端羥基聚乙二醇化的人胰島素及其類似物的偶聯(lián)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于胰島素技術(shù)(C07K14/62)領(lǐng)域，涉及用端羥基聚乙二醇修飾人胰島素或其類似物而形成的偶聯(lián)物，其顯著降低了免疫原性，具有更高的用藥安全性。另外，本發(fā)明還涉及該偶聯(lián)物的制備方法和涉及預(yù)防或治療的應(yīng)用等。
【專利說明】端超基聚乙二醇化的人膜島轟及其類似物的偶聯(lián)物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于膜島素技術(shù)（C07K14/62)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用端輕基聚己 二醇修飾人膜島素或其類似物而形成的偶聯(lián)物，其具有更高的用藥安全性。另外，本發(fā)明還 涉及該偶聯(lián)物的制備方法和應(yīng)用等。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病值i油etes Melli化S，DM)是一種膜腺功能病變的代謝疾病，由遺傳因素、 免疫功能奈亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各種致病因子作用于機(jī)體， 導(dǎo)致膜島功能減退、膜島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝奈 吉L臨床上W高血糖為主要特點。其中，1型糖尿病屬于膜島素依賴型糖尿病，其病人必須 依賴外源性膜島素進(jìn)行替代治療；2型糖尿病屬非膜島素依賴型糖尿病，病人由于產(chǎn)生膜 島素抵抗或體內(nèi)膜島目細(xì)胞受損，引起膜島素量的相對不足，隨著病情的發(fā)展，通常最終 也需用膜島素治療。
[0003] 人膜島素（Human insulin, Ins),其由A、B兩條膚鏈組成，其中，A鏈含21個氨基 酸，其氨基酸序列為；Gly lie Val Glu Gin 切S 切S T虹 Ser lie 切S Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr切s Asn;B鏈含30個氨基酸，其氨基酸序列為；Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr化r Pro Lys化r。人膜島素中共有H對二硫鍵，其中A鏈第6位半脫氨酸（A6(切s)) 與A鏈第11位半脫氨酸（A11 (切S))形成一對二硫鍵;A鏈第7位半脫氨酸（A7 (切S))與 B鏈第7位半脫氨酸炬7 (切S))形成一對二硫鍵；A鏈第20位半脫氨酸（A20 (切S))與B鏈 第19位半脫氨酸炬19 (切S))形成一對二硫鍵，后二者使A、B兩鏈連接起來。
[0004] 目前已開發(fā)出了許多人膜島素類似物，其中已批準(zhǔn)臨床使用或臨床研究的主要包 括DesB30 (其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上缺失了人膜島素B鏈第30 位蘇氨酸訂虹)）、甘精膜島素（Lantus，其氨基酸序列是在人膜島素氨基序列的基礎(chǔ)上將A 鏈第21位天冬醜胺（Asn)突變成甘氨酸佑ly)，同時在人膜島素的B鏈氨基酸序列后添加 了兩個精氨酸（Arg))、口冬膜島素（Aspart，其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基 礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第28位脯氨酸突變成天冬氨酸（Asp))、谷賴膜島素佑lulisine， 其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第3位谷氨酸佑lu) 突變成賴氨酸（Lys)，同時把B鏈的第29位賴氨酸（Lys)突變谷氨酸佑lu))、賴脯膜島素 (Lispro,其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第28位脯 氨酸（Pro)突變成賴氨酸（Lys),同時把B鏈的第29位賴氨酸突變成脯氨酸）W及地特膜 島素（Levemir)、德谷膜島素值egludec)等。
[0005] 聚己二醇（陽G)修飾可W延長蛋白在體內(nèi)的半衰期，通常還被認(rèn)為可W明顯降 低免疫原性，從而提高用藥安全性。聚己二醇化的膜島素及其類似物的偶聯(lián)物也有報 道，例如中國專利（申請）第 02815261、200410089050、200610118923、200710085552、 200780036662、200810011478、200810232828、200980122164、201110063821 號等所記載的。 由于單甲氧基聚己二醇（mPEG)的端部是甲氧基該樣的非反應(yīng)性基團(tuán)，只能定向地依靠另 一端的偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)（如含醋（基）、酵（基）氨基、駿基、甚至可W含輕基，等）與要修 飾的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，提高了反應(yīng)的專一性，所W目前聚己二醇修飾蛋白質(zhì)（尤其是是膜島素 及其類似物）的技術(shù)中基本上都選擇使用mPEG。
