一種培養(yǎng)基及用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計一種生物培養(yǎng)基，具體來說設(shè)計一種新的發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基，以及用培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘精胰島素是一個基因重組長效人胰島素類似物，屬于第三代高端胰島素產(chǎn)品。胰島素藥物一直具有廣闊的發(fā)展前景。胰島素技術(shù)發(fā)展歷經(jīng)了從早期的動物胰臟中提取動物胰島素，到現(xiàn)在的生物合成人胰島素以及人胰島素類似物。第三代基因重組胰島素類似物，甘精胰島素，是胰島素的最高端產(chǎn)品。目前賽諾菲-安萬特的首個第三代高端胰島素“來的時”在世界上銷售額2010年近50億美元，是全球最暢銷藥物前200名中排位第7的“重磅炮彈”藥物。
[0003]本發(fā)明涉及的第三代高端胰島素是在胰島素的A鏈上21位用甘氨酸取代天冬酰胺，并在B鏈3增加精氨酸。與第一代動物胰島素、第二代重組人胰島素最大的區(qū)別在于:它能模擬人體生理胰島素分泌模式，使血糖安全達(dá)標(biāo)而不會出現(xiàn)低血糖，可大大降低糖尿病引起的并發(fā)癥。
[0004]近年來以甘精胰島素為代表的第三代最先進(jìn)的基因重組人胰島素類似物在國際市場已經(jīng)逐步取代第二代人胰島素占據(jù)了市場的龍頭地位。甘精胰島素起效更快，作用更持久，是唯一可在人體中達(dá)到24小時平穩(wěn)分泌的長效胰島素。產(chǎn)品符合人類生活作息周期，每天只需注射一次。甘精胰島素稱之為窮人的胰島素泵是因為他價格比胰島素泵便宜，而且每天只打一針，比預(yù)混胰島素方便的多。甘精胰島素是未來市場增長的主要推動力。
[0005]重組胰島素表達(dá)系統(tǒng)常用的有兩種，一為大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)，這種技術(shù)較為成熟，開發(fā)較早。具有工藝簡單、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過翻譯后的修飾加工，對包涵體變復(fù)性等。另一種為酵母表達(dá)系統(tǒng)，使用具有翻譯后修飾的釀酒酵母作為表達(dá)系統(tǒng)，省去了包涵體變復(fù)性的繁瑣及高消耗操作步驟。但酵母作為表達(dá)系統(tǒng)不適用于“甘精胰島素”的表達(dá)和制備。
[0006]大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其生長周期短，培養(yǎng)成本低廉，代謝調(diào)控較為成熟，在重組蛋白外源基因表系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位。在大腸桿菌的發(fā)酵中，外源基因高效表達(dá)條件下的高密度發(fā)酵對于減少培養(yǎng)體積，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，簡化產(chǎn)品純化工藝都具有非常重要的意義，但是高密度發(fā)酵過程中容易出現(xiàn)菌體衰老、自溶和外源基因不能高效表達(dá)等現(xiàn)象。因此，優(yōu)化大腸桿菌的生長條件對提高外源蛋白的產(chǎn)量至關(guān)重要。
[0007]不同的培養(yǎng)基成分不同，對重組大腸桿菌的生長和產(chǎn)物的表達(dá)影響也不同，在發(fā)酵過程中添加的鹽類和微量元素的含量尤其是鐵，鋅，錳，銅，鈷等礦物元素，他們或是一些酶的激活劑后者是一些酶的組分，因此可以降低有害代謝產(chǎn)物(主要是乙酸)的積累，改善細(xì)胞生長，增加菌體得率，提高外源蛋白的表達(dá)水平。
[0008]國內(nèi)唯一第二代胰島素表達(dá)水平在300mg-500mg/L。本發(fā)明涉及的專有技術(shù)開發(fā)生產(chǎn)的第三代長效人胰島素表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)7g/L，是目前國內(nèi)表達(dá)工業(yè)水平的10多倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種新的發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基；另一目的是開發(fā)出一種用這種培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的方法。
[0010]我們通過將檸檬酸，硫酸鐵，磷酸氫二銨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，葡萄糖，甘油，酵母提取物，維生素BI，鑰酸銨，硫酸銅，硼酸，碘化鉀，氯化錳和乙酸鋅混合，得到發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基，然后將重組大腸桿菌BL21 (DE3) /hpl菌株接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵得到的甘精胰島素前體含量在7g/l以上，且生產(chǎn)成本低廉，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0011]本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基，其特征是每升培養(yǎng)基中含有檸檬酸3?8g,硫酸鐵0.01?0.1g,磷酸氫二銨2?8g,磷酸二氫鉀2?4g,硫酸鎂I?4g,葡萄糖8?15g，甘油I?3g，酵母提取物10?16g，維生素B10.05?0.2g，痕量元素鑰酸銨0.5?Img,硫酸銅0.1?Img,硼酸I?4mg,碘化鉀0.2?0.6mg,氯化猛I?4mg和乙酸鋅，其余為水，pH為6.8?7.2。
[0012]本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基用通常的方法制備，是將各組分用水溶解后混合，并用水定容至規(guī)定體積(比如制備IL培養(yǎng)基，則各組分按以上比例用水溶解后混合，用水定容至1L)，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8?7.2而得到。
[0013]用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的方法，其特征包括以下的步驟:
