專利名稱：酰化蛋白粉的制備的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及一種以粉末狀回收?；鞍踪|(zhì)的方法，特別是那些難以通過沉淀或結(jié)晶作用并進而從水溶液中過濾出來的?；鞍踪|(zhì)，尤其是可回收某些?；葝u素原，?；葝u素或酰化胰島素類似物。另外，本發(fā)明還特別涉及到從水溶液中提取自由流動粉末狀?；葝u素原，胰島素和胰島素類似物。
2.有關(guān)技術(shù)描述用胰島素治療來模仿正常人體中內(nèi)生胰島素分泌的型式是一個長期的目標。每天對胰島素的生理需求是不定的，可以分為兩個階段(a)吸收階段，需要一劑用量的胰島素來降低與膳食有關(guān)的血葡糖，(b)后吸收階段，需要持續(xù)量的胰島素調(diào)整肝葡糖的產(chǎn)生以維持最佳的穩(wěn)定血葡糖。因此，有效治療一般涉及到兩種外生胰島素配合使用利用大劑量注射提供速效進食時間胰島素和每天注射一次或兩次來供給起長效作用的基底胰島素。
近來，一類?；葝u素有望用于長效基底胰島素治療，這類?；葝u素是通過有選擇的用活化脂肪酸衍生物，帶游離氨基的單體胰島素，包括胰島素原、胰島素和某些胰島素類似物進行?；频玫?。有效的脂肪酸衍生物包括至少具有6個碳原子鏈長的活性脂肪酸型化合物以及那些在鏈上含有8到21個碳原子的脂肪酸衍生物。用棕櫚酸衍生物一酰化的正常人胰島素是特別有希望的候選者，屬于此類的胰島素在日本專利申請1-254,699中已有介紹。
正像那些經(jīng)驗豐富的專家對此工藝所了解的那樣，回收固體蛋白質(zhì)，尤其是自由流動粉末狀蛋白質(zhì)的方法，在多方面的應(yīng)用是有優(yōu)點的，雖然不是最主要的優(yōu)點。制備粉末狀蛋白質(zhì)，可擴大貯存和配給。更確切的說，應(yīng)大量生產(chǎn)用于胰島素治療的多種組合物以滿足需求。很早以前偶然發(fā)現(xiàn)，正常胰島素包括牛胰島素、豬胰島素和人胰島素，可以通過沉淀或者更準確地說以結(jié)晶方法，從較稀的胰島素水溶液中以鋅的絡(luò)合物或以鈉晶體來提取。一般說來，所謂鋅胰島素是由含鋅離子的緩沖水溶液中結(jié)晶出來并通過過濾分離而得到。
遺憾的是，意在通過過濾提取用長鏈脂肪酸衍生物?；囊葝u素并未取得成功。事實上，許多使脂肪酸?；囊葝u素生成結(jié)晶的試驗一律未獲得成功。曾認為在這類胰島素單體上所含的長鏈脂肪酸部分具有疏水特性而造成上述困難，特別是干擾了生成合格晶體所需要的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互反應(yīng)。因此，必須尋找其他途徑來制備這類固體粉末狀?；葝u素。
一種技術(shù)上可行的生產(chǎn)?；鞍踪|(zhì)如粉末狀?；葝u素的方法，是將蛋白質(zhì)水溶液凍干。雖然制備粉末狀脂肪酸?；囊葝u素可采用這種方法，但生產(chǎn)大量商用胰島素采用凍干技術(shù)很不方便。對于大容量的凍干操作，操作人員的安全和產(chǎn)品管理都存在很多問題。
其他可能的對策涉及到等電位沉淀法。早已知道，當介質(zhì)pH值調(diào)節(jié)到接近蛋白質(zhì)的等電位點時，水溶液中蛋白質(zhì)的溶解性變小。這種普遍現(xiàn)象早被運用在蛋白質(zhì)純化和提取工藝中。一旦降低可溶性，這類蛋白質(zhì)往往可從形成的懸濁液中利用重力沉降或真空助濾和壓力助濾來提取。