[0006] 然而，越來越多的證據(jù)表明，聚己二醇本身也會引入新的免疫原性，也能誘發(fā) 機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗PEG的抗體，該樣一方面會中和掉聚己二醇修飾的藥物，降低 其療效，更嚴(yán)重的是，還會帶來潛在的用藥安全性問題，誘發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)，甚至導(dǎo)致病 人死亡。例如，大量報道表明，在病人使用化gl〇ticase(聚己二醇化的重組豬尿酸氧 化酶，商品名為拉Tstexxa?)后，有70?90%的病人體內(nèi)檢測到抗PEG的抗體，尤其是 其二H期臨床試驗過程中發(fā)生的死亡病例被認(rèn)為與其免疫變態(tài)反應(yīng)有關(guān)（Cortes, J.et al. , Control of plasma uric acid in adults at risk for tumor Lysis syndrome ： efficacy and safety of rasburicase alone and rasburicase followed by allopurinol compared with allopurinol alone-results of a multicenter phase III study. J Clin 0ncol，2010. 28(27) ;p. 4207-13 ;Sundy, J.S.et al. Reduction of plasma urate levels following treatment with multiple doses of Pegloticase(polyethylene glycol-conjugated uricase)in patients with treatment-failure gout ：results of a phase II randomized study. Arthritis Rheum,2008. 58(9) :p.2882-91 ;Krystexxa Prescribing Information ：http://www. krystexxa. com/pdfs/KRYSTEXXA Prescribing- Information)。
[0007] 本發(fā)明人研究也發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)選用的聚己二醇修飾人膜島素及其類似物而獲得 的偶聯(lián)物也會產(chǎn)生抗PEG的抗體，由于膜島素需要長期使用，在藥品管理部口和公眾對藥 品安全性日益關(guān)注的趨勢下，其用藥安全性問題不容低估。經(jīng)過本發(fā)明人長期而艱苦的研 究，在幾乎要放棄聚己二醇修飾體系而改用其他免疫原性可能對人更低的修飾體系（如人 IgG或HSA等）的情況下，十分令人意外地發(fā)現(xiàn)了，盡管端輕基聚己二醇由于包含具有反應(yīng) 性的輕基，干擾反應(yīng)，增加副產(chǎn)物，使得現(xiàn)有技術(shù)中幾乎都不選擇使用，但是端輕基聚己二 醇化的人膜島素及其類似物的偶聯(lián)物能夠顯著降低免疫原性，大幅增加了用藥安全性。另 夕F，該偶聯(lián)物可W基本沿用原聚己二醇修飾藥品的審批流程和規(guī)范，降低了開發(fā)藥品的成 本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供新的聚己二醇化的人膜島素或其類似物的偶聯(lián) 物。另外，本發(fā)明還提供了該偶聯(lián)物的制備方法和應(yīng)用等。
[0009] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了如式I所示的膜島素或其類似物的偶聯(lián)物 或其藥學(xué)上可接受的鹽，
[0010] {:出0-(邸2邸2〇) n] p-L} t-Y (式 u
[0011] 其中，
[0012] Y為膜島素或其類似物；
[001引 L為連接基團(tuán)；
[0014] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[00巧]p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; [001引 t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0017] -為共價鍵。
[0018] 在本文中，結(jié)構(gòu)式具有生物大分子領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的意義，該不完全相同于 嚴(yán)格的化學(xué)式。其中，小括號（即"0")具有化學(xué)式意義上的含義，指的是小括號中的結(jié)構(gòu) 線性順序共價連接，重復(fù)n次。
[0019] 中括號（即"[]")指的是中括號中的結(jié)構(gòu)平行共價連接于L(或L')上的不同位 點，連接于L(或L')上的該結(jié)構(gòu)共有P個。當(dāng)P > 1時，即為分支型的聚己二醇；當(dāng)P = 1 時，即為直鏈型的聚己二醇。本發(fā)明優(yōu)選后者。
[0020] 大括號（即"W")值的是大括號中的結(jié)構(gòu)平行共價連接于Y上的不同位點，連接 于Y上的該結(jié)構(gòu)共有t個。當(dāng)t > 1時，即為多PEG修飾的膜島素或其類似物；當(dāng)t = 1時， 即為單PEG修飾的膜島素或其類似物。本發(fā)明優(yōu)選后者。
[0021] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，P為1且t為1，即單直鏈PEG修飾，相應(yīng)地，本發(fā)明 的膜島素或其類似物的結(jié)構(gòu)為冊-(邸2邸2〇)。斗-￥。另外，在本發(fā)明的【具體實施方式】中，式I 中的冊-(邸2邸2〇)。-1部分的分子量為20邸或40邸。
[0022] 在本文中，"藥學(xué)上可接受的鹽"指適于與人或動物的組織接觸而且無過多的毒 性、刺激或變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。該種鹽可W在本發(fā)明偶 聯(lián)物的最終分離和純化的過程中制備，也可W將偶聯(lián)物與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無機(jī)酸或堿反應(yīng)單 獨制備。代表性酸加成鹽包括但不限于己酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、巧樣酸鹽、天冬氨酸鹽、 苯甲酸鹽、苯賴酸鹽、硫酸氨鹽、下酸鹽、棒腦酸鹽、棒腦賴酸鹽、甘油磯酸鹽、半硫酸鹽、庚 酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氨漠酸鹽、氨楓酸鹽、2-輕基己賴酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、 甲賴酸鹽、煙酸鹽、2-蔡賴酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、玻巧酸鹽、酒石酸鹽、磯酸 鹽、谷氨酸鹽、碳酸氨鹽、對甲苯賴酸鹽和十一焼酸鹽。