[0014](I)將重組大腸桿菌BL21 (DE3)/hpl菌株在固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，35°C?37°C培養(yǎng)18?24小時，得到斜面菌種；
[0015](2)將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基，于35°C?37°C的溫度下?lián)u床培養(yǎng)，得到液體種子；
[0016](3)將液體種子接種到上述本發(fā)明生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基中，于32°C?38°C通氣攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)12?18小時，當(dāng)菌體密度的0D600值達(dá)到50?70時，停止發(fā)酵，得到甘精胰島素前體。
[0017]步驟(I)所述的大腸桿菌BL21(DE3)菌株是常用的大腸桿菌表達(dá)菌株，該菌株可以從市場上夠得，重組大腸桿菌BL21(DE3)/hpl菌株是本公司開發(fā)的甘精胰島素生產(chǎn)菌株；所述的固體斜面培養(yǎng)基pH值6.7?7.2，每升培養(yǎng)基中含有蛋白胨5?10g，酵母粉3?6g，氯化鈉3?6g，瓊脂12?15g，其余為水。
[0018]步驟(2)所述的液體種子培養(yǎng)基pH值6.8?7.2，每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖I?5g,磷酸二氫鉀I?4g,磷酸氫二鉀3?6g,氯化鈉2?8g,酵母粉6?12g,;采用的搖床培養(yǎng)是采用搖床振幅65?75cm，轉(zhuǎn)速180?250r/min，培養(yǎng)時間18?24小時。
[0019]步驟(3)所述的液體種子在發(fā)酵生產(chǎn)甘精胰島素前體的培養(yǎng)基中的接種量最好是體積分?jǐn)?shù)5%?10%，所述的通氣攪拌發(fā)酵罐培養(yǎng)中每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比是1: 0.1?1.0，在發(fā)酵10?18小時后用10%?16%氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH在 6.6 ?7.2。
[0020]本發(fā)明操作簡單，原材料成本低廉，得到的甘精胰島素前體蛋白至少在7g/l，最高可以達(dá)到12g/l以上，因此本發(fā)明為甘精胰島素的大規(guī)模生產(chǎn)開辟了一條新的途徑。
【具體實施方式】
[0021 ] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制
[0022]實施例1:
[0023]將檸檬酸3g，硫酸鐵0.0lg，磷酸氫二銨2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，葡萄糖Sg，甘油lg，酵母提取物1g,維生素B1.05g,痕量元素鑰酸銨0.5mg,硫酸銅0.1mg,硼酸Img,碘化鉀0.2mg,氯化猛Img和乙酸鋅Img,加自來水溶解混合至1L,用5% NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的PH為6.8，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0024]實施例2:
[0025]將檸檬酸5g，硫酸鐵0.05g,磷酸氫二銨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂2g，葡萄糖12g，甘油2g，酵母提取物13g，維生素B1.1g,痕量元素鑰酸銨0.8mg,硫酸銅0.5mg,硼酸2mg,碘化鉀0.4mg,氯化猛3mg和乙酸鋅3mg,加自來水溶解混合至1L,用5 % NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的PH為7.0，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0026]實施例3:
[0027]將檸檬酸Sg，硫酸鐵0.1g,磷酸氫二銨Sg，磷酸二氫鉀4g，硫酸鎂4g，葡萄糖15g，甘油3g,酵母提取物16g,維生素B1.2g,痕量元素鑰酸銨Img,硫酸銅Img,硼酸4mg,碘化鉀0.6mg,氯化猛4mg和乙酸鋅5mg,加自來水溶解混合至1L,用5% NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的pH為7.2，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0028]實施例4:
[0029]將重組大腸桿菌菌株在固體斜面培養(yǎng)基(pH6.7,蛋白胨5g,酵母粉9g,氯化鈉6g,瓊脂15g，加自來水溶解混合至1L)上培養(yǎng)，35°C培養(yǎng)24小時，得到斜面菌種。
[0030]用接種針將斜面上約Icm2的菌種刮下，轉(zhuǎn)接到裝有20ml液體種子培養(yǎng)基(pH值
6.8，葡萄糖5g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二鉀5g，氯化鈉6g，酵母粉12g，加自來水溶解混合至1L)的500ml三角瓶(0.07MPal0min)中，于37°C往復(fù)式搖床(振幅65cm，搖床轉(zhuǎn)速180r/m)振動培養(yǎng)18小時。得到液體種子。
[0031]將1.25L液體種子接種入裝有25L實施例1的本發(fā)明培養(yǎng)基的40L發(fā)酵罐中(接種前120°C滅菌8分鐘)通風(fēng)量(即每分鐘內(nèi)每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積比)為I: 0.1，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至13小時，停止發(fā)酵，得到甘精胰島素前體。
[0032]采用金屬親和層析和考馬斯亮藍(lán)G-250法測定甘精胰島素前體蛋白的含量:發(fā)酵液4500r/min離心15min后，剔除上清，收獲固態(tài)菌體，超聲破碎菌體。以8000rpm，4°C，lOmin，收集甘精胰島素前體蛋白的包涵體沉淀。用8M的尿素緩沖液(20mmol/L Tris-HClρΗ8.0,0.5mol/L NaCl,8mol/L 尿素，0.2mmol/L DTT 或 100mmol/Li3-疏基乙醇，2 %Triton)重新溶解包涵體。