專利名稱：人胰島素類似物的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于人藥的領(lǐng)域，特別是涉及一類治療I型和II型糖尿病的藥物。 更具體地說，是涉及一類人胰島素類似物的制備方法和用途。
技術(shù)背景全球大約有1億2千萬人患有糖尿病，其中約1千2百萬人是I型糖尿病，對這 些人來說，利用外源性胰島素替代所缺少的內(nèi)分泌胰島素是目前唯一可行的療 法。高血糖是引發(fā)各種糖尿病并發(fā)癥的原因，所以必須嚴(yán)格控制每日24小時的 血糖濃度在正常范圍以防止或延緩糖尿病后期并發(fā)癥。正常人體內(nèi)胰島素的生理性分泌是受血糖濃度調(diào)控的， 一般在進(jìn)餐后30-60 分鐘后血胰島素濃度達(dá)到峰值，4-5小時后恢復(fù)到基礎(chǔ)值，這樣才能保證血糖濃 度不因進(jìn)餐而有大的波動。臨床上，皮下注射天然人胰島素后，胰島素在皮下注射位置擴散并進(jìn)入體 循環(huán)中發(fā)揮作用。胰島素在生理pH溶液中有多種聚集狀態(tài)，包括單體、二聚體 和六聚體等。單體胰島素(insulin monomers)在皮下組織中能夠迅速擴散并進(jìn)入體循環(huán)中發(fā)揮降血糖作用，而二聚體胰島素(insulindimmers)的皮下擴散速 度相對較慢，六聚體以上的胰島素(insulinhexamer)的皮下吸收受到很大限制。 臨床上皮下或者肌肉注射使用的天然人胰島素通常溶解于生理pH溶液中，濃度 通常也高于lOOnM，在此條件下的胰島素以形成二聚體為主，在有鋅離子等二 價離子的存在下形成六聚體。因此，皮下或者肌肉注射天然人胰島素后，起效 時間較慢(30-90分鐘)，達(dá)峰后持續(xù)兩個小時左右(2-4小時)，總起效時間較 長(6-8小時)。由于餐前即時皮下或者肌肉注射天然人胰島素后的作用性質(zhì)的 限制，使其不能有效地模擬餐后胰島素的生理性分泌，故不能有效地進(jìn)行胰島
素治療(Dewitt DE, et al., JAMA 2003， 289: 2254; Binder C., et al., New York: Raven Press, 1983， 6:53.)。餐前即時皮下或者肌肉注射天然人胰島素后不能有效地模擬餐后胰島素的 生理性分泌，而餐前半小時注射天然人胰島素給患者生活上帶來極大的不便， 臨床上需要藥物動力學(xué)更符合生理餐時胰島素分泌曲線的胰島素制劑——速效 胰島素類似物。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一類速效胰島素類似物。 本發(fā)明的另一目的是提供該類速效胰島素的制備方法。 本發(fā)明的再一個目的是提供該類速效胰島素在制備用于治療糖尿病的藥物 中的用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明的第一方面，提供了一類新型的胰島素類似物，具有如下的形式 s- sA鏈 I 7 I 2。<formula>formula see original document page 6</formula>B鏈 I IHzN-Rrl^-RrPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-1 7 19續(xù)(B鏈)-Gly-Phe隱Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-COOH 23 30<formula>formula see original document page 6</formula>I射R為Pro, Ala， Gly, Ser， Val, Leu中的任意一個氨基酸殘基； R2為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R:;為n段-R2-Rl-二肽片斷，n取O、 1、 2、 3、 4之中的任意一個數(shù)字。過在天然人胰島素B鏈的N端添加一至五個二肽片 斷所形成，設(shè)此二肽片段構(gòu)成順序為R3_ R2_ Rp該二肽片斷的C端氨基酸殘基 即&可以是Pro, Ala， Gly, Ser， Val, Leu中的任意一個氨基酸殘基，該二肽片斷的 N端氨基酸殘基即R2可以是任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基。本發(fā)明的第二方面，提供了一種優(yōu)選的胰島素類似物，它的^和R3中的R, 為Pro， R2為lys， Hi中的R2為Arg， n為l。即在天然人胰島素B鏈N端加上了 Arg-Pro-Lys-Pro-四肽所形成的胰島素類似物，命名為PIns，其胰島素原命名為 PPIns，前體胰島素原命名為FPPIns。此優(yōu)選例所提供的胰島素類似物為一種速 效胰島素。