能用于形成藥學(xué)上可接受鹽的優(yōu)選 的酸是鹽酸、氨漠酸、硫酸、磯酸、草酸、馬來酸、玻巧酸和巧樣酸。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽 中的陽離子包括但不限于堿金屬或堿±金屬離子如裡、軸、鐘、巧、鎮(zhèn)和鉛等，W及非毒性季 饋陽離子如饋、四甲基饋、四己基饋、甲基胺、二甲基胺、H甲基胺、H己基胺、二己基胺、己 基胺、二己胺、己醇胺、二己醇胺、脈巧、脈嗦等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磯酸鹽、化is和己酸 鹽。本發(fā)明的偶聯(lián)物可W單獨使用，也可W W藥學(xué)上可接受的鹽形式使用。
[0023] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，膜島素是人膜島素。 人膜島素的氨基酸序列是本領(lǐng)域熟知的，其可W提取獲得，也可W人工化學(xué)合成或者DNA 重組技術(shù)表達(dá)獲得。人膜島素在I960年代就能人工合成。
[0024] 也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，膜島素類似物是 DesB30、甘精膜島素（LanUis)、n冬膜島素（Aspart)、地特膜島素（Levemir)、谷賴膜島素 佑lulisine)、德谷膜島素值egludec)或賴脯膜島素（Lispro)。該些膜島素類似物已經(jīng)被 批準(zhǔn)臨床使用或臨床研究，都具備膜島素的活性和功能，甚至優(yōu)于人膜島素本身的活性和 功能。
[00巧]在本文中，連接基團(tuán)是偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)的殘基（即，殘余部分）。（偶聯(lián) 反應(yīng)前的）偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)和（偶聯(lián)反應(yīng)后的）連接基團(tuán)均是在PEG修飾蛋白質(zhì)的領(lǐng)域所 熟知的。通常，連接基團(tuán)和/或偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)較小，分子量小于300Da，優(yōu)選小于200Da。 例如，在本發(fā)明的【具體實施方式】中，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)是玻巧醜亞胺基丙醋基團(tuán)，相應(yīng)地，連 接基團(tuán)是玻巧醜亞胺基丙醋基團(tuán)與氨基偶聯(lián)后的殘基。
[0026] 由于本發(fā)明的偶聯(lián)物是用帶有端輕基的PEG獲得的，因此為了防止該輕基干擾偶 聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)不含輕基。偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)應(yīng)當(dāng)能同膜島素或類似物上的活性基 團(tuán)（如，氨基、駿基、琉基等）偶連，優(yōu)選本發(fā)明的偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)包含縮酵基、酵基、玻巧 醜亞胺基、馬來醜亞胺基、己帰諷基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇 基、帰丙基、己帰基、己快基或畳氮基。
[0027] 由于經(jīng)過偶聯(lián)反應(yīng)，本發(fā)明的連接基團(tuán)不包含縮酵基、酵基、玻巧醜亞胺基、馬來 醜亞胺基、己帰諷基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇基、帰丙基、己 帰基、己快基或疊氮基。
[0028] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，偶聯(lián)是定點偶聯(lián)，該 樣可W提高偶聯(lián)物的均一性（或純度）。例如，Y的偶聯(lián)位點是e氨基和/或a氨基，優(yōu) 選是B鏈的e氨基和/或a氨基。其中，e氨基是指賴氨酸側(cè)鏈上的氨基，a氨基是指 膜島素鏈N端的氨基酸的游離氨基。通過本發(fā)明第二方面的方法可W實現(xiàn)定點偶聯(lián)。
[0029] 在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制 備方法，其包括用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/與Y偶聯(lián)的過程，其中，
[0030] Y為膜島素或其類似物；
[0031] L'為偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)；
[0032] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[0033] P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0034] -為共價鍵。
[00對本發(fā)明第二方面的制備方法可W獲得t個郵-畑2細(xì)20)。]。-1/與1個Y偶聯(lián)的產(chǎn) 物，其中t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1。