遺憾的是，當試圖用簡單的調(diào)節(jié)?；鞍踪|(zhì)水溶液pH值接近等電位點的方法來提取脂肪酸?；鞍踪|(zhì)時卻生成了類似乳濁液的組合物，用重力沉降或真空助濾或壓力助濾很難使固-液分離，故必須找到一種新方法來提取這類粉末狀?；葝u素。
本發(fā)明提供一種通過沉淀和過濾制備自由流動粉末狀酯化蛋白質(zhì)的簡單的方法，特別適用于某些難以用沉淀和過濾來分離和提取的脂肪酸?；鞍踪|(zhì)。故本發(fā)明是提供一種從水溶液中提取自由流動粉末狀脂肪酸胰島素的方法。具體的說，本發(fā)明提供一種制備粉末狀脂肪酸?；葝u素的流程，用于較大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)中。本發(fā)明也適用于制備粉末狀蛋白質(zhì)。
發(fā)明的描述在本發(fā)明中所采用的全部氨基酸的縮寫均被美國專利和商標局作為規(guī)定列于37C.F.R§1.822(B)(2)中。
這里應(yīng)用的術(shù)語“胰島素”和“正常胰島素”表示人胰島素、豬胰島素或者牛胰島素。胰島素具有三個游離氨基B1-苯基丙氨酸，A1-甘氨酸和B29-賴氨酸。在位置A1和B1處的游離氨基為α-氨基，在位置B29處的游離氨基是∈-氨基。
這里應(yīng)用的術(shù)語“胰島素原”是適當交聯(lián)的蛋白質(zhì)，其化學式為B-C-A其中A系胰島素的A鏈或其官能衍生物
B系胰島素的B鏈或其具有∈-氨基的官能衍生物C系聯(lián)接在胰島素原上的縮氨酸。優(yōu)選地，胰島素原為人胰島素的A鏈，人胰島素的B鏈，而C為自然聯(lián)接的縮氨酸。當胰島素原屬于天然序列時，胰島素原具有三個游離氨基苯基丙氨酸(1)(α-氨基)，賴氨酸(29)(∈-氨基)和賴氨酸(64)(∈-氨基)。
這里應(yīng)用的術(shù)語“胰島素類似物”是顯示胰島素活性的適度交聯(lián)的蛋白質(zhì)，其化學式A-B式中A系胰島素的A鏈或胰島素A鏈的官能衍生物；B為胰島素的B鏈或胰島素的B鏈的官能衍生物，此B鏈具有∈-氨基和至少A或B鏈之一含有來自天然系列的氨基酸變體；優(yōu)選的胰島素類似物包括下列胰島素；在B28位置上的氨基酸殘基為Asp，Lys，Leu，Val，或Ala；在B29位置上的氨基酸殘基為Lys或Pro；在B10位置上的氨基酸殘基為His或Asp；在B1位置上的氨基酸殘基為Phe，Asp，或單獨缺失的，或與位置B2上的殘基聯(lián)合缺失的；在B30位置上的氨基酸殘基是Thr，Ala，或缺失的；在B9位置上的氨基酸殘基為Ser或Asp，只要B28或B29位置是Lys。
在普通熟練技工掌握的標準生物化學術(shù)語中，優(yōu)先選擇的胰島素類似物為LysB28proB29-人胰島素(B28為Lys；B29為Pro)；AspB28-人胰島素(B28系A(chǔ)sp)；AspB1-人胰島素，ArgB31，B32-人胰島素，AspB10-人胰島素，ArgA0-人胰島素，AspB1，GluB13-人胰島素，AlaB26-人胰島素以及GlyA21-人胰島素。
術(shù)語“?；北硎疽氲囊粋€或多個?；怨矁r結(jié)合到蛋白質(zhì)的游離氨基上。
