(300mM Tris-HCl，pH7.6；100mM MgCl2；和50mM DTT)，2.5μl 1mg/ml BSA，7μl5mM ATP，2.5μl(按P-LBiochemicals公司的定義大約為2.5單位)T4 DNA連接酶，2.5μl10mM亞精胺，和3μl水。所產(chǎn)生的連接反應(yīng)液在4℃下保溫過(guò)夜。連接反應(yīng)之后，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液使之具有高鹽緩沖液的成分(0.1M NaCl；0.05M Tris-HCl pH7.5；10.0mM MgCl2；和1mM DTT)。將大約10μl(100單位)限制酶XhoI加到混合液中，然后使得到的反應(yīng)液在37℃下保溫2小時(shí)。
終止該反應(yīng)，如上所述使XhoI消化的DNA沉淀，再懸浮和連接，只是不向連接混合液中加入XhoI人工接頭。連接的DNA構(gòu)成了所需要的質(zhì)粒pKC283PX。附圖2給出了質(zhì)粒pKC283PX的切割位點(diǎn)和功能圖。
3.構(gòu)建大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283PX以保藏號(hào)NRRL B-15993從北部地區(qū)研究室可得到凍干形式的大腸桿菌K12MO(λ+)。大腸桿菌K12MO(λ+)中含有野生型λPLcI阻遏物基因，因此在大腸桿菌K12MO(λ+)細(xì)胞中不會(huì)發(fā)生來(lái)自本發(fā)明雜交pL-lpp啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。重新構(gòu)造親液膠體，分離MO(λ+)的單個(gè)菌落，用基本上與實(shí)例29A1一致的方法制備10ml MO(λ+)細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物，不同的只是保溫溫度是37℃，以及在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒(méi)有使用氨芐青霉素。
用50μl的過(guò)夜培養(yǎng)液接種5ml也含有10mM MgSO4和10mM MgCl2的LB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37℃有力震動(dòng)下保溫過(guò)夜。第二天早晨，用含有10mM MgSO4和10mMMgCl2的LB基質(zhì)將培養(yǎng)物稀釋到200ml。將稀釋的培養(yǎng)物在37℃并有力震動(dòng)下進(jìn)行保溫，直至在550nm(A550)下的吸收率大約是0.5為止，此時(shí)表明細(xì)胞密度為大約1×108個(gè)細(xì)胞/ml。在冰水浴中將培養(yǎng)物冷卻10分鐘，然后在4℃下以4000g離心10分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物再懸浮于100ml的冷卻10mM MgSO4中，并立即通過(guò)離心使之再沉淀。將該細(xì)胞沉淀物再懸浮于100ml的30mM CaCl2中并在冰上保溫20分鐘。
通過(guò)離心再次收集細(xì)胞，并再懸浮于10ml的30mMCaCl2中。將0.5ml等分的細(xì)胞加到實(shí)例29A2中制備的連接DNA中；而該DNA已制備成30mM CaCl2的濃度。將細(xì)胞-DNA混合液在冰上保溫1小時(shí)，在42℃下加熱震蕩90秒，然后在冰上冷卻大約2分鐘。將細(xì)胞-DNA混合液在125ml瓶子中稀釋于10ml LB基質(zhì)中，并在37℃下保溫1小時(shí)。取100μl等分的培養(yǎng)液置于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37℃下保溫直至菌落出現(xiàn)。
將這些菌落單個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)限制酶分析和凝膠電泳對(duì)單個(gè)菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢查。用實(shí)例29A1的方法在較小水平上進(jìn)行質(zhì)粒DNA分離，但省去氯化銫梯度步驟，直至識(shí)別出所需的大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283PX轉(zhuǎn)化體。附圖2給出了質(zhì)粒pKC283PX的切割位點(diǎn)和功能圖。
4.構(gòu)建大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283-L將10μg實(shí)例29A1的方法制備的質(zhì)粒pKC283PXDNA溶于20μl10X高鹽緩沖液，20μl1mg/mlBSA，5μl(～50單位)限制酶BglII，5μl(～50單位)限制酶XhoI和150μl水當(dāng)中。將所產(chǎn)生的反應(yīng)液在37℃保溫2小時(shí)。終止該反應(yīng)，使BglII-XhoI消化的DNA沉淀，再將DNA懸浮于5μl的TE緩沖液中。
合成一個(gè)帶有BglII和XhoI限制酶切割特征的單鏈DNA末端的DNA人工接頭，并使之激活。用與實(shí)例29A2基本一致的方法激活該人工接頭。該DNA人工接頭具有下面的結(jié)構(gòu)5′-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3′||||||||||||||||||3′-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5′用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法從單鏈脫氧低聚核苷酸合成上述人工接頭?？梢杂檬惺劭傻玫膬x器合成單鏈脫氧寡核苷酸，如由AppliedBiosystems公司出售的380A型合成儀(850LincolnCentre Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)，它利用了氨基磷酸化學(xué)的機(jī)理。其他一些DNA合成法在現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的。對(duì)于用常規(guī)修改的磷酸酯方法合成單鏈DNA的描述見(jiàn)Itakura等，1977，Science 1981056和Crea等，1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA755765。另外一種優(yōu)選合成DNA的方法見(jiàn)Hsiung等，1983，Nucleic Acid Research 1133227和Narang等，1980，Methods in Enzymology 6890。
用基本上與實(shí)例29A2一致的方法將人工接頭和BglII-XhoI消化的質(zhì)粒pKC283PX進(jìn)行連接。連接的DNA構(gòu)成所需要的質(zhì)粒pKC283-L。附圖3給出了質(zhì)粒pKC283-L的切割位點(diǎn)和功能圖。用質(zhì)粒pKC283-L DNA來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12MO(λ+)，并用與實(shí)例29A3基本一致的方法識(shí)別所得到的大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283-L轉(zhuǎn)化體。
5.大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283-LB的構(gòu)建將基本上按實(shí)例29A1方法制備的約10μg質(zhì)粒pKC283-L DNA溶于20μl10X高鹽緩沖液，20μl1mg/ml BSA，5μl(～50單位)限制性內(nèi)切酶XhoI和155μlH2O中，得到的反應(yīng)液在37℃保溫2小時(shí)。然后加入3倍體積的95％乙醇和1/10體積的3M乙酸鈉，從該反應(yīng)混合物中沉淀XhoI消化的質(zhì)粒pKC283-L DNA，在于冰-乙醇浴中保溫5分鐘，離心分離。用70％的乙醇洗滌得到的DNA沉淀，干燥后再懸浮在2μl10X缺口轉(zhuǎn)譯緩沖液(0.5M Tris-HClpH7.2；0.1M MgSO4；1mM DTT)，1μl脫氧核苷三磷酸各為2mM的溶液，15μl H2O，1μl(～6個(gè)P-L Biochemicals公司定義的單位)Klenow(大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段)以及1μl的1mg/mlBSA中。得到的反應(yīng)液在25℃保溫30分鐘；再在70℃保溫該溶液5分鐘以停止反應(yīng)。
使BamHI人工接頭(5′-CGGGATCCCG-3′)激活，基本上按實(shí)例29A2的方法與XhoI消化并經(jīng)Klenow處理的質(zhì)粒pKC283-L DNA相連接。連接反應(yīng)后，在37℃，在高鹽緩沖液中，用約100單位BamHI消化DNA約2小時(shí)。BamHI消化后，制備基本上按實(shí)例29A2方法連接用的DNA。
基本上按實(shí)例29A2和29A3的方法，通過(guò)連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12MO(λ+)中，使～5.9Kb BamHI限制性片段環(huán)化。鑒定大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283-LB轉(zhuǎn)化體，然后基本上按實(shí)例29A1的方法制備質(zhì)粒pKC283-LBDNA。質(zhì)粒pKC283-LB的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖4所示。
6.大腸桿菌K12MO(λ+)/pL32的構(gòu)建在高鹽緩沖液中，用限制性內(nèi)切酶SalI消化約10μg質(zhì)粒pKC283PX，用Klenow處理，基本上按實(shí)例29A5的方法與EcoRI人工接頭(5′-GAGGAATTCCTC-3′)連接，只是所用的起始質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶和人工接頭不同。用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化以切下～2.1Kb的DNA，通過(guò)連接使～4.0Kb EcoRI限制性片段環(huán)化以產(chǎn)生質(zhì)粒pKC283PRS?；旧习磳?shí)例29A3的方法將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12MO(λ+)。鑒別出大腸桿菌K12MO(λ+)/pKC283PRS轉(zhuǎn)化體以后，基本上按實(shí)例29A1的方法制備質(zhì)粒pKC283PRS DNA。質(zhì)粒pKC283PRS的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖5所示。
在含限制性內(nèi)切酶PstI和SphI各50單位的200μl高鹽緩沖液中消化約10μg質(zhì)粒pKC283PRS。在37℃保溫反應(yīng)液約2小時(shí)，然后在～130V、～75mA，在Tris-乙酸鹽緩沖液中，使反應(yīng)混合物在0.6％低膠凝溫度瓊脂糖(FMCCorporation，Marine Colloids Division，Rockland，Maine04841)中電泳2-3小時(shí)。
