一種微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種絮凝劑的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 絮凝技術(shù)是目前給水和廢水處理采用的主要方法，其效果主要取決于絮凝劑種 類。在絮凝技術(shù)發(fā)展史上，無機(jī)鹽類絮凝劑（如硫酸鋁、氯化鐵等）處理效果不理想。而聚 合無機(jī)鹽型絮凝劑（如聚合氯化鋁、聚合硫酸鐵等）處理效果雖良好，但用量大，對(duì)環(huán)境有 二次污染。如，鋁離子可毒害水生生物和微生物，通過食物鏈和飲用水，最終危害人類健康。 而鐵系絮凝劑對(duì)金屬有腐蝕性，且使水有顏色，這使鋁及鐵鹽絮凝劑的應(yīng)用大受限制。有機(jī) 高分子絮凝劑如PAM具有用量少、絮凝速度快，但殘留物不易被生物降解，且其單體有強(qiáng)烈 的神經(jīng)毒性和"三致"效應(yīng)，造成二次污染，也要限制其應(yīng)用。生物絮凝劑可稱為第三代絮 凝劑，是一種具有高效絮凝活性的微生物代謝產(chǎn)物或化學(xué)改性天然有機(jī)高分子絮凝劑，它 是利用生物技術(shù)，通過微生物的發(fā)酵培養(yǎng)，從微生物代謝產(chǎn)物中提取、純化而獲得的新型水 處理劑，其主要成分有蛋白質(zhì)、多糖、脂類、纖維素、DNA及有絮凝活性的菌體。
[0003] 微生物絮凝劑（Microbial f Iocculant)是一種對(duì)污染物具有吸附、中和和絮凝作 用的大分子產(chǎn)品，它具有安全、高效、易生物降解、無二次污染等特點(diǎn)最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)絮凝微生 物的是美國科學(xué)家But-terfield，他于1935年從活性污泥中篩選出菌膠團(tuán)產(chǎn)生菌。目前 國外的研宄者已經(jīng)開發(fā)出一系列微生物絮凝劑，有的已經(jīng)應(yīng)用到相關(guān)廢水處理和工業(yè)處理 中。
[0004] 傳統(tǒng)方法培養(yǎng)菌種時(shí)，通常采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，以達(dá)到微生物快速生長和最 大生物產(chǎn)量，結(jié)果分離的大多為生長快速且偏愛豐富營養(yǎng)的微生物，而且在自然界中，除了 一些利用高濃度營養(yǎng)的微生物種群外，其余可能是以中低營養(yǎng)甚至寡營養(yǎng)的方式生活，在 低營養(yǎng)濃度下，可以吸收足夠的有機(jī)質(zhì)維持生長。當(dāng)微生物從自然環(huán)境轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的 人工培養(yǎng)是，一些攝取營養(yǎng)能力強(qiáng)的會(huì)應(yīng)運(yùn)而生，而寡培養(yǎng)的微生物會(huì)因濃度高的營養(yǎng)基 質(zhì)而抑制生長。而剛果紅是一種染料與具有螺旋構(gòu)象的多糖可以形成絡(luò)合物，可與像纖維 素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的絮凝劑生產(chǎn)方法周期長，絮凝劑的絮凝效果差的問題，提 供一種微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法。
[0006] 本發(fā)明微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0007] 一、挑取不動(dòng)桿菌接種到富培養(yǎng)基中，于28 °C~35 °C、140r/min~160r/min、 pH6. 5~7. 5的條件下培養(yǎng)18h~24h，得到活化的菌液，將活化的菌液按照5%的接種量， 接入產(chǎn)絮培養(yǎng)基中；
[0008] 二、按照以下條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)：初始pH為6~8,培養(yǎng)溫度為15°C~30°C，搖床 轉(zhuǎn)速為120r/min~150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為20h~30h，得發(fā)酵液；
[0009] 三、將發(fā)酵液于3000r/min離心10min，收集菌體沉淀，PBS洗2~3遍，然后加入 細(xì)菌裂解液，再于冰浴條件進(jìn)行超聲波破碎20min，所得溶液于8000r/min離心5min，收集 上清，加入CTAB，混勻后形成沉淀，靜置離心，收集沉淀物，用無水乙醇和丙酮分別清洗沉淀 2~3次，此沉淀即為微生物絮凝劑；將微生物絮凝劑冷凍干燥保存。
[0010] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0011] (1)本發(fā)明方法的生產(chǎn)周期短，微生物絮凝劑的絮凝效果好。
[0012] (2)微生物絮凝劑為微生物菌體或菌體外分泌的生物高分子物質(zhì)，屬于天然有機(jī) 高分子絮凝劑，它安全無毒，經(jīng)鑒定其絮凝成分為多糖，可用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)的發(fā)酵后 處理對(duì)人體和動(dòng)物無任何毒副作用。