術(shù)語“脂肪酸”表示飽和或非飽和的C6-C12脂肪酸。術(shù)語“活化的脂肪酸酯”表示利用常規(guī)技術(shù)活化的脂肪酸。該常規(guī)技術(shù)已在Methods ofEnzymology，25494-499(1972)和Lapidot在I.of Lipid Res.，8142-145(1967)中作過介紹，其公開內(nèi)容引于此以供參考。優(yōu)選的脂肪酸為飽和脂肪酸，包括肉豆蔻酸(C14)，十五烷酸(C15)，棕櫚酸(C16)，十七烷酸(C17)，和硬脂酸(C18)，最優(yōu)選的脂肪酸是棕櫚酸。活化的脂肪酸酯包括介質(zhì)的衍生物如羥基苯丙三氮雜環(huán)(HOBT)，N-羥基琥珀酰亞胺及其衍生物，優(yōu)選的活性酯為N-琥珀酰亞胺基棕櫚酸鹽。
術(shù)語“交聯(lián)”表示在半胱胺酸殘基之間形成二硫化物鍵。適當交聯(lián)的胰島素原，胰島素，胰島素類似物含有三個二硫化物橋。第一二硫化物橋連在A鏈的位置6和位置11上的半胱胺酸殘基之間。第二二硫化物橋?qū)鏈位置7的半胱胺酸殘基與B鏈位置7的半胱胺酸相連。第三二硫化物橋?qū)鏈位置20上的半胱胺酸聯(lián)接到B鏈位置19的半胱胺酸上。
術(shù)語“沉淀”涉及一種過程，在此過程中，在液體中產(chǎn)生易于濾出的顆粒物，它與由于溶液中溶質(zhì)的溶解度的簡單改變而導致生成的穩(wěn)定懸濁物和/或類似乳化物的兩相混合物不同。這種可濾出的顆粒物本身稱為“沉淀物”。
用語“易可濾的”和其它類似用語均與條件有關(guān)，在此條件下，固-液混合物或漿液中的顆粒可通過死端式過濾以及通過能形成易操作的含殘余水物質(zhì)，即濾餅的有關(guān)技術(shù)而達到分離，殘余水不會使濾餅呈漿泥狀，而呈固體狀。在死端式過濾中，送入漿液，其濾出液基本上垂直穿過濾器的平面，這與“錯流”或“切流”過濾不同，其主液流是平行流過濾器表面。重要的是，本發(fā)明的方法產(chǎn)生一種酰化蛋白質(zhì)漿液，它可利用死端式過濾和相關(guān)的技術(shù)在平均或均值濾速超過5l/m2/hr(LMH)下過濾，通常平均或均值濾速超過20LMH。過濾終點一般是使濾餅?zāi)軡M足固體操作。這樣的濾速對工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的運行經(jīng)濟是很關(guān)鍵的。
術(shù)語“含水的”是指含潛溶劑體系以及只用水作為溶劑。
本發(fā)明涉及一種從含水混合物中提取粉末狀?；鞍踪|(zhì)的方法，尤其是那些難以利用等電位沉淀從含酰化蛋白質(zhì)水溶液中分離和提取的?；鞍踪|(zhì)。該法包括調(diào)節(jié)?；鞍踪|(zhì)水溶液pH值至使溶液中蛋白質(zhì)變成不溶的，然后將足夠量的醇加到蛋白質(zhì)含水混合物中使之在上述pH值下形成可濾性蛋白質(zhì)顆粒沉淀物。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種粉末狀?；鞍踪|(zhì)，特別是難以用等電位沉淀從水溶液中分離出的?；鞍踪|(zhì)。尤其涉及到粉末狀脂肪酸酰化的胰島素原，脂肪酸酰化的胰島素或脂肪酸?；囊葝u素類似物，通過調(diào)節(jié)?；葝u素蛋白質(zhì)水溶液的pH值使蛋白質(zhì)在水溶液中變成不溶性的，然后向蛋白質(zhì)水溶液中加足夠量的醇使其在上述pH值下形成可過濾的粒狀蛋白質(zhì)沉淀。之后，通過過濾與干燥來提取無鋅粉末狀?；鞍踪|(zhì)。利用本方法制備優(yōu)選的粉末狀?；鞍踪|(zhì)包括N-棕櫚酰LysB29人胰島素和B28-N∈-棕櫚酰-LysB28ProB29-人胰島素(B28為酰化的Lys和B29是Pro)。