在溴化乙錠稀溶液中使凝膠染色，用長(zhǎng)波紫外光檢測(cè)構(gòu)成～0.85Kb PstI-SphI限制性片段的DNA帶，并將其從凝膠中切下。由該切段的重量和密度測(cè)出該切段的體積，將等體積pH7.6的10mM Tris-HCl加到含有該切段的管中。然后在72℃保溫使該切段熔化?？芍频皿w積為100μl，約1μg質(zhì)粒pKC283PRS的～0.85Kb PstI-SphI限制性片段。用類似的方法，用限制性內(nèi)切酶PstI和SphI消化質(zhì)粒pKC283-LB，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離得到～3.0Kb限制性片段，并制備用于連接的產(chǎn)物。
基本上按實(shí)例29A2的方法將質(zhì)粒pKC283PRS的～0.85Kb PstI-SphI限制性片段與質(zhì)粒pKC283-LB的～3.0Kb PstI-SphI限制性片段相連接。連接的DNA構(gòu)成所要的質(zhì)粒pL32。質(zhì)粒pL32的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖6所示?；旧习磳?shí)例29A3的方法將質(zhì)粒pL32轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12MO(λ+)細(xì)胞中?；旧习磳?shí)例29A1的方法，由大腸桿菌K12MO(λ+)/pL32轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒pL32DNA。質(zhì)粒pL32DNA的分析結(jié)果證明，有多個(gè)EcoRI人工接頭與Klenow處理的質(zhì)粒pKC283PX的SalI端相連接。多個(gè)EcoRI人工接頭的存在不會(huì)影響質(zhì)粒pL32的效用或質(zhì)粒pL32的衍生物，并可通過(guò)XhoI限制性位點(diǎn)的存在(每當(dāng)2個(gè)EcoRI人工接頭連在一起時(shí)就產(chǎn)生該位點(diǎn))而進(jìn)行檢測(cè)。另一種方法是，按構(gòu)建質(zhì)粒pKC283-LB實(shí)例的第一段進(jìn)行SalI-EcoRI切除和連接，也可構(gòu)建質(zhì)粒pL32。
7.大腸桿菌K12MO(λ+)/pL47的構(gòu)建從北方地區(qū)研究室得到經(jīng)冷凍干燥的大腸桿菌K12RV308/pNM789(保藏號(hào)為NRRL B-18216)。pNM789的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖7所示?；旧习磳?shí)例1的方法從培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA，所不同的是保溫溫度為37℃。將10μg pNM789懸浮在200μl PvuII緩沖液(50mMTris-HCl pH7.5，60mM NaCl和6mM MgCl2)中。加入1單位PvuII，在37℃使反應(yīng)混合物保溫5分鐘。在65℃加熱10分鐘使該酶失活。再加入30μl10X BamHI緩沖液(200mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl和70mMMgCl2)，70μl H2O和10單位的BamHI，在37℃使反反應(yīng)液保溫1小時(shí)。隨后向該反應(yīng)液加入5單位堿性磷酸酶并于65℃保溫1小時(shí)。在1％瓊脂糖凝膠中分離DNA片段，純化大小為單切割片段的DNA片段(圖8)。
基本上按實(shí)例29A4的方法合成具有平端和BamHI端的DNA人工接頭。該人工接頭(如圖8中的118所示)具有下列結(jié)構(gòu)5′-CTGTGCCTTCTAG-3′|||||||||||||3′-GACACGGAAGATCCTAG-5′基本上按實(shí)例29A2的方法使該人工接頭激活并與BamHI-PvuII消化的質(zhì)粒pNM789連接。用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308細(xì)胞，基本上按實(shí)例29A3的方法使這些轉(zhuǎn)化體進(jìn)行質(zhì)粒分離。選擇到好幾個(gè)含有合適大小PvuII片段(494bp)和XbaI-BamHI片段(628bp)的質(zhì)粒。通過(guò)BamHI位點(diǎn)到單-SmaI位點(diǎn)的測(cè)序至少測(cè)定了這些質(zhì)粒中二個(gè)的順序，并選擇一個(gè)具有所需順序的克隆。這中間質(zhì)粒被稱為質(zhì)粒120。該方法的框圖以及質(zhì)粒120的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖8所示。
為了分離編碼EK-BGH的DNA，在含限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI各50單位的200μl高鹽緩沖液中消化約10μg質(zhì)粒120。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物，并分離和制備編碼EK-BGH的～0.6Kb XbaI-BamHI限制性片段，用于基本上按實(shí)例29A6的方法連接。
也用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI消化質(zhì)粒pL32，并分離和制備用于連接的～3.9Kb限制性片段?；旧习磳?shí)例29A2的方法使質(zhì)粒pL32的～3.9Kb XbaI-BamHI限制性片段與質(zhì)粒120的～0.6Kb XbaI-BamHI限制性片段相連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pL47。質(zhì)粒pL47的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖9所示。基本上按實(shí)例29A3的方法將質(zhì)粒pL47轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12MO(λ+)中，鑒定大腸桿菌K12MO(λ+)/PL47轉(zhuǎn)化體?；旧习磳?shí)例29A1的方法由該轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒pL47DNA。
8.大腸桿菌K12RV308/pPR12AR1的構(gòu)建質(zhì)粒pPR12含有溫度敏感型pL阻遏物基因cI857，質(zhì)粒pBR322具有抗四環(huán)素基因。在US4436815(1984.3.13批準(zhǔn))中已公開質(zhì)粒pPR12。質(zhì)粒pPR12的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖10所示。
在200μl高鹽緩沖液中，在37℃，用約50單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI消化約10μg質(zhì)粒pPR12 2小時(shí)，基本上按實(shí)例29A5的方法沉淀EcoRI消化的質(zhì)粒pPR12DNA，并用Klenow處理。Klenow反應(yīng)后，基本上按實(shí)例29A2的方法進(jìn)行連接使EcoRI消化的和Klenow處理的質(zhì)粒pPR12DNA再環(huán)化。連接的DNA構(gòu)成所要的質(zhì)粒pPR12ΔR1，它可用于基本上按實(shí)例29A3的方法(所不同的是選擇物基于抗5μg/ml四環(huán)素而不是抗氨芐青霉素)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308。大腸桿菌K12RV308可從NRRL得到(保藏號(hào)為NRRLB-15624)。鑒定大腸桿菌K12RV308/pPR12ΔR1轉(zhuǎn)化體以后，基本上按實(shí)例29A11的方法由該轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒pPR12ΔR1 DNA。
在200μl中鹽緩沖液中，在37℃，用約50單位的限制性內(nèi)切酶AvaI消化約10μg質(zhì)粒pPR12ΔR1 2小時(shí)?；旧习磳?shí)例29A5的方法沉淀AvaI消化的質(zhì)粒pPR12ΔR1DNA，并用Klenow處理。Klenow反應(yīng)以后，基本上按實(shí)例29A2的方法將AvaI消化的、經(jīng)Klenow處理的質(zhì)粒pPR12ΔR1 DNA與EcoRI人工接頭(5′-GAGGAATTCCTC-3′)連接。人工接頭連接后，沉淀該DNA，然后再懸浮在約含50單位限制性內(nèi)切酶EcoRI的約200μl高鹽緩沖液中。在37℃保溫所得到的反應(yīng)液約2小時(shí)。EcoRI消化以后，使反應(yīng)混合物加在瓊脂糖凝膠上，基本上按實(shí)例29A6的方法純化～5.1Kb EcoRI限制性片段?；旧习磳?shí)例29A2的方法進(jìn)行連接使～5.1Kb EcoRI限制性片段再環(huán)化。連接的DNA構(gòu)成所要的質(zhì)粒pPR12AR1。基本上按實(shí)例29A3的方法(除選擇基于抗四環(huán)素而不是抗氨芐青霉素外)使質(zhì)粒pPR12AR1 DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12RV308中。鑒定大腸桿菌K12RV308/pPR12AR1轉(zhuǎn)化體后，基本上按實(shí)例29A1的方法制備質(zhì)粒pPR12AR1 DNA。質(zhì)粒pPR12AR1的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖11所示。
9.大腸桿菌K12RV308/pL110的構(gòu)建將約10μg質(zhì)粒pPR12AR1 DNA懸浮在含限制性內(nèi)切酶PstI和EcoRI各50單位的約200ml高鹽緩沖液中，在37℃保溫消化反應(yīng)液約2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物加在瓊脂糖凝膠上，基本上按實(shí)例29A6的方法分離和制備用于連接的質(zhì)粒pPR12AR1的～2.9Kb PstI-EcoRI限制性片段。
在200μl高鹽緩沖液中，在37℃，用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI消化約10μg質(zhì)粒pL47 2小時(shí)。將PstI-BamRI消化的DNA加在瓊脂糖凝膠上，基本上按實(shí)例29A6的方法分離和制備用于連接的～2.7Kb PstI-BamHI限制性片段，該片段含有復(fù)制原點(diǎn)和抗氨芐青霉素基因。在分離反應(yīng)中，在200μl高鹽緩沖液中，在37℃，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化約10μg質(zhì)粒pL47DNA2小時(shí)，基本上按實(shí)例29A6的方法分離和制備用于連接的～1.03Kb EcoRI-BamHI限制性片段，該片段含有新的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯活化順序和EK-BGH編碼DNA。所得到的～2μg～1.03KbEcoRI-BamHI限制性片段可用于構(gòu)建質(zhì)粒PL110。
將質(zhì)粒pL47的～2.7Kb PstI-BamHI和～1.03Kb EcoRI-BamHI限制性片段與質(zhì)粒pPR12AR1的～2.9Kb PstI-EcoRI限制性片段相連接以構(gòu)成質(zhì)粒pL110，基本上按實(shí)例29A2和A3的方法(除基于抗四環(huán)素而不是抗氨芐青霉素選擇轉(zhuǎn)化體外)用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308。