本發(fā)明的第三方面，提供了該類新型人胰島素類似物的制備方法，步驟包括(1)構(gòu)建一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體包含一段編碼具有氨基酸序列II 的人胰島素類似物的DNA序列Met-X^-Y-RrRrRt-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-X'a-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser國Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr陽Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnII射X、為含有b個氨基酸殘基的肽鏈，b為非負(fù)整數(shù)；X、為含有a個氨基酸殘 基的肽鏈，a為非負(fù)整數(shù)；Y為Arg或Lys;其它變量與權(quán)利要求1所述相同，(2) 人胰島素類似物前體的表達(dá)，其中宿主細(xì)胞采用優(yōu)選的宿主菌，檢測 方法用SDS-PAGE電泳法。(3) 分離得到人胰島素類似物前體，命名為FPPIns。(4) 用酶學(xué)方法從人胰島素類似物前體釋放人胰島素類似物命名為PPIns。(5) 得到人胰島素類似物命名為PIns，其中步驟為純化-除鹽-凍干-分離。 步驟(1)中所提到的宿主細(xì)胞優(yōu)選細(xì)菌，特別優(yōu)選大腸桿菌(￡ W)。 步驟(2)中所述的前體若是在大腸桿菌中表達(dá)時，表達(dá)的融合蛋白通常形成不溶性的包涵體，可以在細(xì)胞破碎后離心分離，用變性劑(例如8M尿素或6M鹽 酸胍)重新溶解，然后用亞硫酸鹽處理融合蛋白，將巰基(SH)轉(zhuǎn)變?yōu)镾—磺酸鹽 (例如，實用蛋白質(zhì)化學(xué)手冊，A. Darbre編寫，1986， 49一53頁)，改善該融合 蛋白的溶解性，易于純化(利用陰離子交換或凝膠層析方法)。步驟(3)在稀釋的水溶液中，加入巰基試劑(如P-巰基乙醇、CySH或谷 胱甘肽)，隨后進(jìn)行空氣氧化作用，使純化后的前體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑烊豢臻g結(jié)構(gòu) 式和形成正確的二硫鍵(折疊)的前胰島素原(preproinsulin)。步驟(4)酶學(xué)方法即通過特異性的蛋白裂解作用，將前體轉(zhuǎn)變成具有生物 活性的人胰島素類似物。用胰蛋白酶將式II的Met-X、-Y-去除，在X、-Arg所示的 肽鏈處形成斷裂，使B鏈和A鏈分開，同時用羧肽酶B除去羧基端的堿性氨基酸。步驟(5)把裂解過程中形成的人胰島素類似物用層析的方法(例如離子交 換等)進(jìn)行純化，最后通過除鹽、凍干得以分離。本發(fā)明的第四方面，提供了一種對病人具有有效量的胰島素類似物給藥， 以控制病人的血糖濃度。其中"有效量"是指本發(fā)明的一種或者多種胰島素類 似物用于治療、預(yù)防糖尿病或是保持正常血糖水平所必要的劑量。該胰島素類 似物的實際給藥量應(yīng)由醫(yī)生按照病人具體的情況而確定，上述劑量范圍不認(rèn)為 是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在此類速效胰島素類似物不易形成二聚體，皮下注射后主要以單體形式存在，其主要特點為可溶性，自我結(jié)合力較低，皮下注
射后局部吸收更快，起效時間更短(10 20分鐘)，達(dá)峰時間30-90分鐘，作用持 續(xù)時間3 5小時。這一藥物動力學(xué)特征更符合生理胰島素和血糖變化譜。


圖1 質(zhì)粒pET28a-ProIns結(jié)構(gòu)圖。 圖2 質(zhì)粒pET28a-FPTH結(jié)構(gòu)圖。 圖3 重組質(zhì)粒pET28a-FPPIns結(jié)構(gòu)圖。 圖4重組質(zhì)粒pET28a-FPPIns部分基因測序結(jié)果。 圖5 SDS-PAGE電泳顯示FPPIns的表達(dá)和純化。 圖6 SDS-PAGE電泳顯示FPPIns前體胰島素原蛋白轉(zhuǎn)化為PIns。 圖7 Pins的Autoflex ToF/ToF (Bruker Daitonics )質(zhì)譜圖。 圖8新西蘭大白兔肌肉注射PIns降血糖活性時效關(guān)系圖。 圖9 a Du Pont Zorbax GF-250分子篩層析圖。
具體實施方式