應(yīng)用胰島素原，胰島素和胰島素類似物制備?；鞍踪|(zhì)系本發(fā)明的主要中心點，它可以利用公認的縮氨酸合成技術(shù)中任意一種方法，包括經(jīng)典法(溶液法)，固相法，半合成法，以及最近的重組DNA法。例如，Chance等人的美國專利申請?zhí)?7/388,201，歐洲專利申請?zhí)?83472，Brange等人的歐洲專利申請214826，以及Belagaje等人的美國專利5,304,473所公布的各種胰島素原與胰島素類似物的制備方法，均列于此處做參考。本發(fā)明中胰島素類似物的A鏈和B鏈也可經(jīng)由一個類似胰島素原的母體分子用重組DNA技術(shù)制備，見Frank等人.，縮氨酸合成-結(jié)構(gòu)-功能，美國第七屆縮氨酸專題討論會文集Eds.D.Rich&E.Gross(1981)，列在此處作參考。
通常，胰島素原，胰島素，胰島素類似物是通過與活化的脂肪酸衍生物諸如活化脂肪酸酯反應(yīng)而酰化。用脂肪酸?；Ｒ葝u素在日本專利申請1-254,699中已有披露，也可見Hashimoto等人.，藥物研究，6171-176(1989)。這里引用作參考。
最好在極性溶劑中的堿性條件下進行酰化，即pH值大于9.0，最好為10.5左右。盡管?；磻?yīng)可在純有機極性溶劑中于pKa大于或等于10.75的堿性條件下進行，但我們選擇一種混合的有機與含水溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)。優(yōu)先選用的堿有四甲基胍、二異乙基胺或四丁基胺的氫氧化物。一種特別適用的溶劑是乙腈和水，含有約50％乙腈。其他極性溶劑包括二甲基亞砜，二甲基甲酰胺等。潛溶劑體系還包括丙酮和水，異丙基和水，以及乙醇和水。適合進行反應(yīng)的時間與溫度并不是狹窄的臨界條件。溫度為0到40℃，反應(yīng)時間為15分鐘至24小時一般來說應(yīng)當是適宜的。制備脂肪酸酰化的胰島素的特別可取的方法描述于共同待決的美國專利申請序列號08/341231，November 17，1994，其內(nèi)容列于此作參考文獻。
一旦反應(yīng)完成，含有?；鞍踪|(zhì)的反應(yīng)混合物一般用水稀釋并加酸中和堿度。酸以水溶液形式加入到酰化蛋白質(zhì)中，并使溶液pH值降低到低于蛋白質(zhì)的等電位點。通常該點會使蛋白質(zhì)處于合適的緩沖水溶液中以便于進一步處理。此處理具體包括采用標準色層分離法，如反相或疏水色層分離，利用錯流過濾濃集，通過超濾溶劑更換等。對于酰化胰島素原，酰化胰島素與?；葝u素類似物，特別是N-棕櫚酰LysB29人胰島素和B28-N∈-棕櫚酰-LysB28ProB29-人胰島素，pH值一般應(yīng)調(diào)節(jié)到低于3.0，如需要，最好用酸調(diào)節(jié)到介于約1.5和2.5之間。適用的酸包括HCl，醋酸，甘氨酸，尤其是檸檬酸。發(fā)現(xiàn)使用濃度50mM的檸檬酸是適宜的。如有必要，pH值還能用堿，如用氫氧化鈉調(diào)節(jié)使之保持在所要求的pH范圍內(nèi)。
