專(zhuān)利名稱(chēng)：一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的制備方法，具體地講，本發(fā)明涉及一種利用基因工程制備重組的甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體、并將前體該轉(zhuǎn)化成為甘精胰島素及其類(lèi)似物的方法，此類(lèi)類(lèi)似物的主要結(jié)構(gòu)特征在于C末端含多個(gè)堿性氨基酸。
背景技術(shù)：
甘精胰島素是將人胰島素A鏈上天然排列在第21位的天門(mén)冬酰胺(Asn)置換為甘氨酸(Gly);在B鏈第30位的蘇氨酸(Thr)上添加2個(gè)精氨酸(Arg)而合成的人胰島素類(lèi)似物。精氨酸的加入使這種胰島素分子表面增加了正電荷，等電點(diǎn)從5. 4上升到6. 7，使甘精胰島素在弱酸環(huán)境中呈無(wú)色透明溶液狀，而在接近中性的生理?xiàng)l件下溶解度降低，溶液出現(xiàn)沉淀而呈渾濁狀。甘精胰島素經(jīng)皮下注射后，分子會(huì)立即聚合，并在皮下形成甘精胰 島素的沉淀物，延緩溶解和吸收的時(shí)間，起到長(zhǎng)效的作用。而將人胰島素A21位上的天門(mén)冬酰胺置換成甘氨酸，增加了甘精胰島素在弱酸環(huán)境中的穩(wěn)定性，提高了制劑的穩(wěn)定性。現(xiàn)有的研究表明，甘精胰島素每日只需皮下注射一次，作用可以持續(xù)24小時(shí)，且無(wú)明顯峰值，可以較好的模擬正?；A(chǔ)胰島素的分泌。甘精胰島素在療效相近的基礎(chǔ)上比中性精蛋白鋅(NPH)胰島素有更低的低血糖發(fā)生率。甘精胰島素的制備方法與胰島素類(lèi)似，可采用基因工程技術(shù)先制備前體，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)肽制備成品。其中，前體的制備方法僅需在胰島素原的基礎(chǔ)上將表達(dá)的氨基酸序列進(jìn)行相應(yīng)的改動(dòng)，可以使用同樣的表達(dá)載體及宿主菌，比較經(jīng)典的工藝為Eli Lilly的工藝US4，430，266、Novo 的工藝 US 4，916，212、Sanof i (Hoechst)的工藝 US 5，663，291 ;而轉(zhuǎn)肽的方法則由于末端兩個(gè)精氨酸的引入而與胰島素的工藝不同，在Sanofi-Aventis的專(zhuān)利申請(qǐng)(US 2009/0192073 Al)中，采用先制備Arg(B31)Arg(B32)Gly(A21)胰島素前體，用胰酶轉(zhuǎn)肽后得Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰島素及Arg(B31)Gly (A21)胰島素兩種結(jié)構(gòu)，分離后前者為甘精胰島素，后者在酸性條件下胰酶的作用下加入帶保護(hù)基團(tuán)的Arg，最后脫保護(hù)得甘精胰島素及其類(lèi)似物。這種方法的缺點(diǎn)在于前體轉(zhuǎn)肽后形成的兩種結(jié)構(gòu)理論得率為各50%，且結(jié)構(gòu)較為一致，分離得率低。引入保護(hù)基團(tuán)的Arg的反應(yīng)條件均為偏酸性12°C左右(需制冷)，得率偏低，在其實(shí)施例中加保護(hù)基團(tuán)的Arg的得率報(bào)道為> 60%。而且，US2009/0192073使用含保護(hù)基團(tuán)的堿性氨基酸，成本過(guò)高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的制備方法。在本發(fā)明的制備方法中避免使用含保護(hù)基團(tuán)的堿性氨基酸，從而降低了成本；而且，該方法同時(shí)避免了制備過(guò)程中形成兩種不同結(jié)構(gòu)的Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰島素和Arg (B31) Gly (A21)胰島素，從而簡(jiǎn)化了分離步驟，提高了產(chǎn)物收率。一方面，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的制備方法，該方法包括如下步驟