在EK-BGH編碼區(qū)存在二個(gè)PstI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(附圖的限制性位點(diǎn)和功能圖中未標(biāo)出)。質(zhì)粒pL110的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖12所示。
10.大腸桿菌K12RV308/pL110C的構(gòu)建a.大腸桿菌K12RV308/pL110A的構(gòu)建在總體積為20μl含2μl10X高鹽緩沖液(1.0MNaCl；0.50M Tris-HCl pH7.5；0.10MMgCl2；和10mM二硫蘇糖醇)和3單位NdeI酶的溶液中，在37℃，用限制性內(nèi)切酶NdeI消化約1μg質(zhì)粒pL110 DNA1小時(shí)。用苯酚/氯仿提取反應(yīng)混合物，用乙醇沉淀DNA。將NdeI消化的質(zhì)粒pL110 DNA溶于50μl 1X Klenow緩沖液(40mM KpO4pH＝7.5；6.6mM MgCl2；1.0mM 2-巰基乙醇；33μM dATP；33μMdCTP；33μMdGTP；33μM TTP)中。加入2μl(～10單位，New England Biolabs)大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段即Klenow，與該DNA混合，并在16℃保溫所得到的反應(yīng)液1小時(shí)。通過(guò)苯酚提取終止該反應(yīng)，DNA按常規(guī)純化。然后在4℃使NdeI消化的，經(jīng)Klenow處理的DNA用T4DNA連接酶連接16小時(shí)。將所得到的DNA用于常規(guī)的大腸桿菌K12菌株RV308(NRRL B-15624)轉(zhuǎn)化。在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，按Birnboim和Doly所述的快速堿性提取法從抗性菌落中分離質(zhì)粒。選擇沒(méi)有NdeI位點(diǎn)的質(zhì)粒(圖13中的pL110A)。
b.通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變構(gòu)建噬菌體pL110B通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變消除抗四環(huán)素基因中的BamHI位點(diǎn)所用的方法如附圖13的右邊所示。
b(i)噬菌體M13Tc3的構(gòu)建用質(zhì)粒pL110作抗四環(huán)素基因的來(lái)源。將50μl TE緩沖液中的約50μg質(zhì)粒pL110加到25μl10X HindIII緩沖液和170μl H2O中。將約5μl(～50單位)的限制性內(nèi)切酶HindIII加到質(zhì)粒pL110 DNA的溶液中，在37℃使反應(yīng)液保溫2小時(shí)。將約13μl2M Tris-HCl，pH7.4和5μl(～50單位)的限制性內(nèi)切酶EcoRI加到HindIII消化的質(zhì)粒pL110 DNA中，在37℃使反應(yīng)液再保溫2小時(shí)。用TE飽和的苯酚提取該反應(yīng)混合物以使反應(yīng)停止；用氯仿提取以除去苯酚。然后經(jīng)過(guò)沉淀和離心分離收集EcoRI-HindIII消化的質(zhì)粒pL110 DNA，加在1％瓊脂糖凝膠上，分離和純化大的～4.3Kb EcoRI-HindIII限制性片段。
將約5μg噬菌體m13mp18(New EnglandBiolabs)溶于50μl TE緩沖液中，然后按上述方法用HindIII和EcoRI消化。按上述PL110的方法(除分離和純化～7.25Kb限制性片段以外)純化HindIII-EcoRI切割的噬菌體M13mp18DNA。
將質(zhì)粒pL110的～4.3Kb HindIII-EcoRI片段約100毫微克與約100毫微克噬菌體M13mp18的～7.25Kb HindIII-EcoRI片段，2μl10X連接酶緩沖液，1μl(～100單位)的T4 DNA連接酶和14μl H2O相混合。在15℃保溫連接反應(yīng)液1.5小時(shí)；連接的DNA構(gòu)成所要的噬菌體m13Tc3 DNA。噬菌體m13Tc3的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖13所示。
用1ml的大腸桿菌K12JM109(可用從NewEngland Biolabs買到的大腸桿菌K12JM101代替大腸桿菌K12JM109)的過(guò)夜培養(yǎng)物接種50ml L-肉湯，在37℃通氣保溫得到的培養(yǎng)液直到O.D.660為0.3～0.4。將這些細(xì)胞再懸浮在25ml10mM NaCl中，在冰上保溫10分鐘，通過(guò)離心分離而收集。再將這些細(xì)胞懸浮在1.25ml的75mM CaC12中；取出200μl該細(xì)胞，加到10μl上述制備的連接的DNA中，在冰中保溫約40分鐘。然后在42℃保溫該細(xì)胞-DNA混合物2分鐘，取出不同的等分試樣(即1，10和100μl)，加到3ml高級(jí)瓊脂(top agar)(L-肉湯，含有0.5％在45℃熔融的瓊脂)中，該瓊脂還含有50μl2％X-Gal，50μl100mM IPTG和200μl對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌K12JM109。然后將該細(xì)胞-高級(jí)瓊脂混合物涂在L-瓊脂平板上，該平板含有40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-硫代半乳糖苷)和0.1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在37℃保溫平板過(guò)夜。
第二天早晨，分別用幾個(gè)澄清的(與藍(lán)色相對(duì)比)的噬斑接種2ml L肉湯，在37℃通氣保溫培養(yǎng)液2小時(shí)。缺少藍(lán)色表示已發(fā)生所要的DNA插入。然后，使該培養(yǎng)液離心，將得到的200μl上清液加到在37℃通氣生長(zhǎng)的10ml大腸桿菌K12JM109培養(yǎng)液(O.D.550＝0.5)中。在37℃使這些培養(yǎng)液再保溫30分鐘；然后，通過(guò)離心使該細(xì)胞沉淀，用于制備它們所含的復(fù)制型重組噬菌體。用實(shí)例1所述并按比例縮小方法從該細(xì)胞中分離雙鏈復(fù)制型噬菌體DNA。通過(guò)噬菌體DNA的限制性內(nèi)切酶分析鑒定含噬菌體m13Tc3DNA的轉(zhuǎn)化體。
b(ii)單鏈?zhǔn)删wm13Tc3DNA的制備離心1.5ml大腸桿菌K12JM109/m13Tc3的過(guò)夜培養(yǎng)液，用100μl含噬菌體m13Tc3的上清液接種25ml OD660約為0.4-0.5的大腸桿菌JM109的培養(yǎng)液。在37℃通氣保溫該培養(yǎng)液6小時(shí)，離心該培養(yǎng)液，將得到的20ml上清液移入新的管中。將約2ml含20％聚乙二醇(PEG)6000和14.6％NaCl的溶液加到該上清液中，然后在冰中保溫20分鐘。
以7000rpm離心該上清液25分鐘，將所得到的含單鏈?zhǔn)删wm13Tc3DNA的沉淀再懸浮在500μl TE緩沖液中。用TE飽和的苯酚提取該DNA溶液2次，再用氯仿提取2次。然后用NaOAc和乙醇沉淀該單鏈DNA，離心分離。用70％乙醇洗滌得到的沉淀，干燥，然后溶于60μl H2O中。
b(iii)誘變?cè)谧詣?dòng)操縱的DNA合成儀中合成誘變用的單鏈DNA片段。該片段具有順序5′-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3′，它類似于質(zhì)粒pBR322抗四環(huán)素基因中BamHI位點(diǎn)(5′-GGATCC-3′)周圍的區(qū)域，所不同的是在質(zhì)粒pBR322中5′端的第二個(gè)殘基(或3′端的第三個(gè)殘基)是C。這種變化不會(huì)改變抗四環(huán)素蛋白質(zhì)的氨基酸組成，但能消除BamHI位點(diǎn)。
用在20μl的1X激酶緩沖液(60mM Tris-HCl pH7.8；15mM 2-巰基乙醇；10mM MgCl2；0.41μM ATP)中的10單位(BRL)T4多核苷酸激酶，在37℃℃分別處理約10微微摩爾的誘變引物和M13普通引物(Bethesda Research Laboratories(BRL)，P.O.Box 6009，Gaithersburg，MD20760)30分鐘。將經(jīng)激酶處理的DNA用于下述的誘變步驟中。
將300ng(1.2μl)單鏈?zhǔn)删wM13Tc3，1微微摩爾(2μl)普通引物，1微微摩爾(2μl)誘變引物，2μl10X退火緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.5；1mMEDTA；500mM NaCl)以及12.8μl H2O混合在一起，以進(jìn)行退火反應(yīng)。使該反應(yīng)在80℃保溫2分鐘，在50℃保溫5分鐘，然后冷至室溫。
在退火的DNA混合物中加入5μl10X伸展緩沖液(500mM Tris-HCl PH8；1mM EDTA；120mMMgCl2)；5μl2mM dATP；1μl dGTP、dTTP、和dCTP均為6mM的溶液；1μl(～2單位，PharmaciaP-L Biochemicals，800Centennial Avenue，Piscataway，NJ08854)Klenow酶；1μl(100單位)T4DNA連接酶；和17μlH2O以進(jìn)行伸展反應(yīng)。在室溫下保溫該伸展反應(yīng)1小時(shí)，然后在37℃保溫2.5小時(shí)，然后在4℃過(guò)夜。
先用TE飽和的苯酚提取2次以停止反應(yīng)，再用CHCl3提取2次。用乙醇和NaOAc沉淀該DNA。通過(guò)離心收集該DNA，再懸浮在50μl H2O中，然后在DNA溶液中加入6μl10XS1緩沖液。
將該DNA溶液平均分入3個(gè)管中。在2個(gè)管中加入約200單位(Miles Laboratories)S1核酸酶。一種S1反應(yīng)液在室溫下保溫5分鐘，其他反應(yīng)液保溫10分鐘。用TE飽和的苯酚提取反應(yīng)混合物2次以停止反應(yīng)。該苯酚提取物再用氯仿提取2次；然后用NaOAc和乙醇從反應(yīng)混合物中沉淀該DNA。用未經(jīng)處理的DNA樣品作對(duì)照。所有經(jīng)S1處理的樣品在其他步驟中都彼此分開，但都得到類似的結(jié)果。
將該DNA沉淀再懸浮在20μl H2O中，按構(gòu)建噬菌體m13Tc3時(shí)所用的方法(除無(wú)IPTG或X-Gal加到平板上外)，用10μl得到的溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12JM109(也可用大腸桿菌K12JM101)。
按上述方法分離來(lái)自約48個(gè)噬斑的雙鏈復(fù)制型DNA，并篩選出有BamHI限制性位點(diǎn)的。按上述方法制備單鏈DNA，再選擇沒(méi)有BamHI位點(diǎn)的分離物。用雙脫氧測(cè)序法(J.H.Smith，1980；Methods in Enzymology 65560-580)測(cè)定單鏈DNA順序。所要的分離物稱為pL110CB(圖13)。
C.質(zhì)粒pL110C的構(gòu)建在含～50單位的NheI限制性內(nèi)切酶的250μl1X NheI緩沖液(50mM NaCl；6mM Tris-HCl pH7.5；6mM MgCl2和6mMβ-巰基乙醇)中，在37℃，消化約50μg復(fù)制型噬菌體pL110B DNA2小時(shí)。然后在NheI消化的噬菌體pL110B DNA中加入5μl5M NaCl，接著加入5μl(～50單位)SalI限制性內(nèi)切酶。在37℃繼續(xù)消化2小時(shí)。然后按公知的一般方法從丙烯酰胺凝膠中分離具有抗四環(huán)素基因突變區(qū)的所要的～422bp NheI-SalI片段。