這時經(jīng)過分離的，最好是經(jīng)過純化的?；鞍踪|(zhì)水溶液，尤其是脂肪酸?；囊葝u素原，脂肪酸?；葝u素或脂肪酸?；葝u素類似物的水溶液可以按照本發(fā)明方法處理以提取粉末狀可溶性蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，加堿來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水溶液的pH值，最好是用水溶性堿如氫氧化鈉，加入足夠量使可溶性的蛋白質(zhì)變成不溶性的。即將溶液的pH值調(diào)節(jié)到接近?；鞍踪|(zhì)的等電位點，或稱之為等電位pH值。在脂肪酸?；囊葝u素原，脂肪酸酰化胰島素和脂肪酸?；葝u素類似物的情況下，特別是N-棕櫚酰LysB29人胰島素，將pH值調(diào)節(jié)到4.0至6.0范圍內(nèi)，最好是4.5到5.5證明是適用的。在此pH范圍內(nèi)，?；鞍踪|(zhì)的凈電荷應(yīng)當最少，并且其溶解度也應(yīng)最小。在調(diào)節(jié)pH值期間，溶液要攪拌使之完全混合。
特別適合于按本發(fā)明方法處理的酰化蛋白質(zhì)水溶液，當pH值調(diào)節(jié)到接近其等電位pH時，則形成類似乳濁液的組合物。這種情況會對大規(guī)模處理中采用諸如死端式過濾固/液分離技術(shù)提純蛋白質(zhì)產(chǎn)生干擾。本發(fā)明的核心點是使用醇，特別是乙醇，將其加到含水蛋白質(zhì)混合液中以有助于形成易于過濾的?；鞍踪|(zhì)沉淀物。
調(diào)節(jié)溶液pH值和加醇的順序不是關(guān)鍵性的問題，可以在調(diào)節(jié)pH值以降低蛋白質(zhì)的可溶性之前將醇加到蛋白質(zhì)溶液中，最后形成沉淀物，也可以在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH值后加醇。
專利申請人發(fā)現(xiàn)，為獲得易過濾沉淀物而需加到酰化蛋白質(zhì)溶液中的醇的量處在窄的范圍內(nèi)。專利申請人特別發(fā)現(xiàn)對于脂肪酸?；囊葝u素，尤其是N-棕櫚酰LysB29人胰島素，形成易于過濾的沉淀物只與加入適量的醇，特別是乙醇有關(guān)，含水蛋白質(zhì)乳濁液或漿液中最終醇濃度至少達到約20％到35％，最好是約25％到30％。雖然乙醇是所選用的醇，但其他醇類如甲醇和異丙醇在一定條件下可作為替代物。
向蛋白質(zhì)水溶液中加入過量的醇會干擾形成一種合格的沉淀物，但加醇量不足時，則不足以把調(diào)節(jié)?；鞍踪|(zhì)pH值所產(chǎn)生的類似乳濁液的組合物轉(zhuǎn)化為易于過濾的漿液或乳濁液。實際醇濃度比要求的高時，蛋白質(zhì)會再溶解，可能減少產(chǎn)額。為了促進其他脂肪酸?；鞍踪|(zhì)的沉淀和過濾作用，可利用常規(guī)試驗來確定加醇量，例如加乙醇的量。
事實上本發(fā)明的基本觀點是，要制備一種自由流動粉末狀?；鞍踪|(zhì)，特別是從蛋白質(zhì)水溶液中難以通過等電位沉淀和過濾來分離和制備的那種?；鞍踪|(zhì)，在制備時應(yīng)當具有以下綜合條件，(a)pH應(yīng)在或接近蛋白質(zhì)的等電位pH值，(b)足夠量的醇濃度促使形成易于過濾的顆粒物有助于蛋白質(zhì)的沉淀和過濾。如上所述，在N-棕櫚酰LysB29人胰島素情況下，乙醇濃度約為漿液體積的20％到35％，最好是大約25％到30％對促使蛋白質(zhì)形成易于過濾的顆粒沉淀物特別有利。