(I)利用基因工程方法制備B鏈C端含多個(gè)堿性氨基酸的甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體；(2)利用氨基酸側(cè)鏈保護(hù)劑使胰酶特異性識(shí)別精氨酸或賴(lài)氨酸，在保護(hù)劑、胰酶的作用下獲得帶保護(hù)基團(tuán)的甘精胰島素及其類(lèi)似物；或者不保護(hù)直接使用特異作用于Arg的梭菌蛋白酶或特異作用于Lys的胞內(nèi)蛋白酶Lys C ；(3)任選地通過(guò)加入羧肽酶而脫除C末端未保護(hù)的堿性氨基酸；(4)脫保護(hù)得到甘精胰島素及其類(lèi)似物。 上述的制備方法中，甘精胰島素及其類(lèi)似物優(yōu)選為通式I所表示的、具有A鏈和B鏈的物質(zhì)A 鏈=Gly-AS-ASO-R1B 鏈Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η(通式I)其中，在上述通式I的Α、Β鏈間及鏈內(nèi)二硫鍵的位置同人胰島素或動(dòng)物源胰島素；Α2-Α20.Β2-Β29表示與人胰島素或動(dòng)物源胰島素相同的氨基酸殘基，Α2-Α20對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的A鏈序列，Β2-Β29對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的B鏈序列；R1是Asn、Ser和Gly殘基中的一個(gè)；R2和R3分別是Arg殘基、Lys殘基中的一種,其中，如果R2是Arg殘基,則R3是Lys殘基；如果R2是Lys殘基，則R3是Arg殘基；m是1-4之間的整數(shù)；η是O或I。在上述制備方法的步驟(2)中，氨基酸側(cè)鏈保護(hù)劑是指精氨酸或賴(lài)氨酸的保護(hù)齊U，這類(lèi)保護(hù)劑能可逆地與精氨酸或賴(lài)氨酸殘基反應(yīng)。例如，對(duì)鏈內(nèi)的Lys進(jìn)行保護(hù)時(shí)，可使用酸酐類(lèi)保護(hù)劑如琥珀酸酐、檸康酐等(此處可以多列舉其它的保護(hù)劑)。在上述制備方法的步驟(3)中，脫保護(hù)包括調(diào)節(jié)pH、通過(guò)透析或柱上脫保護(hù)。另一方面，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種如通式I所表示的甘精胰島素及其類(lèi)似物。再一方面，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體，其中，該前體含有通式I的A鏈及B鏈的一段氨基酸序列，而且，B鏈與A鏈之間有連接肽，該前體序列中η = I。優(yōu)選地，上述前體中的連接肽是包括C肽、小C肽在內(nèi)的各種連接肽，該連接肽的特點(diǎn)在于C末端為通式I中的R3。優(yōu)選地，B鏈N端可融合有未切掉的信號(hào)肽序列、有助于復(fù)性的分子伴侶序列或其它連接肽序列，該連接肽的特點(diǎn)在于C末端為通式I中的R3。根據(jù)本發(fā)明，在前體結(jié)構(gòu)上稍作改動(dòng)就能應(yīng)用于C末端2個(gè)以上堿性氨基酸的甘精胰島素及其類(lèi)似物的生產(chǎn)中，應(yīng)用范圍廣。胰酶酶切識(shí)別為點(diǎn)為堿性氨基酸的C末端，因而在使用胰酶直接酶轉(zhuǎn)時(shí)，只能直接獲得C端帶一個(gè)堿性氨基酸的肽鏈，本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)在于對(duì)堿性氨基酸Lys和Arg其中的一種進(jìn)行保護(hù)修飾，使胰酶只作用于沒(méi)有保護(hù)的另外一種堿性氨基酸，從而可得到如通式I中表示的C端帶多個(gè)堿性氨基酸的肽鏈。