在相同的條件下，用NheI和SalI消化質(zhì)粒pL110ADNA，所不同的是用質(zhì)粒pL110A代替噬菌體pL110B。從瓊脂糖中純化質(zhì)粒pL110A的～6.1Kb NheI-SalI限制性片段。
用普通方法將pL110A(～6.1Kb)和pL110B(～422bp)的NheI-SalI片段各100毫微克連接在一起以構(gòu)建所要的質(zhì)粒pL110C。質(zhì)粒pL110C的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖13所示。所要的質(zhì)粒pL110C使大腸桿菌具有10μg/ml四環(huán)素抗性，但在抗四環(huán)素基因中缺少BamHI位點(diǎn)。
11.質(zhì)粒pCZR111的構(gòu)建質(zhì)粒pL110C含有單一的ClaI限制位點(diǎn)，該位點(diǎn)可通過(guò)下列反應(yīng)除去?；旧习磳?shí)例29A2的方法〔除采用限制性內(nèi)切酶ClaI和10XClaI緩沖液(500mM NaCl，100mMTris-HCl pH7.9和100mM MgCl2)外〕用ClaI消化約1μg質(zhì)粒pL110C。然后，基本上按實(shí)例29A5的方法(所不同的是只加入dCTP，而不是加入所有4種dNTP)用Klenow處理ClaI消化的DNA。
然后沉淀該DNA，再懸浮在50μl Mung Bean核酸酶緩沖液(50mM NaOAc pH5.0，30mM NaCl和1mMZnSO4)中。加入1單位的Mung Bean核酸酶(從NewEngland Biolabs可買到)，在30℃保溫該反應(yīng)30分鐘。然后將試管放在冰中，加入NaCl至0.2M，該混合物用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，再懸浮在10mM Tris-HClPH8.0中。然后基本上按實(shí)例29A3和29A4的方法使該DNA自身連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細(xì)胞中。得到的質(zhì)粒稱為質(zhì)粒pCZR111。
12.質(zhì)粒pCZR126S的構(gòu)建按下述方法用XbaI消化約26μg的質(zhì)粒pCZR111。10X XbaI緩沖液含有600mM Tris-HCl，100mMMgCl2，1M NaCl和10mM 2-巰基乙醇，pH為7.5(在37℃)。將50μl的10X XbaI緩沖液，15μlXbaI(10U/μl)和185μl H2O加到約含25μg質(zhì)粒pL110的250μl水中。在37℃消化1小時(shí)。然后用苯酚提取XbaI消化的pL110，加入1/10體積的3M CH3COO-Na，加入3體積的乙醇；該混合物在干冰-乙醇浴中保溫5分鐘，然后離心分離。將沉淀的DNA再懸浮在50μl H2O中。
按下述方法用BamHI消化經(jīng)XbaI消化的質(zhì)粒pCZR111。在得到的50μl經(jīng)XbaI消化的pL110中加入0.2μlBamHI(10U/μl)，10μl BamHI緩沖液(100mM Tris-HCl，50mM MgCl2，1M NaCl和10mM2-巰基乙醇，pH為8.0，在37℃)以及90μl水。在37℃消化5分鐘。用苯酚提取消化的pCZR111，加入1/10體積的CH3COONa，接著加入3體積乙醇。將沉淀的DNA再懸浮在50μl的10mM Tris，1mM EDTA，pH為8.0的緩沖液中。
然后將XbaI和BamHI消化的pCZR111加在瓊脂糖凝膠上，分離約5.8Kb的DNA帶。將pCZR111的～5.8Kb片段與XbaI-NdeI人工接頭和編碼EK-牛生長(zhǎng)激素的合成基因(在它的5′端含有NdeI位點(diǎn)，在它的3′端含有BamHI位點(diǎn))連接，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pCZR126S。用普通的寡核苷酸測(cè)序法可得到XbaI-NdeI順序，該順序包括如下順序5′CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCA3′|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT5′上述順序是通過(guò)兩條鏈的化學(xué)合成，然后混合以使其雜交而構(gòu)建的。編碼EKbGH的基因是由單鏈DNA的16個(gè)化學(xué)合成片段構(gòu)建的，這些片段長(zhǎng)為71-83核苷酸，它含有整個(gè)基因的兩條互補(bǔ)鏈。用Applied Biosystems(ABS)公司的儀器進(jìn)行合成，合成物包括如下順序5′TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAAGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACTCACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTTCACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCGCCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGATGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCTCCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGAGGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTGAAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTTGGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCGCAGCTGTGCCTTCTAG3′||||||||||||||||GTCGACACGGAAGATCCTAG5′通過(guò)連接下列組分可完成質(zhì)粒pCZR126S的構(gòu)建總體積為2μl的～0.28μg5.8Kb片段(用XbaI完全消化和用BamHI部分消化質(zhì)粒pL110而得到)，總體積為2.5μl的0.18μg編碼牛生長(zhǎng)因子衍生物的合成基因(其5′端對(duì)應(yīng)于XbaI位點(diǎn)，3′端對(duì)應(yīng)于BamHI位點(diǎn))，8.75微微摩爾的1μl化學(xué)合成的XbaI-NdeI人工接頭。將質(zhì)粒成分加到6μl5X連接緩沖液中，該緩沖液含有250mM Tris-HCl，50mM MgCl2，5mM ATP，5mM DTT，25％V/V聚乙二醇8000，pH7.6，2μl連接酶，16.5μlH2O。在16℃使該連接混合物保溫過(guò)夜。然后基本上按實(shí)例29A3的方法用環(huán)化質(zhì)粒pCZR126S轉(zhuǎn)化大腸桿菌RV308細(xì)胞。質(zhì)粒pCZR126S的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖14所示。B.人胰島素原表達(dá)質(zhì)粒pRB172的構(gòu)建1.質(zhì)粒pRB145的構(gòu)建通常首先合成人胰島素原基因并克隆入pUC18質(zhì)粒中(從BRL買到)。用一般方法合成該基因，它具有如下順序 選擇具有正確順序的一個(gè)克隆以用于產(chǎn)生氯化銫純化的DNA。用一般方法分離該質(zhì)粒(參見(jiàn)例如，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，1982，ed.by Maniatis，T；Fritsch，E.F.and Sambrook，J.，ColdSpring Harbour Laboratory Publications，New York，該文的全部方法作為本文的參考文獻(xiàn))。將約6μl(20μg)質(zhì)粒DNA加到20μl10X NdeI緩沖液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.8，6mM MgCl2，6mM 2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)，5μlNdeI限制性內(nèi)切酶(～40單位)和169μl水中。混合后，使該反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)。加入0.3M NaOAc和3體積乙醇使DNA沉淀，混合并冷至-70℃，離心分離。用70％乙醇(1ml)洗滌DNA沉淀物，干燥并溶于20μl10x BamHI緩沖液(150mM NaCl，6mM Tris-HCl pH7.9，6mM MgCl2，100μg/ml BSA)，2μl BamHI限制性內(nèi)切酶(40單位)和178μl水中。慢慢混合后，使該反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)。按上述方法再用3體積的乙醇沉淀該DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(FMC，Sea Plaque瓊脂糖)中電泳。從該凝膠中切下相當(dāng)于約270bp的所要的DNA片段，然后通過(guò)熔融該瓊脂糖而回收DNA，按廠商推薦的方法使DNA通過(guò)Elutip-d柱(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)。沉淀后干燥，將DNA貯藏在pH為8.0的30μl10mM Tris-HCl中。
將約15μg質(zhì)粒pCZR126S(來(lái)自實(shí)例29A12)懸浮在20μl10X NdeI緩沖液，5μl NdeI限制性內(nèi)切酶(40單位)和175μl水中，慢慢混合并在37℃保溫2小時(shí)。保溫后，按上述方法用3體積的乙醇沉淀DNA，干燥，然后再懸浮在20μl10X BamHI緩沖液，2μl BamHI限制性內(nèi)切酶(40單位)和178μl水中。慢慢混合后，使該反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)。再用3體積的乙醇沉淀DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。從凝膠中切下對(duì)應(yīng)于載體DNA的大片段，用上述的Elutip-d柱方法回收該DNA。沉淀后，干燥，將載體DNA貯藏在pH8.0的35μl10mM Tris-HCl中。
將約2.5μl載體DNA與上述12μl純化的人胰島素基因片段，4μl10mM ATP，0.5μl1M二硫蘇糖醇，5μl10X連接酶緩沖液(500mM Tris-HCl pH7.6和100mM MgCl2)，26μl水和0.5μl T4DNA連接酶(Pharmacia，3.5單位)相混合。該反應(yīng)在4℃保溫16小時(shí)。用50μl10mM Tris-HCl pH7.6和3μl1MCaCl2稀釋連接混合物，然后基本上按實(shí)例29A3的方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12RV308中。將細(xì)胞涂在加有5μg/ml四環(huán)素的TY平板上，然后在32℃保溫過(guò)夜。