總而言之，制備有所要求的醇(如乙醇)濃度及酰化蛋白質(zhì)的等電位pH值的含水蛋白質(zhì)混合物的方法不是關(guān)鍵。例如，可用水稀釋已調(diào)好pH但醇濃度高于所需值的蛋白質(zhì)水溶液以得到這種混合物，即在N-棕櫚酰LysB29人胰島素的情況下可將醇體積濃度超過35％如40-45％的乙醇稀釋到所要求的濃度范圍。最好對醇濃度和pH在所需限值內(nèi)的組合物進行緩慢地攪拌(混合)以促使沉淀物形成。
根據(jù)本發(fā)明，在處理前，溶液中?；鞍踪|(zhì)的濃度也不是關(guān)鍵問題。但在酰化胰島素也包括?；葝u素原和酰化胰島素類似物的情形下，濃度至少應(yīng)為1mg/ml左右，通常最好至少采用濃度為5mg/ml的溶液，盡管采用蛋白質(zhì)濃度高達35到50mg/ml和更高的溶液，可得到在更滿意的濾速下過濾的蛋白質(zhì)沉淀。如上所述，通過pH調(diào)節(jié)和加醇聯(lián)合處理產(chǎn)生的蛋白質(zhì)漿液應(yīng)具有平均或均值濾速至少約為5LMH，而最好的均值濾速約為15LMH。意外的是，當按本發(fā)明來處理N-棕櫚酰LysB29人胰島素溶液時，發(fā)現(xiàn)均值濾速約為20LMH甚至更高。
雖然對于獲得最好的結(jié)果并沒有嚴格的條件，但過濾期間溫度應(yīng)保持在20℃到30℃之間。無論如何過濾時應(yīng)避免溫度為0℃或低于0℃，因為這樣低的溫度會在所要求的高濾速下影響操作。雖然實際上最好是在環(huán)境溫度下進行過濾，預(yù)先的調(diào)節(jié)pH和加乙醇可在高于漿液冰點以上任何溫度下完成。
這時含水蛋白質(zhì)組合物即可進行過濾以分離沉淀的蛋白質(zhì)。有時，在過濾前進行重力增濃或使含水蛋白質(zhì)組合物或漿液沉降有利于最大地降低過濾裝置的液壓負荷。當大規(guī)模生產(chǎn)時，例如，批量生產(chǎn)大于0.5Kg，采用離心過濾含水蛋白質(zhì)組合物將是有益的，但根據(jù)本發(fā)明廣泛的實踐，任何用于液/固分離的手段，包括真空助濾和壓力助濾都能用來回收沉淀的蛋白質(zhì)。規(guī)模較小時，例如批量生產(chǎn)低于0.3到0.5Kg，利用裝配有多孔燒結(jié)陶瓷過濾表面的壓力助濾裝置過濾具有優(yōu)越性。通過額定孔徑約5.0μm的多孔燒結(jié)陶瓷過濾證明是十分有效。對用來過濾漿液的設(shè)備要求不太高，任何適合于處理藥物組合物的各種類型過濾系統(tǒng)都可采用。
過濾后回收濾餅并干燥，一般用真空助蒸法干燥。根據(jù)本發(fā)明的廣泛實踐，任何用于干燥濃稠的固態(tài)膏狀物的方法，只要不損害分離出來的蛋白質(zhì)都可應(yīng)用?；厥諡V餅的方法和干燥濾餅的其他方法均應(yīng)是技術(shù)上成熟的且不是關(guān)鍵問題。