本發(fā)明提供的制備甘精胰島素及其類(lèi)似物的方法更為簡(jiǎn)便，得率高，而且應(yīng)用范圍更廣，適用于兩個(gè)以上的堿性氨基酸的引入。US2009/0192073 Al中所報(bào)道的兩個(gè)堿性氨基酸的得率為>60%，按該申請(qǐng)的技術(shù)路線，可以推算如果要引入三個(gè)堿性氨基酸，可以保證的得率僅為> 36%。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的常規(guī)條件。除非另外說(shuō)明，否則所有百分比和分?jǐn)?shù)按重量計(jì)。


圖I顯示了由甘精胰島素前體獲得成熟的甘精胰島素的轉(zhuǎn)肽過(guò)程；圖2為發(fā)酵后全菌蛋白SDS-PAGE圖，圖中泳道I為重組大腸桿菌全菌蛋白，圖中箭頭所示的目標(biāo)蛋白條帶為所表達(dá)的甘精胰島素前體的融合蛋白，其分子量約17. 8KD ；圖3為發(fā)酵后取發(fā)酵液進(jìn)行Tricine SDS-PAGE分析的結(jié)果，圖中泳道1、2、3為不同時(shí)間發(fā)酵時(shí)間的重組酵母上清，依次為誘導(dǎo)72h、60h和48h的結(jié)果，圖中箭頭所示為分泌 表達(dá)的甘精胰島素前體；圖4為大腸桿菌表達(dá)前體蛋白粗純品的SDS-PAGE圖，圖中泳道1、2為大腸桿菌表達(dá)前體蛋白粗純品；圖5為酵母表達(dá)前體蛋白粗純品的SDS-PAGE圖，圖中泳道I為酵母表達(dá)的前體蛋白的粗純品；圖6為酵母表達(dá)前體粗純后的HPLC分析圖，其分析條件為A 0. 1% TFA B 0. 1% TFA 80% 乙腈C 8 柱 15cm I. Oml/min 30% 45% B 梯度洗脫；圖7為純化后的甘精胰島素的HPLC分析圖，其分析條件為A 0. 1% TFA B 0. 1% TFA 80% 乙腈C8 柱 15cm I. Oml/min 30% 45% B 梯度洗脫；圖8為產(chǎn)物的質(zhì)譜分析圖。
具體實(shí)施方案I、重組制備甘精胰島素前體利用基因工程技術(shù)大腸桿菌或酵母表達(dá)氨基酸序列為含B-Arg(B31)Arg(B32)Lys-A Gly (A21)的甘精胰島素前體序列，其中如為融合表達(dá)，載體蛋白的C端與目標(biāo)序列的連接以Lys結(jié)尾，如AB鏈間引入完整的C肽或其它連接肽的C端也以Lys結(jié)尾，即所表達(dá)的蛋白的通式為x-B-Arg(B31)Arg(B32)Lys-y-A Gly(A21)(見(jiàn)附圖I中結(jié)構(gòu)I)，其中如存在X，y則為C末端為L(zhǎng)ys的序列(X指的是目標(biāo)序列N端融合的序列，包含載體蛋白序列，有助于蛋白折疊的分子伴侶及其它連接序列；y指的是類(lèi)C肽及其它連接序列)。2、折疊正確的前體如為大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)包含體復(fù)性得到折疊正確的產(chǎn)物，V8蛋白酶切鑒定，如酵母表達(dá)產(chǎn)物則V8蛋白酶切鑒定二硫鍵后直接使用。3、鏈內(nèi)Arg的保護(hù)對(duì)折疊正確的前體內(nèi)的Arg進(jìn)行修飾保護(hù)，可使胰酶及羧肽酶不識(shí)別帶保護(hù)基團(tuán)的Arg，可用的修飾劑有2，3 丁二酮、苯甲酰甲醛、環(huán)己二酮、己二醛、甲基己二醛、茚三酮等。