用快速堿性提取法(如Molecular Cloning，ALaboratory Manual，1982，ed.by Maniatis，T.；Fritsch，E.F.，and Sambrook，J.ColdSpring Harbour Publications，New York，P368-369)，從抗四環(huán)素菌落中分離3ml培養(yǎng)液中的質(zhì)粒。按微量篩選法用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析XbaI/BamHI消化的片段，從而發(fā)現(xiàn)了正確的人胰島素原基因片段的存在。選擇具有正確大小(約315bp)插段的質(zhì)粒以用于擴(kuò)增和純化。含有人胰島素原基因的質(zhì)粒是pRB145。質(zhì)粒pRB145的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖16所示。
2.質(zhì)粒pRB164A的構(gòu)建將約30μg質(zhì)粒pRB145懸浮在20μl的10XNdeI緩沖液，5μl NdeI限制性內(nèi)切酶(New EnglandBiolabs，40單位)和175μl水中，慢慢混合，在37℃保溫1小時(shí)。然后將2μl的BamHI限制性內(nèi)切酶(NewEngland Biolabs，40單位)加到該反應(yīng)混合物中，在37℃再繼續(xù)保溫2小時(shí)。用3體積的乙醇和0.3M NaOAc沉淀該DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。從該凝膠中切下編碼人胰島素原基因的較小(約270bp)的NdeI/BamHI限制性片段，按上述方法通過(guò)Elutip-d柱回收該DNA。沉淀后干燥，將該DNA貯藏在pH8.0的30μl10mM Tris中。
然后在該DNA(30μl)中，加入20μl的10X AvaII緩沖液(50mM NaCl，6mM Tris-HCl，pH8.0，10mM MgCl2，6mM2-巰基乙醇，100μg/mlBSA)，5μl的AvaII限制性內(nèi)切酶(New EnglandBiolabs，20單位)和175μl水。慢慢混合后，該反應(yīng)在37℃保溫2小時(shí)。用3體積乙醇和3M NaOAc(20μl)沉淀該DNA，然后在1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。從該凝膠中切下較大的AvaII/BamHI限制性片段(約156bp)，然后按上述方法通過(guò)Elutip-d柱回收DNA。沉淀后干燥，將DNA貯藏在pH8.0的30μl10mM Tris中。
用合成方法制備相應(yīng)于人胰島素原基因的NdeI/AvaII限制性片段的DNA(～115bp)。第一步包括用DNA合成儀(Applied Biosystems，Model380B)合成4個(gè)單鏈脫氧寡核苷酸。這4個(gè)寡核苷酸的核苷順序?yàn)?br> 1. TATGCGTATGTTTGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTACCT (60聚體)2. GGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTCTACACCAAGCCGACCCGCCGTGAGGCAGAG (55聚體)3. CACCAGGTACAGAGCTTCCACCAGGTGGGAGCCGCACAGGTGTTGGTTAACAAACATACGCA (62聚體)4. GTCCTCTGCCTCACGGCGGGTCGGCTTGGTGTAGAAGAAGCCACGTTCACCGCA (54聚體)通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化每個(gè)寡核苷酸后，按Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryan，M.J.和Khorana，H.G(1979)教導(dǎo)的方法(Methods in Enzymology，Ed.by Wu，R.，Academic Press，N.Y.68109-151，整個(gè)公開列入本文參考文獻(xiàn)中)，使寡核苷酸2和3磷酸化。然后使磷酸化的寡核苷酸2和3(各為～715微微摩爾)與寡核苷酸1和2(～860微微摩爾)相混合，在含50mMTris-HCl pH7.6，10mM MgCl2，10mM DTT，50μM ATP和20單位T4DNA連接酶(Pharmacia)的的緩沖液(200μl)中在4℃退火并連接16小時(shí)。在15％聚丙烯酰胺凝膠中純化連接產(chǎn)物。從凝膠切片中電泳回收DNA，接著在Sephadex G-50柱中脫鹽。得到所要的連接產(chǎn)物是485微微摩爾。
按Brown，E.L.等人，1979，Methods inEnzymology 68109-151所述方法(列入本文參考文獻(xiàn))，在含50mM Tris pH7.6，10mM MgCl2，10mM DTT和ATP的緩沖液(50μl)中使約100微微摩爾DNA磷酸化。通過(guò)Sephadex G-50柱過(guò)濾后，將DNA貯藏在50μl10mM Tris pH8.0中。
使約2.5μl載體DNA(NdeI-BamHI消化的pCZR126S)與18μ質(zhì)粒pRB145的AvaII/BamHI限制性片段和10μl(10微微摩爾)NdeI/AvaII合成人工接頭(在含有50mM Tris pH7.6；10mM MgCl2；10mM DTT；800μl ATP和3.5單位T4 DNA連接酶的50μl緩沖液中剛構(gòu)建的)相混合。該反應(yīng)液在4℃保溫過(guò)夜，然后按實(shí)例29A3的方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12RV308中。通過(guò)分析其質(zhì)粒DNA鑒定所要的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌K12RV308/pRB164A。使合適的轉(zhuǎn)化體在30℃，在含有5μg/ml四環(huán)素的TY介質(zhì)中生長(zhǎng)至OD550約為0.2，即早對(duì)數(shù)期，然后移至42℃3-3.5小時(shí)以誘導(dǎo)合成人胰島素原。使細(xì)胞離心沉淀，加入樣品緩沖液(0.125M Tris-HCl pH6.8，2％SDS，30％甘油，1M2-巰基乙醇，6M尿素)使其溶解。在97℃加熱樣品2分鐘，然后加在丙烯酰胺凝膠上。用考馬斯亮藍(lán)染色很容易檢測(cè)這些帶。用掃描凝膠密度計(jì)測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)的百分量。質(zhì)粒pRB164A的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖17所示。
3.質(zhì)粒pRB172的構(gòu)建將約25μg質(zhì)粒pRB145懸浮在15μl10X DraIII緩沖液(200mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，10μg/ml BSA)，6μl DraIII限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，27單位)和129μl水中，慢慢混合，在37℃保溫6小時(shí)。保溫后沉淀該DNA，干燥并再懸浮在10μl10X XbaI緩沖液(150mM NaCl，6mM Tris-HCl pH7.9，6mMMgCl2，7mM 2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)，3μl XbaI限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，36單位)和77μl水中。慢慢混合該反應(yīng)液，在37℃保溫4小時(shí)。再用3體積乙醇和NaOAc沉淀該DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。從該凝膠中切下對(duì)應(yīng)于人胰島素原基因的約85bp XbaI/DraIII限制性片段的低帶，用Elutip-d柱方法回收DNA。沉淀后干燥，將DNA貯藏在pH為8.0的30μl的10mMTris中。
按上述方法，用限制性內(nèi)切酶DraIII和XbaI切割約15μg質(zhì)粒pRB164A。用Elutip-d柱方法從瓊脂糖凝膠中分離對(duì)應(yīng)于Xba I/DraIII載體片斷的上層帶。沉淀后干燥，將DNA貯藏在pH為8.0的30μl10mM Tris中。
將約5μl XbaI/DraIII消化的pRB164A載體DNA與在緩沖液(50μl，含50mM Tris-HCl pH7.6，10mM MgCl2，10mM DTT，800μM ATP和6單位T4DNA連接酶)中的質(zhì)粒pRB145的5μl XbaI/DraIII限制性片段相混合。該反應(yīng)在4℃保溫過(guò)夜，用于轉(zhuǎn)化CaCl2處理的感受態(tài)大腸桿菌K12/RV308細(xì)胞。
在含5μg/ml四環(huán)素的TY瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用快速堿性提取法從抗四環(huán)素菌落中分離質(zhì)粒，通過(guò)用XbaI和BamHI限制性內(nèi)切酶消化以進(jìn)行分析。用順序分析系統(tǒng)(U.S.Biochemicals)測(cè)定來(lái)自陽(yáng)性克隆的DNA順序。選擇所要的具有正確順序的質(zhì)粒用于擴(kuò)增和純化。這樣可分離到大腸桿菌K12RV308/pRB172轉(zhuǎn)化體。在15％聚丙烯酰胺基質(zhì)中電泳分離后，通過(guò)測(cè)定總細(xì)胞蛋白質(zhì)而分析質(zhì)粒的人胰島素原的表達(dá)和積聚情況。質(zhì)粒pRB172的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖18所示。C.大腸桿菌RV308/PRB173和pRB174的構(gòu)建將約20μg質(zhì)粒pRB172或PRB145懸浮在20μl10X XbaI緩沖液(150mM NaCl，6mMTris-HCl，pH7.9，6mM MgCl2，7mM 2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)中，加入2μl XbaI限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，24單位)，慢慢混合，并在37℃保溫4小時(shí)。保溫后，沉淀該DNA，干燥，再懸浮在10μl10X BamHI緩沖液(100mM NaCl，10mMTris-HCl pH8.0，5mM MgCl2，1mM2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)，5μl BamHI限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，40單位)和75μl水中，使該反應(yīng)液慢慢混合，在37℃保溫4小時(shí)。再用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳，用Elutip-d柱方法從凝膠中分離對(duì)應(yīng)于人胰島素原基因的約320bp XbaI/BamHI限制性片段。沉淀后干燥，將DNA再懸浮在20μl10X XmaI緩沖液(25mM NaCl，10mM Tris-HClpH7.5，10mM MgCl2，10mM 2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)，10μl XmaI限制性內(nèi)切酶(NewEngland Biolabs，10單位)和170μl水中。使該反應(yīng)液慢慢混合，在37℃保溫4小時(shí)。保溫后，用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。從凝膠中切下對(duì)應(yīng)于約200bp XbaI限制性片段的大DNA，按上述方法通過(guò)Elutip-d回收DNA。將DNA貯藏在30μl10mMTris pH8.0中。