以下通過附圖及實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明一種具有以下特征的人胰島素類似物(I式)s- sA鏈 I 7 I 2。H2N-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-COOH 1 6I 11 IS- S S — SB鏈 I IHjN-IVRrRrPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-1 7 19續(xù)(B鏈)-Gly-Phe-Phe-Tyr隱Thr-Pro-Lys隱Thr-COOH 23 30其中
為Pro, Ala, Gly, Ser, Val, Leu中的任意一個氨基酸殘基； R2為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R3為n段-R2-Rl-二肽片斷，n取O、 1、 2、 3、 4之中的任意一個數(shù)字，R^nR3 中的R為Pro， R2為lys， R3中的R2為Arg， n為l。該人胰島素類似物的制備方法由以下步驟完成(1)構(gòu)建一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體包含一段編碼具有氨基酸序列II 的人胰島素類似物的DNA序列Met-xVY-RrRrRrPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-X^-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnII其中X 為含有b個氨基酸殘基的肽鏈，b為非負(fù)整數(shù)；X、為含有a個氨 基酸殘基的肽鏈，a為非負(fù)整數(shù)；Y為Arg或Lys; 為Pro, Ala, Gly， Ser， Val, Leu 中的任意一個氨基酸殘基；R2為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R3 為n段-R2-Rl-二肽片斷，n取O、 1、 2、 3、 4之中的任意一個數(shù)字，所用的引 物P1和P2的核苷酸序列為PI: 5， ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3，P2: 5， TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3， 載體質(zhì)粒選用PET28a質(zhì)粒；(2) 人胰島素類似物前體的表達(dá)，其中人胰島素類似物的前體從氨基端到 羧基端分別含有融合肽段、胰島素B鏈、連接肽和胰島素A鏈；(3) 分離得到人胰島素類似物前體，其中優(yōu)選大腸桿菌作為宿主菌；(4) 用酶學(xué)方法從人胰島素類似物前體釋放人胰島素類似物，主要是利用 胰蛋白酶和羧肽酶B釋放人胰島素類似物；(5)得到人胰島素類似物，其中步驟為純化-除鹽-凍干-分離，純化步驟
采用的層析方法為陰離子交換層析法，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測達(dá)到電泳純。 材料(1) 菌株和質(zhì)粒宿主菌五sc/iehc/n'a co/《DE3)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究 有關(guān)的實驗室一般都有保存。質(zhì)粒pET28a-ProIns和質(zhì)粒pET28a-FPTH均由本實驗室構(gòu)建并保存。(2) 酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn) 品，PCR回收試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。 標(biāo)準(zhǔn)品天然人胰島素、胰蛋白酶和羧肽酶B購至上海生物工程有限公司。(3) 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J， Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。(4) Cellouse-DEAE: DEAE-52為Whatman公司產(chǎn)品。 方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，這些在基因工程研究領(lǐng)域都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J， Fristsh EF， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ， pp. 16-340 。重組蛋白表達(dá)量的測定參見Sambrook J, Fristsh EF， Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，方法進(jìn)行。