4、轉(zhuǎn)肽(由甘精胰島素前體獲得成熟的甘精胰島素)使用胰酶酶解肽鍵內(nèi)的Lys的羧基端，對(duì)Arg保護(hù)后的甘精胰島素前體進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，得到帶保護(hù)基團(tuán)的甘精胰島素及其類(lèi)似物A鏈Gly(A21)，B鏈B_pArg(B31)pArg(B32)Lys0其中pArg表示帶保護(hù)基團(tuán)的Arg,AB鏈間由二硫鍵相連,結(jié)構(gòu)如附圖I中結(jié)構(gòu)3。此步也可以直接使用特異作用于Lys的胞內(nèi)蛋白酶Lys C。接著在羧肽酶的作用下，去除C端多余的Lys，得到帶保護(hù)基團(tuán)的甘精胰島素A鏈Gly(A21)，B鏈B_pArg (B31) pArg (B32)，AB鏈間由二硫鍵相連，結(jié)構(gòu)如附圖I中結(jié)構(gòu)4。最后通過(guò)透析柱層析降低修飾劑濃度、調(diào)節(jié)PH等方法除去保護(hù)基團(tuán)后得到甘精胰島素A鏈Gly(A21)，B鏈B_Arg(B31)Arg(B32)，AB鏈間由二硫鍵相連，結(jié)構(gòu)如附圖I中結(jié)構(gòu)5，轉(zhuǎn)肽過(guò)程如附圖I所示，其中B22位的Arg由于位阻關(guān)系，該位點(diǎn)的保護(hù)效率不影響最終結(jié)果，因而附圖中未標(biāo)注是否帶保護(hù)基團(tuán)。5、其它結(jié)構(gòu)同理，如需制備C末端含兩個(gè)或兩個(gè)以上Arg的甘精胰島素及其類(lèi)似物，僅需在基因工程制備前體時(shí)，表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的通式為X-B-(Arg)nLys-y-A Gly (A21)，其中如存在x，y則為C末端為L(zhǎng)ys的序列。按照2-4描述的方法進(jìn)行操作即能得到通式為A鏈Gly (A21)，B鏈=B-(Arg) η胰島素類(lèi)似物或者按2_4描述的方法，省去羧肽酶B酶解的步驟，就能獲得A鏈Gly(A21)，B鏈B-(Arg) nLys胰島素類(lèi)似物。如需制備C末端含多個(gè)Lys的甘精胰島素及其類(lèi)似物，僅需在基因工程制備前體時(shí)，表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的通式為x-Β-(Lys)nArg-y-AGly (A21),其中如存在x,y則為C末端為Arg的序列。制備折疊正確的前體后，對(duì)鏈內(nèi)的Lys進(jìn)行保護(hù)，可使用酸酐類(lèi)保護(hù)劑如琥珀酸酐、檸康酐等，或不保護(hù)直接使用特異作用于Arg的梭菌蛋白酶。同樣的操作方法即可獲得通式為A鏈Gly (A21)，B鏈B-(Lys)n胰島素類(lèi)似物或者省去羧肽酶的步驟獲得A鏈Gly(A21)，B鏈B-(Lys)n Arg胰島素類(lèi)似物。如需制備A，B鏈內(nèi)有突變的胰島素類(lèi)似物，僅需改變前體表達(dá)時(shí)的氨基酸序列。此A、B鏈內(nèi)有突變的胰島素類(lèi)似物，優(yōu)選的突變位點(diǎn)為A21位，其優(yōu)選的氨基酸序列為Gly、Asn、Ser0優(yōu)選實(shí)施例實(shí)施例I :利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建基因工程菌選擇大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，利用融合PCR技術(shù)獲得表達(dá)甘精胰島素前體的基因片段，使其翻譯出的氨基酸序列為F VNQHL CG SHLVEALYLVCGERGFF YT PKTRRKEAEDLQVGQVE LGGGPGAGSLQPLALEGSLQRKGIVEQCCTS I CSLYQL EN YC G，為提高表達(dá)量以及復(fù)性效率，在N端融合一段蛋白以連接肽GSK連接，本實(shí)施例選用的融合序列為葡萄球菌蛋白A(SPA)上的一段，M ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQ SLK DD PSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNK。引入NdeI EcoR I酶切位點(diǎn)后連接入表達(dá)載體PET 17b中，經(jīng)常規(guī)基因工程作后獲得表達(dá)甘精胰島素前體的基因工程菌，發(fā)酵后全菌蛋白SDS-PAGE見(jiàn)附圖2，附圖2中的目標(biāo)蛋白條帶為所表達(dá)的甘精胰島素前體的融合蛋白，成功獲得了甘精胰島素前體的融合蛋白，目標(biāo)蛋白條帶占菌體總蛋白的25%以上。實(shí)施例2 :利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建基因工程菌選擇畢赤酵母偏愛(ài)密碼子，利用融合PCR技術(shù)獲得表達(dá)甘精胰島素前體的基因片段，使其翻譯出的氨基酸序列為F V N Q H L CG SHLVEALYLVCGER G F F YTPKTRRKGIVEQCCTSICSLYQLENY C G,為提高信號(hào)肽的切割效率并保證N端的完整性，在N端加入連接片段K REEAEAEAEPK ，引入Xho I EcoR I酶切位點(diǎn)后連接入載體pPIC 9中，再以Sal I/Sac I克隆入表達(dá)載體PPIC 9k中，經(jīng)常規(guī)基因工程作后獲得表達(dá)甘精胰島素前體的基因工程菌，發(fā)酵后取發(fā)酵液進(jìn)行Tricine SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)附圖3，附圖3中的目標(biāo)蛋白條帶為分泌表達(dá)的甘精胰島素前體，成功分泌表達(dá)了甘精胰島素前體。實(shí)施例3 :表達(dá)產(chǎn)物的粗純實(shí)施例I中大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，用50mM PB+2mM EDTA, pH7. 5破菌；用50mMTris-HCl+2mM EDTA+0. 5%Triton X-100,pH8. 0 ；50mMTris-HCl+2mM EDTA+IM Urea,pH8. 0依次洗包；用50通 Tris-HCl+2mM EDTA+8M Urea，pH9.0變性；50mM Tris_HCl+2mM EDTA+8MUrea+0. 3M Na2S03, pH9. 0 磺化；50mM Gly+2mM EDTA+IM Urea+lmM β -Me, pH9. 5 復(fù)性后，上Q柱，pH8. O鹽濃度梯度洗脫后得到粗純的前體蛋白，SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)附圖4，結(jié)果表明，經(jīng)復(fù)性粗純后能獲得純度較高的前體蛋白，分子量約17. 8KD，主要的雜質(zhì)為復(fù)性過(guò)程 中形成的二聚體。實(shí)施例2中酵母表達(dá)產(chǎn)物稀釋后調(diào)pH至4. 0，上CM柱pH及鹽梯度洗脫，得粗純的前體蛋白，Tricine SDS-PAGE分析結(jié)果如附圖5所示粗純后條帶單一，HPLC分析如附圖6所示，純度在96%以上。實(shí)施例4 :利用環(huán)己二酮保護(hù)的甘精胰島素轉(zhuǎn)肽取含折疊正確的B-Arg(B3l)Arg(B32)K-A Gly (A21)的粗蛋白，以 O. 25M ρΗ9· O 的硼酸鈉作為緩沖體系，根據(jù)需保護(hù)的Arg的摩爾濃度按照25倍過(guò)量加入環(huán)己二酮，25度反應(yīng)6小時(shí)。按目標(biāo)蛋白與胰酶的質(zhì)量比2000 1，加入胰酶，5度作用2. 5小時(shí)，加入自制重組羧肽酶B粗品，25度反應(yīng)3小時(shí)。調(diào)節(jié)pH至3. O以下，終止酶轉(zhuǎn)反應(yīng)。柱層析去除殘留的胰酶和羧肽酶以及體系中多余的環(huán)己二酮。調(diào)節(jié)pH至9. OJ^pH 9. O的Tris-乙酸緩沖體系透析或上柱后用PH 9. O的Tris-乙酸脫保護(hù)基即得到甘精胰島素A鏈Gly (A21)，B鏈B-Arg (B31) Arg (B32)，反相純化分離，HPLC分析如附圖7所示獲得了高純度的蛋白，質(zhì)譜分析見(jiàn)附圖8，甘精胰島素理論分子量6063，圖中3032. 