按下述合成法構(gòu)建對(duì)應(yīng)于人胰島素原基因的XmaI/BamHI限制性片段的51bp DNA。在合適的AppliedBiosystems公司的DNA合成儀中(380B型)合成2個(gè)單鏈脫氧寡核苷酸CCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTGGCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGTAG (51聚體)和GATCCTACTGCAGGGAACCCTCCAGGGCCAGCGGCTGCAGGCTGCCTGCAC (51聚體)在有7M尿素的情況下，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化。分離后，按Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryam，M.J.，和Khorana，H.G.(1979)Methods inEnzymology，ed.by Wu，R.，Academic Press，N.Y.68109-151中的教導(dǎo)使2個(gè)寡核苷酸磷酸化，并退火以形成所要的人工接頭。
將約10μg質(zhì)粒pCZR126S(來(lái)自實(shí)例29A12)懸浮在20μl10X XbaI緩沖液(150mM NaCl，6mMTris-HCl pH7.9，6mM MgCl2，7mM 2-巰基乙醇，100μg/ml BSA)，2μl XbaI限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mannheim，24單位)和178μl水中。慢慢混合該反應(yīng)液，在37℃保溫2小時(shí)。保溫后，加入4μl5M NaCl和2μl BamHI限制性內(nèi)切酶(New EnglandBiolabs，20單位)，在37℃繼續(xù)保溫2小時(shí)。然后用一般方法，用乙醇和NaOAc沉淀DNA，在1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中電泳。用Elutip-d柱分離對(duì)應(yīng)于XbaI/BamHI載體DNA的上層帶。沉淀后干燥，將該DNA貯藏在pH為8.0的30μl10mM Tris中。
在含50μM Tris pH7.6，10mM MgCl2，10mM DTT，800μM ATP和6單位T4DNA連接酶的50μl緩沖液中，將約5μl XbaI/BamHI消化的pCZR126S載體DNA與10μl來(lái)自pRB145或pRB172的XbaI/XmaI限制性片段和上述制得的4μl激活的XmaI/BamHI人工接頭相混合。該反應(yīng)液在4℃保溫過(guò)夜，用于按實(shí)例29A3的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308菌株。在42℃保溫前和保溫后通過(guò)分析其質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物而鑒定所要的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌K12RV308/pRB173(若由pRB172載體片段組成的話)和大腸桿菌K12RV308/pRB174(若由pRB145載體片段組成的話)。質(zhì)粒pRB173的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖19所示。
將得自微量制備的約200ng質(zhì)粒DNA也轉(zhuǎn)化至大腸桿菌L201細(xì)胞中，在含有15μg/ml四環(huán)素的2XTY瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。分析該轉(zhuǎn)化體表達(dá)的蛋白質(zhì)，由它們產(chǎn)生人胰島素原的能力確定所要的轉(zhuǎn)化體。由此分離大腸桿菌L201/pRB173和大腸桿菌L201/pRB174。D.大腸桿菌K12RV308/pRB175、pRB176、pRB177和pRB178的構(gòu)建將約12μg質(zhì)粒pRB172懸浮在15μl10X NdeI緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris-HC1 pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，100μg/ml BSA)，2.5μl NdeI限制性內(nèi)切酶(20單位)和133μl水中。慢慢混合該反應(yīng)液，在37℃保溫過(guò)夜。保溫后，用一般方法用乙醇和NaOAc沉淀該DNA，干燥，再懸浮在15μl 10X DraIII緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5，200mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT)，5μl DraIII限制性內(nèi)切酶(20單位)和130μl水中。慢慢混合后，該反應(yīng)液在37℃保溫過(guò)夜。再按上述方法用乙醇和NaOAc沉淀該DNA，在1％低熔瓊脂糖中電泳。從該凝膠中切下所要的大限制性片段，用Elutip-d柱方法回收DNA，將DNA貯藏在pH為8.0的30μl10mM Tris HCl中。
用Applied Biosystems 的DNA合成儀(380B型)化學(xué)合成下列DNA人工接頭(i) 5′TATGTACGACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′3′ ACATGCTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB175(ii)5′TATGTACGACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′3′ ACATGCTGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB176(iii)5′TATGTATAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′3′ ACATATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB177(iv) 5′TATGTACGTTAACCAACACCTGTGCGGCTCCCATCTG 3′3′ ACATGCAATTGGTTGTGGACACGCCGAGGGTA 5′用于pRB178用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化每個(gè)低聚核苷酸后，按上述方法使其磷酸化，并退火以便連接和構(gòu)建人胰島素原基因(該基因可模擬編碼DNA片段)。用人工接頭(i)-(iv)分別構(gòu)建質(zhì)粒pRB175、pRB176、pRB177和pRB178。
在含50μM Tris-HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM DTT，800μM ATP和6單位T4 DNA連接酶的緩沖液(50μl)中，使約3μl NdeI/DraIII消化的pRB172載體DNA片段與激活的人工接頭(i-iv)各4μl相混合。該反應(yīng)液在4℃保溫過(guò)夜，按實(shí)例29A3的方法用該混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308細(xì)胞。在42℃誘導(dǎo)該細(xì)胞前后，通過(guò)分析它們的質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生以鑒定所要的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌K12RV308/pRB175、大腸桿菌K12RV308/pRB176、大腸桿菌RV308/pRB177和大腸桿菌K12RV308/pRB178。質(zhì)粒pRB175的限制性位點(diǎn)和功能圖如附圖20所示。
表I 人胰島素原類似物類似物 質(zhì)粒 ％蛋白質(zhì)Met-Tyr-Human Proinsulin(HPI) pRB145 11.3Met-Arg-Met-[Lys(B28)，Pro(B29)HPI] pRB164A10.5Met-Tyr-[Lys(B28)，Pro(B29)HPI] pRB172 7.3Met-Tyr[Lys(B28)，Pro(B29)B-chain]-Q*pRB173 NDMet-Tyr-[B-chain]-Q*pRB174 NDMet-Tyr-[Des(B1)，Des(B2)，Asp(B3)，pRB175 8.5Lys(B28)，Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Asp(B1)，Lys(B28)，pRB176 9.3Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Des(B1)，Des(B2)，Lys(B28)， pRB177 9.4Pro(B29)HPI]Met-Tyr-[Des(B1)，Lys(B28)， pRB178 8.5Pro(B29)HPI]*Q＝-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-；E.按下列方法使大腸桿菌K12RV308/pRB172的貯備培養(yǎng)物變成永久性貯備培養(yǎng)物將分離的菌落點(diǎn)在下列表型平板上L-瓊脂+5μg/mlTc(四環(huán)素)，L-瓊脂+Sm(鏈霉素硫酸鹽)，M-9瓊脂介質(zhì)(含MgSO4、硫胺素、HYCASE和葡萄糖的鹽基介質(zhì))和不含葡萄糖而含乳糖的M-9瓊脂介質(zhì)。一塊L-瓊脂/Tc平板在42℃保溫，其余的平板在30℃保溫24小時(shí)。從30℃L-瓊脂/Tc平板中選擇表型正確的菌落，用于接種含50ml L-肉湯(含胰蛋白胨、酵母膏、NaCl和葡萄糖)加5μg/ml Tc介質(zhì)的培養(yǎng)瓶。該培養(yǎng)瓶在30℃震蕩保溫7小時(shí)。將瓶中物質(zhì)(1.2ml)放入生物冷凍瓶中，在液氨的蒸氣相中冷凍。然后使該物質(zhì)解凍，用1ml接種在含50ml L-肉湯加5μg/mlTc的瓶中。該瓶在30℃震蕩保溫4小時(shí)。再各用1ml上述物質(zhì)接種2個(gè)含有500ml BG-7介質(zhì)(含MgSO4、硫胺素、葡萄糖、Tc和微量鹽)的培養(yǎng)瓶。在30℃使這二個(gè)培養(yǎng)瓶震蕩保溫9小時(shí)。
將1升上述BG-7介質(zhì)液體培養(yǎng)基接種在150升發(fā)酵罐內(nèi)，該罐含有80升介質(zhì)(該介質(zhì)含有檸檬酸、硫酸亞鐵銨、K2HPO4、NH4Cl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、葡萄糖和微量無(wú)機(jī)鹽)。在30℃操作該發(fā)酵罐直到二氧化碳排放速率達(dá)到1.0m M/L/分為止。此時(shí)，將50升液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中以提供細(xì)胞接種物。