實施例1 FPPIns重組基因工程菌的構(gòu)建1. PPIns基因的獲得借助于計算機軟件設(shè)計兩條弓I物P1和P2，兩條弓I物核苷酸序列如下 P1: 5 ， ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3' P2: 5 ， TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3 ，引物Pl中引入了BamHI酶切位點，引物P2中引入了HimdIII酶切位點。引物 由上海英俊公司合成。以pET28a-Prolns質(zhì)粒為模板見附圖l，以P1和P2為上下游引物進(jìn)行PCR擴增 獲得PPIns基因片段。PCR反應(yīng)體系100pmolPl， 100pmolP2， 2yldNTP (10nM)， 5單位的Pfu DNA聚合酶，0.5 y l的pET28a-ProIns質(zhì)粒，5 u 1 10x Pfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液， 總體系為50ul。PCR反應(yīng)條件94°C 10min; 94°C 45s， 58°C 45s, 72°C lmin，循環(huán)數(shù)30; 72 。C lOmin。2. pET28a-FPPIns質(zhì)粒的構(gòu)建及相應(yīng)重組基因工程菌的構(gòu)建 將擴增純化后的PPIns基因片段用BamHI和HimdIII進(jìn)行雙酶切，酶切后產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。采用堿裂解法對pET28a-FPTH質(zhì)粒進(jìn)行抽提，抽提得到的質(zhì)粒也用BamHI 和HimdIII進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖膠回收試劑盒回收大片段 DNAo將上述酶切回收后得到的PPIns基因片段和pET28a-FPTH質(zhì)粒大片段用T4連 接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌^^/7^&/^"http://81^21(0￡3)，篩選后得到 含有FPPIns前體胰島素原蛋白基因的重組質(zhì)粒的基因工程菌，稱為 pET28a-FPPIns重組基因工程菌，其結(jié)構(gòu)示意圖見附圖2。從該工程菌中提取重組 質(zhì)粒，委托上海英俊公司進(jìn)行核酸序列分析，進(jìn)一步驗證FPPIns前體胰島素原蛋 白基因及其讀碼框的正確性，其結(jié)果見附圖3。 實施例2 FPPIns基因在大腸桿菌中的表達(dá)從pET28a-FPPIns重組基因工程菌的培養(yǎng)平板上挑取單菌落，接種于含有50 "g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37"C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，按1%比例轉(zhuǎn)接 種入LB液體培養(yǎng)基(50Pg/ml卡那霉素)中，37r培養(yǎng)4小時后，加入終濃度為 0.5mmol/L的a-乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達(dá)融合蛋 白FPPIns。誘導(dǎo)后6小時離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng) 實現(xiàn)了FPPIns前體胰島素原蛋白基因的表達(dá)，表達(dá)的蛋白占細(xì)菌總蛋白的40%左 右，結(jié)果見附圖4。實施例3 FPPIns前體胰島素原蛋白的分離純化誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 0.5% Triton X-100， 0.02%溶菌酶)中，37。C攪拌過夜。離心回 收沉淀，沉淀經(jīng)包涵體洗滌液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 0.2%TritonX-100)、低 濃度尿素溶液(pH8.0， 50mMTris-Cl， 3M尿素)洗滌，洗滌后離心回收沉淀。 沉淀裂解于高濃度尿素中(pH8.0， 50mMTris-Cl， 7M尿素)，離心回收上清。上 清經(jīng)亞硫酸鹽解(亞硫酸鈉、連四硫酸鈉)，陰離子交換(DEAE-52)層析純化。 層析用緩沖液包含pH8.0， 50mMTris-Cl， 7M尿素，梯度洗脫用0-0.3MNaCl梯 度進(jìn)行，目的蛋白層析峰經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測已達(dá)到電泳純，結(jié)果見附圖5， 圖中l(wèi).