5峰為雙電荷峰，結(jié)果顯示成功獲得的高純度蛋白分子量與甘精胰島素一致。實(shí)施例5 :利用檸康酐保護(hù)的甘精胰島素及其類(lèi)似物轉(zhuǎn)肽取含折疊正確的B-Lys (B31) Lys (B32) Arg-A Gly (A21)的粗蛋白，以 O. 25M ρΗ9· O的硼酸鈉作為緩沖體系，根據(jù)需保護(hù)的Lys的摩爾濃度按照25倍過(guò)量加入檸康酐，25度反應(yīng)6小時(shí)。按目標(biāo)蛋白與胰酶的質(zhì)量比2000 1，加入胰酶，5度作用2. 5小時(shí)，加入自制重組羧肽酶B粗品，25度反應(yīng)3小時(shí)。調(diào)節(jié)pH至3. O以下，終止酶轉(zhuǎn)反應(yīng)，脫除檸康酐保護(hù)基團(tuán)，即得到甘精胰島素及其類(lèi)似物A鏈Gly(A21)，B鏈B_Lys (B31) Lys (B32)。
權(quán)利要求
1.一種制備甘精胰島素及其類(lèi)似物的方法，該方法包括如下步驟 (1)利用基因工程方法制備B鏈C端含多個(gè)堿性氨基酸的甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體； (2)利用氨基酸側(cè)鏈保護(hù)劑使胰酶特異性識(shí)別精氨酸或賴(lài)氨酸，在保護(hù)劑、胰酶的作用下獲得帶保護(hù)基團(tuán)的甘精胰島素及其類(lèi)似物；或者不保護(hù)直接使用特異作用于Arg的梭菌蛋白酶或特異作用于Lys的胞內(nèi)蛋白酶Lys C ； (3)任選地通過(guò)加入羧肽酶而脫除C末端未保護(hù)的堿性氨基酸； (4)脫保護(hù)得到甘精胰島素及其類(lèi)似物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述的甘精胰島素及其類(lèi)似物為通式I所表示的、具有A鏈和B鏈的物質(zhì) A 鏈 iGly^O-R1 B 鏈Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B鏈間及鏈內(nèi)二硫鍵的位置同人胰島素或動(dòng)物源胰島素；A2-A20.B2-B29表示與人胰島素或動(dòng)物源胰島素相同的氨基酸殘基，A2-A20對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的A鏈序列，B2-B29對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的B鏈序列； R1是Asn、Ser和Gly殘基中的一個(gè)； R2和R3分別是Arg殘基、Lys殘基中的一種，其中，如果R2是Arg殘基，則R3是Lys殘基；如果R2是Lys殘基，則R3是Arg殘基；m是1-4之間的整數(shù)；n是0或I。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，m= 2。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，在所述方法的步驟(2)中，所述氨基酸側(cè)鏈保護(hù)劑是精氨酸或賴(lài)氨酸的保護(hù)劑，該保護(hù)劑能可逆地與精氨酸或賴(lài)氨酸殘基反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)鏈內(nèi)Arg進(jìn)行修飾保護(hù)，所用的修飾劑為2，3 丁二酮、苯甲酰甲醛、環(huán)己二酮、己二醛、甲基己二醛、或茚三酮，優(yōu)選為環(huán)己二酮。
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其中，在所述方法的步驟(3)中，脫保護(hù)包括調(diào)節(jié)pH、通過(guò)透析或柱上脫保護(hù)。