[0013] (3)無二次污染，絮凝成分可自行降解。
[0014] (4)微生物絮凝劑價(jià)格低廉。微生物絮凝劑是微生物菌體或有機(jī)高分子，比化學(xué)絮 凝劑便宜。微生物絮凝劑是靠生物發(fā)酵產(chǎn)生的，化學(xué)絮凝劑是人工合成的。從生產(chǎn)所用原 材料，生產(chǎn)工藝能源消耗等方面考慮，微生物絮凝劑是經(jīng)濟(jì)的。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的 任意組合。
【具體實(shí)施方式】 [0016] 一：本實(shí)施方式微生物絮凝劑的生產(chǎn)方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0017] -、挑取不動(dòng)桿菌接種到富培養(yǎng)基中，于28°C~35°C、140r/min~160r/min、pH 6. 5~7. 5的條件下培養(yǎng)18h~24h，得到活化的菌液，將活化的菌液按照5%的接種量，接 入產(chǎn)絮培養(yǎng)基中；
[0018] 二、按照以下條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)：初始pH為6~8,培養(yǎng)溫度為15°C~30°C，搖床 轉(zhuǎn)速為120r/min~150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為20h~30h，得發(fā)酵液；
[0019] 三、將發(fā)酵液于3000r/min離心10min，收集菌體沉淀，PBS洗2~3遍，然后加入 細(xì)菌裂解液，再于冰浴條件進(jìn)行超聲波破碎20min，所得溶液于8000r/min離心5min，收集 上清，加入CTAB，混勻后形成沉淀，靜置離心，收集沉淀物用無水乙醇和丙酮分別清洗沉淀 2~3次，此沉淀即為微生物絮凝劑；將微生物絮凝劑冷凍干燥保存。
[0020] 本實(shí)施方式方法的優(yōu)點(diǎn)為減少能耗，提高生產(chǎn)效率，有效降低生產(chǎn)成本，為最終實(shí) 現(xiàn)大規(guī)模生物絮凝劑的商品化制備，提供了一種快速的微生物絮凝劑生產(chǎn)方法，用該方法 生產(chǎn)的微生物絮凝劑可以獲得高的絮凝效率。
[0021] 本實(shí)施方式步驟一所述不動(dòng)桿菌文件為不動(dòng)桿菌LLin6 (Acinetobacter sp.)，保 藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年12月15日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 10180。
[0022] 步驟三所述細(xì)菌裂解液為RIPA裂解液，購買自Biosharp公司。
[0023] 本實(shí)施方式不動(dòng)桿菌是從污泥中篩選得到的，具體步驟如下：
[0024] (a)取活性污泥IOg加入裝有90mL無菌水并加有玻璃珠的滅菌三角瓶內(nèi)，150r/ min搖床震蕩20min，使其打散成均勻地懸液，用無菌水稀釋成10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7的梯 度，各取0. 2mL的稀釋液均勻涂布在含剛果紅（濃度為10mg/mL)的寡培養(yǎng)基平板上，30°C 恒溫倒置培養(yǎng)2d~3d，培養(yǎng)后挑出有紅色、深紅、橙色的菌株在液體富培養(yǎng)基培養(yǎng)后在固 體富培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離，連續(xù)劃線分離純化得到純菌種。
[0025] (b)初篩：將分離得到的純菌株接種到富集培養(yǎng)基中置于搖床33°C，150r/min震 蕩培養(yǎng)24h~48h，取培養(yǎng)液ImL接種到產(chǎn)絮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。在試管中裝入20mL 4g/ L高嶺土懸濁液，加入幾滴絮凝劑樣品，觀察是否有絮團(tuán)生成，如果有絮團(tuán)生成，說明該菌能 產(chǎn)生絮凝劑。
[0026] (c)復(fù)篩：取IOmL發(fā)酵培養(yǎng)液置于含有5g/L高嶺土懸濁液混凝攪拌機(jī)中，再加入 10%氯化媽，調(diào)節(jié)pH至中性，取液面下2cm處樣品于550nm處測定吸光度，并以加蒸餾水的 高嶺土懸液做空白對(duì)照，計(jì)算其絮凝活性。公式如下：
[0027] 絮凝率（％) = (A-B)/AX 100%
[0028] A為對(duì)照組在550nm處的吸光度，B為樣品在550nm處的吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。
[0029] (d)菌種保存在含30 %甘油的PBS中于-80 °C冰箱中保存。
[0030] 富集培養(yǎng)基由MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L、葡萄糖5g/L、牛肉膏3. 8g/L、蛋白胨10g/L、瓊 脂16g/L、pH 7. 2和蒸餾水組成；
[0031] 產(chǎn)絮培養(yǎng)基由14~18g/L葡萄糖、8~12g/