標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(kDa); 2.載荷pET28a-FPPIns質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì) 胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)前)；3.載荷pET28a-FPPIns質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋 白(乳糖誘導(dǎo)后)；4.包涵體(FPPIns)洗滌前；5.包涵體(FPPIns)洗滌后；6.陰離子交換層析(DEAE-52)純化后的FPPIns 。 實施例4 FPPIns前體胰島素原蛋白轉(zhuǎn)化為PIiis為形成正確的二硫鍵，將純化后的FPPIns前體胰島素原蛋白(-S-磺酸鹽) 溶解于含有50mM甘氨酸的緩沖液pH10.6中，濃度為0.3g/l。在P-巰基乙醇(5-50mol/mo1前體胰島素原)作用下，4"C攪拌過夜，然后用磷酸調(diào)節(jié)pH至 3.5，離心去除沉淀。上清液用50mMTris調(diào)節(jié)pH至9.0，按質(zhì)量比1: 400~1: 600 (E/S，即酶/前體胰島素原)分別加入胰蛋白酶和羧肽酶B， 37。C反應(yīng)5h， 產(chǎn)物經(jīng)陰離子交換層析(DEAE-52)純化。層析用緩沖液包含pH9.0， 50mM Tris-Cl，梯度洗脫用0-0.3MNaCl梯度進(jìn)行，目的蛋白層析峰(PIns)經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測己達(dá)到電泳純，結(jié)果見附圖6，圖中1.酶解前的FPPIns; 2.酶解0.5 小時后的產(chǎn)物；3.酶解5小時后的產(chǎn)物；4.陰離子交換層析(DEAE-52)純化 后的PIns (氧化態(tài))；5.標(biāo)準(zhǔn)品天然人胰島素(氧化態(tài))；6.陰離子交換層析(DEAE-52)純化后的PIns (還原態(tài))；7.標(biāo)準(zhǔn)品天然人胰島素(還原態(tài))。目 的峰經(jīng)脫鹽、凍干后保存。凍干品經(jīng)AutoflexToF/ToF (Bruker Daitonics)質(zhì)譜 測定分子量為6286.5Da，與理論分子量相比誤差為0.1%，見附圖7。 實施例5新西蘭大白兔肌肉注射PIiis降血糖活性研究精密稱取PIns和天然人胰島素，用生理鹽水配置成濃度為1.5mg/ml (約 40U/mg)的注射液。取體重2-2.5kg的健康新西蘭大白兔雌兔6只，分置籠中并 隨機分為兩組，每組三只， 一組為PIns組，另一組為天然人胰島素組。實驗前 18 20小時移去詞料，但仍給予飲水。每只新西蘭大白兔以肌肉注射的方式給 藥(大腿內(nèi)側(cè)肌肉)，劑量為0.3U/kg。在實驗過程中，應(yīng)停止飲水，注意避免 驚擾，分別自各兔耳靜脈于0h， 0.16h， 0.33h， 0.5h， 0.75h， lh， 1.25h， 2h， 3h， 4h， 5h， 6h， 7h耳緣靜脈取血，供測定血糖值用。血糖值以各自的起始值 作百分比標(biāo)準(zhǔn)化換算，并取平均值。降血糖活性時效關(guān)系見附圖8，可以得出結(jié)論Pins具有速效胰島素藥代動力學(xué)的特點。 實施例6 PIns自聚合性質(zhì)的測定在中性溶液中較高濃度胰島素聚合后形成單體、二聚體、六聚體的混合物， 使用分子篩層析aDuPontZorbaxGF-250柱，流動相為200mMNaCl， 20mM Na2HP04，流速為lml/min，上樣量為5lU (PIns和天然人胰島素濃度都配置成 3mg/ml)，室溫，220nm檢測。層析圖見附圖9，圖中的色譜峰從左至右為 IgG-Hsp65 (Mw:150kDa)， Rt=9.111s;天然人胰島素，Rt二11.482s; PIns， Rt=11.654s;還原型谷胱甘肽(Mw:307) Rt=11.978s，可以得出結(jié)論PIns的自 身締合性弱于天然人胰島素。除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效 變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種人胰島素類似物，其特征在于具有這樣的形式(I式)其中R1為Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一個氨基酸殘基；R2為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R3為n段-R2-R1-二肽片斷，n取0、1、2、3、4之中的任意一個數(shù)字。