7.一種采用如權(quán)利要求1-6之一所述方法制備的甘精胰島素及其類(lèi)似物，其中，所述的甘精胰島素及其類(lèi)似物為通式I所表示的、具有A鏈和B鏈的物質(zhì) A 鏈 iGly^O-R1 B 鏈Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B鏈間及鏈內(nèi)二硫鍵的位置同人胰島素或動(dòng)物源胰島素；A2-A20.B2-B29表示與人胰島素或動(dòng)物源胰島素相同的氨基酸殘基，A2-A20對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的A鏈序列，B2-B29對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的B鏈序列； R1是Asn、Ser和Gly殘基中的一個(gè)； R2和R3分別是Arg殘基、Lys殘基中的一種，其中，如果R2是Arg殘基，則R3是Lys殘基；如果R2是Lys殘基，則R3是Arg殘基；m是1-4之間的整數(shù)；n是0或I。
8.如權(quán)利要求7所述的甘精胰島素及其類(lèi)似物，其中，m= 2。
9.一種制備如權(quán)利要求7-8之一所述甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體，其中，該前體含有如下通式I的A鏈及B鏈的一段氨基酸序列，而且，B鏈與A鏈之間有連接肽 A 鏈 iGly^O-R1 B 鏈Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η (通式I) 其中，在上述通式I的A、B鏈間及鏈內(nèi)二硫鍵的位置同人胰島素或動(dòng)物源胰島素；A2-A20.B2-B29表示與人胰島素或動(dòng)物源胰島素相同的氨基酸殘基，A2-A20對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的A鏈序列，B2-B29對(duì)應(yīng)于人胰島素、動(dòng)物胰島素或胰島素類(lèi)似物的B鏈序列； R1是Asn、Ser和Gly殘基中的一個(gè)； R2和R3分別是Arg殘基、Lys殘基中的一種，其中，如果R2是Arg殘基，則R3是Lys殘基；如果R2是Lys殘基，則R3是Arg殘基；m是1-4之間的整數(shù)，優(yōu)選為2 ;n = I。
10.如權(quán)利要求9所述的前體，其中，所述前體中的連接肽是包括C肽、小C肽在內(nèi)的各種連接肽，該連接肽的C末端為通式I中的R3 ;優(yōu)選地，所述前體的B鏈N端融合有未切掉的信號(hào)肽序列、有助于復(fù)性的分子伴侶序列或其它連接肽序列，該連接肽的C末端為通式I中的R3。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甘精胰島素及其類(lèi)似物的制備方法，該方法包括如下步驟(1)利用基因工程方法制備B鏈C端含多個(gè)堿性氨基酸的甘精胰島素及其類(lèi)似物的前體；(2)利用氨基酸側(cè)鏈保護(hù)劑使胰酶特異性識(shí)別精氨酸或賴(lài)氨酸，在保護(hù)劑、胰酶的作用下獲得帶保護(hù)基團(tuán)的甘精胰島素及其類(lèi)似物；或者不保護(hù)直接使用特異作用于Arg的梭菌蛋白酶或特異作用于Lys的胞內(nèi)蛋白酶Lys C；(3)任選地通過(guò)加入羧肽酶而脫除C末端未保護(hù)的堿性氨基酸；(4)脫保護(hù)得到甘精胰島素及其類(lèi)似物。本發(fā)明的制備方法更為簡(jiǎn)便，得率高，而且應(yīng)用范圍更廣，適用于兩個(gè)以上的堿性氨基酸的引入。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102816785SQ201210163529
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者夏晶 申請(qǐng)人:上海華誼生物技術(shù)有限公司