[0036] 如無相反或矛盾的指示，本發(fā)明一部分提及的術(shù)語可W參照本發(fā)明其他部分的術(shù) 語定義或解釋。例如，Y，即膜島素或其類似物，可W參照本發(fā)明第一方面的Y及其優(yōu)選的技 術(shù)特征。又如，L'，即偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)，是在PEG修飾蛋白質(zhì)的領(lǐng)域所熟知的，可W參考大量 涉及聚己二醇化的蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物的文獻(xiàn)，例如，【背景技術(shù)】部分列舉的大量涉及聚己二醇 化的膜島素及其類似物的偶聯(lián)物的文獻(xiàn)。
[0037] 優(yōu)選本發(fā)明第二方面的制備方法包括
[00測 （1)在適合與￡氨基和/或a氨基偶聯(lián)的條件下，用郵-畑2邸20)。]。-1/(優(yōu)選 是冊-畑2邸2〇)片'）與Y偶聯(lián)；
[0039] (2)純化（優(yōu)選通過層析純化，如通過凝膠過濾層析和/或離子交換層析純化）獲 得如式I所示的膜島素或其類似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0040] 優(yōu)選其中，在適合與a氨基偶聯(lián)的條件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊-畑2邸2〇)n-L')與Y偶聯(lián)是在抑5. 0?8. 0的溶液中郵-畑2邸2〇) Jp-L'(優(yōu)選是 冊-(邸2邸2〇)。-1/ )與Y W 1?4 : 1?4的摩爾比在4?37°C下混合反應(yīng)。
[0041] 也優(yōu)選其中，在適合與e氨基偶聯(lián)的條件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊-畑2邸2〇)片'）與Y偶聯(lián)是在抑8. 0?11. 5的溶液中郵-畑2邸2〇) Jp-L'（優(yōu)選是 冊-(邸2邸2〇)。-1/ )與Y W 1?4 : 1?4的摩爾比在4?37°C下混合反應(yīng)。
[0042] 反應(yīng)可W通過加入酸酸化（優(yōu)選酸化至抑2. 5?3. 5)終止反應(yīng)，然后可W直接進(jìn) 行純化。在本發(fā)明的【具體實施方式】中，純化是依次通過陽離子層析和陰離子交換層析進(jìn)行 純化。
[0043] 在第H方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥 學(xué)上可接受的鹽，W及藥學(xué)上可接受的載體。
[0044] 在本文中，"藥學(xué)上可接受的載體"指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、佐 齊U、包裹材料或其他制劑輔料。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可W根據(jù)治療目的、給藥途徑的需 要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膜劑、丸劑、膠囊 (包括持續(xù)釋放或延遲釋釋設(shè)形式）、粉劑、顆粒劑、町劑、糖漿劑和乳液劑、注射劑或息浮 液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、針劑或粉針劑、自動注射裝置或栓劑。在本發(fā)明的具體實施方 式中，W注射劑形式注射給藥，所W本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽可W 與注射用的無毒的藥物學(xué)上可接受的惰性載體組合在一起，如等滲葡萄糖溶液、甘油、生理 鹽水或其組合。該藥物組合物中還可W添加蛋白質(zhì)保護(hù)劑等輔料，如人血清白蛋白化SA)、 低分子量膚、氨基酸和/或金屬陽離子等。
[0045] 本發(fā)明第H方面的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的 疾病，優(yōu)選用于長期治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的疾病，如，糖尿病，特別是1 型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0046] 在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制 備低免疫原性的藥物中的應(yīng)用。
[0047] 本發(fā)明的藥物或藥物組合物可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥方式來進(jìn)行 給藥，例如胃腸道外、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選胃腸道 外給藥，如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時間W及治療對 象的情況而有所變化，實際治療所需的量可W由醫(yī)師根據(jù)實際情況（如，病人的病情、體重 等）而方便地確定。由于本發(fā)明的偶聯(lián)物的優(yōu)異的藥代學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，因此相對于膜島 素或其類似物，其給藥量大幅降低，給藥頻次也大幅降低。
[0048] 在本發(fā)明第四方面的應(yīng)用中，所述藥物用于治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或 預(yù)防的疾病，優(yōu)選用于長期治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的疾病，如，糖尿病，特 別是1型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0049] 在第五方面，本發(fā)明提供了端輕基聚己二醇或出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊-(C&C&O)。-!/)在制備低免疫原性的膜島素或其類似物的偶聯(lián)物中的應(yīng)用。其中，L'為 偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)；n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910 的整數(shù)；P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 為 共價鍵。優(yōu)選其中，膜島素或其類似物的偶聯(lián)物是本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可 接受的鹽。