在30℃操作含1500升介質(zhì)(與150升發(fā)酵罐中所用介質(zhì)相同)的2500升發(fā)酵罐，直到二氧化碳排放率達(dá)到1.0mM/L/分，然后將溫度升至40℃，繼續(xù)運(yùn)行8小時(shí)。然后在61℃使液體培養(yǎng)基熱失活7分鐘，由該熱失活的液體培養(yǎng)基可得到下列產(chǎn)率數(shù)據(jù)細(xì)胞產(chǎn)量為13.1g/L(干重)；生產(chǎn)力為273μg脫甲酰化產(chǎn)物/ml液體培養(yǎng)基；比活(即每克產(chǎn)物/克細(xì)胞)為2.1％；甲?；a(chǎn)物百分?jǐn)?shù)為13％。
將發(fā)酵的液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入不銹鋼儲(chǔ)料罐中保持溫度為2-8℃。然后使整個(gè)液體培養(yǎng)基離心或過(guò)濾以收集大腸桿菌細(xì)胞，得到干重約15-20％的固體。將收集的細(xì)胞固體再添于加工水中以使其成漿料。然后用高壓均化法或其他合適的方法使細(xì)胞分裂，結(jié)果90-99％的細(xì)胞分解。用加工水稀釋均化的漿料以達(dá)到5％干重。加入NaOH使稀釋的分解細(xì)胞漿液的pH調(diào)至7-10。通過(guò)差分離心從細(xì)胞碎片中分離內(nèi)含體(顆粒)。所得到的固體濃度為15-20％。
在半胱氨酸和尿素的情況下，在堿性pH中溶解內(nèi)含體。為了從大量顆粒物中分辨混合的胰島素原類似物的二硫化物，在SPSepharose中，使溶解的顆粒進(jìn)行超流陽(yáng)離子交換層析。
通過(guò)與組織蛋白酶C、二肽氨肽酶保溫以除去胰島素原類似物氨基端的甲硫氨?；野彼嵘煺?。用pH8.8的連四硫酸鉀和半胱氨酸通過(guò)亞硫酸分解終止組織蛋白酶的分裂反應(yīng)通過(guò)Sephadex G-25進(jìn)行溶劑交換后，在pH為10.6時(shí)，在有半胱氨酸情況下保溫使得到的胰島素原類似物的S-磺酸鹽折疊。通過(guò)將PH調(diào)至2.4以終止折疊過(guò)程。在SP20SS樹脂中用疏水作用層析從不合適的折疊物以及由組織蛋白酶C分裂步驟留下的污染物中分離出正確折疊的胰島素原類似物。由于此分離過(guò)程是通過(guò)丙酮梯度進(jìn)行的，因此在進(jìn)一步加工前，必須通過(guò)蒸發(fā)從主流池中除去有機(jī)溶劑。
有機(jī)溶劑蒸發(fā)后，使正確折疊的胰島素原類似物與胰蛋白酶和羧肽酶B保溫。這些酶可切割胰島素原類似物的C肽，產(chǎn)生Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素。然后在S-Sepharose中進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，再在10μm C-8樹脂中進(jìn)行高效反相層析以進(jìn)一步純化胰島素類似物。通過(guò)Sephadex G-25進(jìn)行溶劑交換從反相主流中除去乙腈，用螺旋繞制的超過(guò)濾系統(tǒng)濃縮所得的物質(zhì)。在Sephadex G-50樹脂中對(duì)濃縮的物質(zhì)進(jìn)行大小排阻層析，并冷凍干燥。
下列表II提供了上述實(shí)例中化合物的氨基酸分析。
表II人胰島素類似物1，2中氨基酸分析實(shí)例號(hào) 23 45678 9 10氨基酸殘基Asp 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 4.00(4) 4.00(4) 4.00(4) 3.00(3) 3.00(3)Thr 2.82(3) 2.81(3) 2.64(3) 2.80(3) 2.80(3) 2.94(3) 2.81(3) 2.71(3) 2.73(3)Ser 2.76(3) 2.73(3) 2.70(3) 2.75(3) 2.71(3) 2.46(3) 2.71(3) 2.74(3) 2.72(3)Glu 7.16(7) 7.05(7) 6.93(7) 7.08(7) 7.01(7) 6.69(7) 7.18(7) 6.99(7) 7.94(8)Pro 1.02(1) 1.11(1) 0.92(1) 0.98(1) 1.01(1) 0.98(1) 1.02(1) 1.09(1) 0.98(1)Gly 3.93(4) 4.00(4) 3.85(4) 3.99(4) 4.02(4) 3.97(4) 4.01(4) 3.95(4) 3.90(4)Ala 1.01(1) 1.04(1) 1.93(2) 1.02(1) 1.05(1) 1.05(1) 1.03(1) 1.03(1) 1.02(1)Cys(1/2)5.13(6) -(6)35.13(6) 5.17(6) 5.32(6) 4.91(6) 5.53(6) 5.23(6) 5.33(6)Val 3.45(4) 3.44(4) 3.49(4) 3.51(4) 3.41(4) 3.67(4) 3.54(4) 3.45(4) 3.48(4)Ile 1.47(2) 1.47(2) 1.49(2) 1.58(2) 1.44(2) 1.65(2) 1.68(2) 1.48(2) 1.47(2)Leu 6.04(6) 6.01(6) 5.86(6) 6.19(6) 6.06(6) 5.67(6) 5.99(6) 6.02(6) 5.98(6)Tyr 3.83(4) 3.74(4) 3.52(4) 4.19(4) 3.90(4) 3.55(4) 3.82(4) 3.73(4) 3.58(4)Phe 2.84(3) 2.85(3) 2.64(3) 2.85(3) 2.84(3) 3.02(3) 2.86(3) 2.72(3) 2.73(3)His 2.35(2) 2.10(2) 2.02(2) 2.14(2) 1.60(2) 2.09(2) 1.07(1) 2.02(2) 2.10(2)Lys 0.97(1) 0.97(1)Arg 0.99(1) 0.90(1) 0.88(1) 1.96(2) 0.91(1) 0.81(1) 0.91(1) 0.89(1) 0.98(1)Aba -(1)3Cya0.90(1)NleOrnNvaMetTrp1 摩爾單位以天冬氨酸計(jì)2 括號(hào)中的數(shù)表示理論上的氨基酸含量3 半胱氨酸加氨基丁酸總共為6.49
表II(續(xù))人胰島素類似物1，2中氨基酸分析實(shí)例號(hào) 11 1213 14 1516 17 18 19氨基酸殘基Asp 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3)Thr 2.76(3) 3.59(3) 2.80(3) 2.80(3) 2.70(3) 2.83(3) 2.85(3) 3.03(3) 2.80(3)Ser 2.69(3) 2.64(3) 2.43(3) 2.78(3) 2.87(3) 2.78(3) 2.97(3) 2.68(3) 2.72(3)Glu 8.04(8) 6.84(7) 6.89(7) 7.09(7) 7.04(7) 7.08(7) 6.94(7) 6.99(7) 7.01(7)Pro 1.11(1) 1.48(1) 1.09(1) 1.12(1) 0.93(1) 1.16(1) 1.10(1) 1.14(1) 1.02(1)Gly 4.04(4) 5.70(5) 3.89(4) 4.03(4) 3.98(4) 4.00(4) 4.12(4) 4.08(4) 3.92(4)Ala 1.05(1) 1.14(1) 1.04(1) 1.05(1) 1.08(1) 1.04(1) 1.09(1) 1.07(1) 1.03(1)Cys(1/2) 5.26(6) 4.54(6) 4.57(6) 5.19(6) 5.00(6) 4.75(6) 5.20(6) 4.82(6) 5.30(6)Val 3.60(4) 3.52(4) 3.58(4) 3.43(4) 3.41(4) 3.51(4) 3.49(4) 3.63(4) 3.51(4)Ile 1.62(2) 1.82(2) 1.70(2) 2.36(3) 1.44(2) 1.51(2) 1.52(2) 1.75(2) 1.55(2)Leu 5.99(6) 5.79(6) 5.95(6) 5.98(6) 6.89(7) 6.10(6) 5.95(6) 5.98(6) 6.11(6)Tyr 3.73(4) 3.89(4) 3.75(4) 3.74(4) 3.64(4) 3.86(4) 3.74(4) 3.80(4) 3.84(4)Phe 2.88(3) 3.47(3) 3.01(3) 2.85(3) 2.71(3) 2.86(3) 2.87(3) 3.13(3) 2.89(3)His 2.08(2) 2.24(2) 3.39(3) 2.07(2) 2.30(2) 2.48(2) 2.20(2) 2.29(2) 2.10(2)Lys0.99(1)Arg 0.91(1) 0.80(1) 0.95(1) 0.89(1) 0.86(1) 1.00(1) 0.87(1) 0.80(1) 1.03(1)AbaCyaNle 0.93(1)Orn 0.96(1)NvaMet 0.98(1)
表II(續(xù))人胰島素類似物1，2中氨基酸分析實(shí)例號(hào) 20 21 22 23 2425 26 27氨基酸殘基Asp3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3) 3.00(3)Thr2.51(3) 3.04(3) 2.76(3) 3.73(4) 2.70(3) 2.80(3) 3.16(3) 2.75(3)Ser2.55(3) 2.69(3) 3.60(4) 2.74(3) 2.76(3) 2.78(3) 2.75(3) 2.63(3)Glu7.25(7) 7.06(7) 6.99(7) 7.07(7) 7.01(7) 7.04(7) 6.98(7) 7.02(7)Pro0.93(1) 2.20(2) 0.95(1) 1.00(1) 0.95(1) 1.11(1) 1.22(1) 1.16(1)Gly3.92(4) 3.93(4) 3.91(4) 3.97(4) 3.94(4) 3.97(4) 4.26(4) 3.98(4)Ala1.09(1) 1.02(1) 1.07(1) 1.03(1) 1.08(1) 1.04(1) 1.14(1) 1.03(1)Cys(1/2) 4.53(6) 5.57(6) 4.31(6) 5.01(6) 4.05(6) 5.17(6) 4.81(6) 5.16(6)Val3.72(4) 3.61(4) 3.37(4) 3.42(4) 3.41(4) 3.43(4) 4.80(5) 3.59(4)Ile1.72(2) 1.56(2) 1.42(2) 1.48(2) 1.44(2) 1.48(2) 1.67(2) 1.59(2)Leu6.01(6) 6.09(6) 5.95(6) 6.02(6) 6.01(6) 5.98(6) 5.96(6) 5.99(6)Tyr3.55(4) 3.93(4) 3.60(4) 3.72(4) 3.78(4) 4.67(5) 3.77(4) 3.75(4)Phe3.59(4) 3.13(3) 2.76(3) 2.85(3) 2.74(3) 2.83(3) 3.28(3) 2.87(3)His2.14(2) 2.10(2) 2.55(2) 2.32(2) 2.82(2) 2.08(2) 2.25(2) 2.02(2)LysArg0.87(1) 1.02(1) 0.85(1) 0.92(1) 1.05(1) 0.86(1) 1.02(1) 0.87(1)AbaCyaNleOrnNva 0.98(1)MetTrp0.89(1)
下列的體內(nèi)檢測(cè)系統(tǒng)可顯示本發(fā)明胰島素類似物的生理作用。