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胰島素類似物，其特征在于R和 R3中的R4為Pro， R2為lys， R3中的R2為Arg， n為l。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的人胰島素類似物的制備方法， 其步驟包括(1)構(gòu)建一種可復(fù)制的表達(dá)載體，該載體包含一段編碼具有氨 基酸序列II的人胰島素類似物的DNA序列Met-X^-Y-R^RrRj-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-XVArg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnII腫X、為含有b個氨基酸殘基的肽鏈，b為非負(fù)整數(shù)；X、為含有a 個氨基酸殘基的肽鏈，a為非負(fù)整數(shù)；Y為Arg或Lys; R,為Pro, Ala, Gly， Ser, Val， Leu中的任意一個氨基 酸殘基；R2為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R3為n段-R2-Rl-二 肽片斷，n取0、 1、 2、 3、 4之中的任意一個數(shù)字；(2) 人胰島素類似物前體的表達(dá)，其中宿主細(xì)胞采用優(yōu)選的宿 主菌，檢測方法用SDS-PAGE電泳法；(3) 分離得到人胰島素類似物前體；(4) 用酶學(xué)方法從人胰島素類似物前體釋放人胰島素類似物；(5) 得到人胰島素類似物，其中步驟為純化-除鹽-凍干-分離。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胰島素類似物的制備方法，其特征 在于步驟(1)中引物P1和P2的核苷酸序列為Pl: 5， ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3， P2: 5， TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3， 載體質(zhì)粒選用PET28a質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胰島素類似物的制備方法，其特征在 于步驟(2)中人胰島素類似物的前體從氨基端到羧基端分別含有融 合肽段、胰島素B鏈、連接肽和胰島素A鏈。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胰島素類似物的制備方法，其特征在 于優(yōu)選的宿主菌是大腸桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胰島素類似物的制備方法，其特征在于步驟(4)中酶學(xué)方法是利用胰蛋白酶和羧肽酶B釋放人胰島素類 似物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的人胰島素類似物的制備方法，其特征在 于步驟(5)中純化步驟采用的層析方法為陰離子交換層析法，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測達(dá)到電泳純。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的人胰島素類似物在用于治療糖尿 病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于人藥的領(lǐng)域，涉及一類治療I型和II型糖尿病的藥物，提供了一類人胰島素類似物的制備方法和用途。本發(fā)明所涉及的人胰島素類似物的特征具有如右式形式，其中R₁為Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一個氨基酸殘基；R₂為任意所需要的遺傳上可編碼的氨基酸殘基；R₃為n段-R2-R1-二肽片斷，n取0、1、2、3、4之中的任意一個數(shù)字。本發(fā)明的人胰島素類似物，用生物工程的方法制備得到，此類速效胰島素類似物，優(yōu)點為不易形成二聚體，皮下注射后主要以單體形式存在，局部吸收更快，起效時間更短，藥物動力學(xué)特征更符合生理胰島素和血糖變化譜。
文檔編號C07K14/435GK101157725SQ20071013386
公開日2008年4月9日 申請日期2007年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月24日
發(fā)明者劉景晶, 劉素麗, 潔 吳, 曹榮月, 李祝芳, 豪 范, 勇 魯 申請人:中國藥科大學(xué)