[0050] 本發(fā)明的偶聯(lián)物免疫原性低，該體現(xiàn)在兩個方面，首先是該偶聯(lián)物顯著降低了聚 己二醇本身帶來的免疫原性，甚至降低至長期（40天左右）使用無法檢測出的水平；其次是 該偶聯(lián)物也進(jìn)一步降低到了膜島素或其類似物本身的免疫原性。該樣的低免疫原性對于藥 用安全性（尤其是長期藥用的安全性）是特別有益的。
[0051] 在本文中，為了清楚起見，低免疫原性可W被定義為相對于本發(fā)明第一方面的偶 聯(lián)物中端輕基被替換為甲氧基后形成的偶聯(lián)物的免疫原性降低，即，低免疫原性是相對于 式II所示的膜島素或其類似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的免疫原性降低：
[0052] {[邸30-(邸2邸20) Jp-U t-Y (式 II)
[005引 其中，
[0054] Y為膜島素或其類似物；
[005引 L為連接基團(tuán)；
[0056] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[0057] P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0058] t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; [00則-為共價鍵。
[0060] 本發(fā)明取得的有益甚至是預(yù)料不到的效果在于，采用端輕基聚己二醇修飾人膜島 素或其類似物而獲得端輕基聚己二醇化人膜島素或其類似物的偶聯(lián)物，在保持了藥代學(xué)和 藥效學(xué)的優(yōu)異性質(zhì)的基礎(chǔ)上，該偶聯(lián)物顯著降低了聚己二醇本身帶來的免疫原性，甚至降 低至長期（40天左右）使用無法檢測出的水平，也進(jìn)一步降低到了膜島素或其類似物本身 的免疫原性，提高了藥物長期使用的安全性。
[0061] 為了便于理解，W下將通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指 出的是，該些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論 述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用 了公開文獻(xiàn)，該些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考， 就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。

【具體實施方式】
[0062] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。如未特別指明之處，可參考 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《有機(jī)合成》、《分子克隆實驗指南》、《細(xì)胞實驗指南》、《免疫檢測 技術(shù)》等書籍和SFDA的動物實驗規(guī)范和指引W及所用的試劑和設(shè)備的使用說明。其中，女口 未特別指明，所用的試劑和設(shè)備均可通過商業(yè)渠道購買。
[006引實施例1定點偶聯(lián)在e氨基上的冊-PEG化的膜島素及其類似物的偶聯(lián)物的制備
[0064] 本實施例主要示例性地描述了用分子量為20KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊-PEG-SPA-20K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類似物值esB30)的B鏈 賴氨酸的e氨基的制備過程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊-PEG-20K-DesB30)，其中冊-PEG定 點偶聯(lián)在B鏈賴氨酸的e氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的測酸緩沖液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入6g冊-PEG-SPA-20K，在300巧m的條件下室溫（25°C )反應(yīng)60min。 然后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3. 0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩 沖液巧OmM己酸軸緩沖液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個 柱體積的該平衡緩沖液流過該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫 下來的經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單陽G修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為 60% (V/V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過至流過液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用 洗脫液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線 性洗脫，收集洗脫下來的最大的峰，即為冊-PEG-20K-DesB30。經(jīng)RP-HPLC檢測，其純度大于 95%;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點在B鏈賴氨酸的e氨基上。