用取自Charles River Laboratories(Portage，MI)的普通雄性Sprague Dawley大鼠作試驗(yàn)動(dòng)物。這些動(dòng)物重量為160-180g，在75°F控制光照(在上午700至下午700有光，下午700至上午700無(wú)光)的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)一周。給這些動(dòng)物隨意飼喂Purina大鼠飼料5001。在使用前使用于每一檢測(cè)的鼠饑餓16小時(shí)。它們?cè)谧畛跏褂脮r(shí)重約200g。饑餓動(dòng)物的重量達(dá)到275g (在三周以內(nèi))后便不再使用。每天用10只一組的雄性大鼠作各種化合物試驗(yàn)(即生物合成人胰島素、豬胰島素和人胰島素類似物)。每周中各組均只用一次。將10個(gè)鼠分成2組，每組5個(gè)鼠。用一組作對(duì)照，只在皮下注射載體，另一組的5個(gè)鼠注射待測(cè)化合物。將蛋白質(zhì)溶于0.05N HCl(pH1.6)中以制備100μg/ml的貯備液。用普通鹽水稀釋該貯備液，皮下注入鼠中。施藥后在0、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)從每個(gè)鼠的尾靜脈中取出100μl血樣。用葡萄糖氧化酶法(Sigma Chemical Co.)比色測(cè)定葡萄糖。計(jì)算每個(gè)鼠從0時(shí)起血液中葡萄糖％數(shù)的變化，試驗(yàn)組中的平均％變化值±SEM(經(jīng)那天對(duì)照組中的平均變化值校正后)可表示最終結(jié)果。
在給定時(shí)間內(nèi)(通常為注射蛋白質(zhì)后1或2小時(shí))，由4-7個(gè)不同濃度的測(cè)試化合物的最大反應(yīng)特色畫出劑量-反應(yīng)特性曲線。由該曲線，測(cè)定ED50的值，從而給出最大低血糖反應(yīng)的1/2蛋白質(zhì)皮下劑量(μg/Kg)。結(jié)果如下表III所示。
表IIIa化合物 最大作用 ED50b生物活性c(％)人胰島素(HI)d667.95 100豬胰島素607.70 103Lys(B28)，Pro(B29)HI666.8117Ala(B28)，Pro(B29)HI7115.0 53Asp(B28)，Pro(B29)HI6410.2 78Asp(B10)，Lys(B28)，Pro(B29)HI5310.7 74Gln(B28)，Pro(B29)HI696.6120Gly(B28)，Pro(B29)HI5810.5 76Met(B28)，Pro(B29)HI5114.6 54Nle(B28)，Pro(B29)HI547.0114Orn(B28)，Pro(B29)HI6012.7 63Pro(B29)HI 638.791Phe(B28)，Pro(B29)HI579.782Val(B28)，Pro(B29)HI538.791a.所有的數(shù)值均表示注射所示化合物后1小時(shí)取出的血樣的分析結(jié)果b.表示皮下劑量μg/Kgc.相對(duì)于人胰島素d.生物合成人胰島素如上所述，本發(fā)明的胰島素類似物聚合成二聚物的傾向小，或換句話說(shuō)不會(huì)自聯(lián)成高分子量形式。因此施用一種或多種該類似物后，很快達(dá)到活性。根據(jù)病人需要施用有效量的結(jié)構(gòu)式I的胰島素類似物，則本發(fā)明的胰島素類似物可有效地治療高血糖。本文所用的“有效量”是指治療或預(yù)防高血糖時(shí)降低或保持血糖含量所需的本發(fā)明一種或多種胰島素類似物的量。該量一般為每天約10-60單位或更多(或如果每mg有29單位，則為約0.3-2mg)。但是，應(yīng)該明白，實(shí)際施用的胰島素類似物的量是由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)情況決定的，這些情況包括治療條件(即高血糖的起因)、待施用的特定類似物、所選用的腸胃外施用途徑、每個(gè)病人的年齡、體重及反應(yīng)以及病人癥狀的嚴(yán)重程度等。因此，不能以任何方式，用上述劑量限定本發(fā)明的范圍。
借助于含有效量的至少一種結(jié)構(gòu)式I的胰島素類似物的藥物組合物與一種或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑或載體相混合，可根據(jù)病人需要(即患高血糖的病人)施用本發(fā)明的胰島素類似物。在這些情況下，一般配制的藥物組合物每ml含100單位或含有效量的胰島素類似物的類似濃度。這些組合物一般(但不是必須的)不口服，可用現(xiàn)有技術(shù)中公知的腸胃外產(chǎn)物的普通賦形劑或載體，用不同的方法制得。參見(jiàn)例如列入本文參考文獻(xiàn)的Remington′s PharmaceuticalSciences 17th edition，Mack PublishingCompany，Easton，PA，USA(1985)。例如將所需量的至少一種結(jié)構(gòu)式I的胰島素類似物懸浮或溶于適用于注射的無(wú)毒液體載體如一種含水介質(zhì)中，并使該懸浮液或溶液消毒，可制備腸胃外施用的藥劑。另一種方法是，將一定量的化合物放在藥瓶中，使藥瓶和它的內(nèi)含物消毒并密封。為便于施用前混合，可再提供一個(gè)附加藥瓶或載體。適用于腸胃外施用的藥物組合物所使用的稀釋劑、賦形劑和載體例如水和水可溶混的有機(jī)溶劑如丙三醇、芝麻油、花生油、含水丙二醇、N，N′-二甲基甲酰胺等。這些藥物組合物的例子包括結(jié)構(gòu)式I的胰島素類似物的無(wú)菌、等滲的鹽水溶液，它能用醫(yī)藥上可接受的緩沖劑緩沖，它是無(wú)熱原的。另一種腸胃外藥物配方含有防腐劑，例如間甲酚或調(diào)節(jié)最終pH的其他試劑如NaOH或HCl。
也可將本發(fā)明胰島素類似物制成適于鼻內(nèi)給藥的藥物組合物。該組合物在EP0200383A3(已列入本文參考文獻(xiàn))中已詳細(xì)公開。簡(jiǎn)單地說(shuō)，該組合物是用下列試劑配制的一種或多種醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、醫(yī)藥上可接受量的堿金屬鹽、銨鹽或?qū)嵸|(zhì)上無(wú)鋅胰島素的游離酸，以及任選的增加吸收量的至少一種吸收增加劑，該吸收增加劑可選自下列化合物(1)油酸或其酯或鹽，(2)液態(tài)山梨聚糖脂肪酸酯，(3)山梨聚糖脂肪酸酯的液體聚氧乙烯衍生物，(4)液體羥基聚乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物。
為證明鼻內(nèi)給藥胰島素類似物L(fēng)ys(B28)，Pro(B29)人胰島素(與人胰島素鈉相比)的效果，進(jìn)行了下列試驗(yàn)。與試驗(yàn)過(guò)程中和試驗(yàn)前，在良好的自然條件下飼養(yǎng)重10-12Kg的雄性警犬。使狗饑餓16小時(shí)，但使其飲水以確保胰島素濃度穩(wěn)定變化。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，用戊巴比妥鈉麻醉該狗，用加熱墊片保持它們的體溫以減少葡萄糖的變化。將胰島素試驗(yàn)樣品(即Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素和人胰島素鈉)溶于蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為7.5。最終的胰島素濃度為每ml70單位。對(duì)8條狗施用的Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素的劑量均為每Kg0.8單位胰島素，同樣對(duì)4條狗施用的人胰島素鈉劑量均為每Kg0.8單位。用劑量測(cè)量噴霧器和改進(jìn)的鼻腔施藥器通過(guò)鼻腔一次噴霧將所有劑量施入鼻腔內(nèi)。在施藥前30、15和0分鐘及施藥后10、20、30、45、60、90、120、180和240分鐘從頸靜脈中取出血液樣品，用于測(cè)定血液葡萄糖的減少。試驗(yàn)結(jié)果如表IV所示。
用上述方法，通過(guò)鼻內(nèi)給藥Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素后血液葡萄糖減少情況與靜脈和皮下施用該類似物的結(jié)果比較如下靜脈施藥時(shí)，含Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素類似物的胰島素溶液都是用大丸劑注射(bolus injection)每Kg0.1單位)注入4條狗的隱靜脈(Saphenous Vein)中，在注射前30、15和0分鐘和注射后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180和240分鐘取出血液樣品。皮下施藥時(shí)，將含Lys(B28)，Pro(B29)人胰島素類似物的胰島素溶液從6條狗的肋外邊表皮下方注入(每Kg0.2單位)。按上述從鼻腔施藥的相同方法取出血樣。比較試驗(yàn)的結(jié)果如表V所示。
表IVa時(shí)間 Lys(B 28)，Pro(B29) 人胰島素鈉(分) 人胰島素(開始時(shí)的％) (開始時(shí)的％)-30 95.4±2.5 101.6±2.4-15 98.2±2.8 102.4±2.90 100 10010 95.4±2.1 100.8±1.920 83.5±3.3 96.0±2.130 72.2±4.5 91.6±2.845 61.6±6.9 89.1±2.360 60.0±6.0 93.6±4.590 71.6±4.6 92.2±1.6120 76.1±3.7 91.3±2.8180 91.2±1.8 93.8±1.8240 85.4±2.7 90.7±2.8a 血葡萄糖含量平均±S.E.M.
表Va時(shí)間 I.V. S.C. 鼻腔(分) (開始時(shí)的％) (開始時(shí)的％) (開始時(shí)的％)-3096.6±6.5 95.6±2.195.4±2.5-1b101.3±1.598.7±2.798.2±2.80 100 100 1005 99.9±2.5 --10 84.8±4.0 99.2±4.895.4±2.115 68.1±2.7 --20 54.5±3.3 91.9±2.483.5±3.330 43.3±2.8 81.6±3.072.2±4.545 - 55.8±3.561.6±6.960 55.3±3.1 35.3±3.160.6±6.090 77.2±6.4 39.5±3.471.6±4.612085.2±4.7 36.1±2.676.1±3.718097.1±6.4 64.5±7.091.2±1.8240100.0±9.681.3±2.485.4±2.7a 血液葡萄糖濃度平均±S.E.M.
權(quán)利要求
1.一種制備藥物制劑的方法，該方法包括使具有治療活性的式(I)胰島素類似物或其可藥用鹽與一種或更多種可藥用的賦形劑或載體混合 其中A21是天冬酰胺、丙氨酸或甘氨酸；B1是苯丙氨酸、天冬氨酸或沒(méi)有；B2是纈氨酸，或B1沒(méi)有時(shí)B2也沒(méi)有；B3是天冬酰胺或天冬氨酸；B10是組氨酸或天冬氨酸；B28是任何氨基酸；B29是L-脯氨酸、D-賴氨酸或L-賴氨酸；Z是-OH；X是Arg-Arg或是沒(méi)有；Y只有當(dāng)有X時(shí)才有，若有Y的話，Y是Glu或一種氨基酸順序，該順序含有所有或部分如下順序Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg，該順序從氨基末端Glu開始。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中A21是天冬酰胺，B1是苯丙氨酸，B2是纈氨酸，B3是天冬酰胺，B10是組氨酸，B28是賴氨酸，B29是L-脯氨酸，Z是-OH，X沒(méi)有，Y沒(méi)有。
全文摘要
在B鏈的29位置和其它任選位置經(jīng)修飾的人胰島素類似物，它具有改進(jìn)的生物化學(xué)和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可用于治療高血糖。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1148984SQ9610663
公開日1997年5月7日 申請(qǐng)日期1996年5月23日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月9日
發(fā)明者R·E·錢斯, R·D·迪馬奇, B·H·弗蘭克, J·E·希爾滋 申請(qǐng)人:伊萊利利公司