[0065] 基本參照W上制備過程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分別獲得冊-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其 類似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物冊-PEG-20K-Ins、冊-PEG-20K-AP、冊-PEG-20K-LP和 冊-PEG-20K-GL。
[0066] 另外，用mPEG替代上述的冊-PEG進(jìn)行修飾，分別獲得mPEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素 或其類似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物mPEG-20K-DesB30、mPEG-20K-Ins、mPEG-20K-AP、 mPEG-20K-LP 和 mPEG-20K-GL。
[0067] 實施例2定點偶聯(lián)在a氨基上的冊-PEG化的膜島素及其類似物的偶聯(lián)物的制備
[0068] 本實施例主要示例性地描述了用分子量為20KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊-PEG-SPA-20K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類似物值esB30)的B鏈 N末端a氨基的制備過程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊-PEG-20K-DesB30-Bl)，其中冊-PEG定 點偶聯(lián)在B鏈N末端a氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的磯酸緩沖液（pH7. 5) 配制成500ml溶液，加入6g冊-PEG-SPA-20K，在300巧m的條件下室溫（25°C )60min。然 后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3. 0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩沖 液巧OmM己酸軸緩沖液，P冊.5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個柱體 積的該平衡緩沖液流過該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫下來的 經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單PEG修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為60% (V/ V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，P服.0)平衡好的SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過至流過液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用洗脫液 (60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M NaCl，抑8. 0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線性洗 脫，收集洗脫下來的最大的峰，即為冊-PEG-20K-DesB30-Bl。經(jīng)RP-HPLC檢測，其純度大于 95% ;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點在B鏈N末端a氨基上。
[0069] 基本參照W上制備過程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類似物；Ins、Aspart、Lispro和Glul iSine，分別獲得冊-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其類似 物的B鏈賴氨酸 e 氨基的產(chǎn)物冊-PEG-20K-Ins-Bl、冊-PEG-20K-AP-B1、冊-PEG-20K-LP-B1 和冊-PEG-20K-化-B1。
[0070] 實施例340邸的冊-PEG化的膜島素及其類似物的偶聯(lián)物的制備
[0071] 本實施例主要示例性地描述了用分子量為40KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊-PEG-SPA-40K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類似物值esB30)的B鏈 賴氨酸的e氨基的制備過程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊-PEG-40K-DesB30)，其中冊-PEG定 點偶聯(lián)在B鏈賴氨酸的e氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的測酸緩沖液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入12g冊-PEG-SPA-40K，在300巧m的條件下室溫（25°C)反應(yīng)60min。 然后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3.0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩 沖液巧OmM己酸軸緩沖液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個 柱體積的該平衡緩沖液流過該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫 下來的經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單陽G修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為 60% (V/V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過至流過液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用 洗脫液化0% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線 性洗脫，收集洗脫下來的最大的峰，即為冊-PEG-40K-DesB30。經(jīng)RP-HPLC檢測，其純度大于 95%;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點在B鏈賴氨酸的e氨基上。
[0072] 基本參照W上制備過程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分別獲得冊-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其 類似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物冊-PEG-40K-Ins、冊-PEG-40K-AP、冊-PEG-40K-LP和 冊-PEG-40K-GL。
[0073] 實施例4膜島素及其類似物在冊-PEG修飾前后的藥代動力學(xué)研究
[0074] 72只健康比格炬eagle)犬，隨機(jī)分成12組，每組6只，雌雄各半，共12組。每 組比格犬頸部或背皮下按0. 5IU/kg的劑量分別單次給藥上述實施例制備或作為原料的 Aspart、H0-PEG-20K-AP、冊-PEG-40K-AP ;Lispro、冊-PEG-20K-LP、H0-PEG-40K-LP ;Ins、 冊-PEG-20K-Ins、冊-PEG-40K-Ins ;DesB30、冊-PEG-20K-DesB30 和冊-PEG-40K-DesB30。給 藥前及給藥后不同時段，分別對Beagle犬肘靜脈采血，離也，取血清檢測血液濃度。采用放 免法巧IA)測定不同時間的血液中膜島素或其類似物的濃度，試驗數(shù)據(jù)采用DAS 3. 2. 4藥 動程序擬合分析并計算藥代參數(shù)，結(jié)果如表1所示。
[00巧]表1膜島素及其類似物在冊-PEG修飾前后的藥代動力學(xué)參數(shù)
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 如式I所示的胰島素或其類似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽， {[H0-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 I) 其中， Y為胰島素或其類似物； L為連接基團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價鍵。
2. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，胰島素是人胰島素；和 /或，胰島素類似物是DesB30、甘精胰島素（Lantus)、門冬胰島素（Aspart)、地特胰島素 (Levemir)、谷賴胰島素（Glulisine)、德谷胰島素（Degludec)或賴脯胰島素（Lispro)。
3. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，連接基團(tuán)是偶聯(lián)反應(yīng)官能 團(tuán)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)的殘基，其分子量小于300Da，優(yōu)選小于200Da。
4. 權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)包含縮醛 基、醛基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、酯基、碳酸酯基、羧基、氨 基、氣氧基、硫醇基、稀丙基、乙稀基、乙塊基或置氣基。
5. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，Y的偶聯(lián)位點是e氨基和 /或a氨基，優(yōu)選是B鏈的e氨基和/或a氨基。
6. 權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其包括用 [H0-(CH2CH20)n]p-L'與Y偶聯(lián)的過程，其中， Y為胰島素或其類似物； L'為偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價鍵。
7. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以 及藥學(xué)上可接受的載體。
8. 權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備低免疫原性的藥 物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療和/或預(yù)防（尤其是長期治療和/或預(yù)防）胰島素能治療 和/或預(yù)防的疾?。ㄈ纾悄虿?，特別是1型糖尿病和/或2型糖尿病）。
9. [H0-(CH2CH20)n] p-L'在制備低免疫原性的胰島素或其類似物的偶聯(lián)物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中低免疫原性是相對于式II所示的胰島素或其類 似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的免疫原性降低： {[CH30-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 11) 其中， Y為胰島素或其類似物； L為連接基團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價鍵。
【文檔編號】C07K1/10GK104447981SQ201410817586
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】陳勇, 羅華, 李紅亮, 李祥, 蔣利敏 申請人:重慶浦諾維生物科技有限公司