本發(fā)明的酰化胰島素粉末可作為大批量藥材(BDS)用于制備胰島素治療的藥物組合物，也就是說，滿足病人的需要(即生高血糖癥的病人)。此類藥物組合物中含有有效量的粉末并配入一種或多種藥物上合格的賦形劑或載體。為此目的，藥物組合物應(yīng)按標準配方配制，含約100單位/mL或含有效量的?；葝u素粉末的類似濃度。這類組合物屬于典型的非腸胃吸收的藥物，但也未必如此，可采用任一種所熟知的制備普通賦形劑或載體的工藝來制備非腸胃吸收的藥物。例如可參見Remington’sPharmaceutical Sciences.17版.Mack出版公司，Easton，PA，美國(1985)。舉例來說，對于非腸胃吸收的用藥形式，可將規(guī)定量的蛋白質(zhì)粉末懸浮或溶解在無毒的適合于注射的液體媒介物中如水相介質(zhì)，然后再對懸浮液或溶液進行消毒。另一方法是將量過的粉末置于小藥瓶中；并將小藥瓶和內(nèi)盛物進行消毒和密封?？赏瑫r提供小藥瓶或媒介物，供給藥前混合用。
適應(yīng)非腸胃吸收用法的藥物組合物可使用稀釋劑，賦形劑和載體如水和與水混溶的有機溶劑，如甘油，芝麻油，花生油，水相丙二醇，N，N-二甲基甲酰胺等。這類藥物組合物的樣品包括無菌、等滲壓的粉末的鹽水溶液，這種粉末鹽可用藥物上合格的緩沖劑進行緩沖，并不需加熱。此外，非腸胃吸收藥物的配方中還含有防腐劑如甲醇，以及調(diào)節(jié)最終產(chǎn)品pH的其他試劑如氫氧化鈉或鹽酸以及穩(wěn)定劑如鋅鹽。
提出以下示例來描述和解釋本項發(fā)明。這里僅參照制備粉末狀N-棕櫚酰LysB29人胰島素來敘述本發(fā)明，但本發(fā)明的應(yīng)用范圍不應(yīng)受本示例的限制。除另有說明外，所有提到的份額和百分數(shù)均為重量百分數(shù)，所有的溫度都以攝氏度來表示。示例脂肪酸?；纳锖铣扇艘葝u素(N-棕櫚酰LysB29人胰島素)水溶液(8.8L)含蛋白質(zhì)濃度50mg/ml，在pH2.6、溫度2-8℃下用530ml 10％的氫氧化鈉處理使pH值提高到5.7。接著攪拌調(diào)節(jié)過pH的溶液達到徹底混合，然后在緩慢的攪拌下向每升調(diào)過pH的溶液中加入0.46L無水乙醇(達到總?cè)芤后w積13L)，促使?；葝u素沉淀。?；鞍踪|(zhì)用配有標稱孔徑為5μ的不銹鋼燒結(jié)物的壓力助濾器去水。均值濾速測量值約為25LMH。棄去濾液。然后用30％體積的乙醇溶液洗滌濾餅，并從過濾器上取下洗好的濾餅在真空下干燥制成無鋅粉末。該粉末具有極好的貯存穩(wěn)定性，故適合于作為大批量藥材。實質(zhì)上，在濾餅中回收了全部蛋白質(zhì)，經(jīng)由濾液的損耗很小。
本項發(fā)明的原理，優(yōu)選實例和操作模式按上述技術(shù)要求作了詳細的說明，主要以脂肪酸?；囊葝u素原，胰島素和胰島素類似物，特別是以N-棕櫚酰LysB29人胰島素為參照例，受到保護的本發(fā)明并不受限于公開的特定內(nèi)容，因為這些內(nèi)容是做為實例而不是約束。在不違反本發(fā)明權(quán)利要求的精神下，可做出變革和修改。
權(quán)利要求
1.一種從水相混合物中提取粉末狀?；鞍踪|(zhì)方法，該方法包括將蛋白質(zhì)的水溶液pH值調(diào)節(jié)到使溶液中所含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為不溶性的，然后向水相蛋白質(zhì)混合物中加入足夠量的醇，促使蛋白質(zhì)在所述pH值下以可濾的顆粒形態(tài)沉淀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)是用脂肪酸衍生物?；说牡鞍踪|(zhì)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中?；鞍踪|(zhì)包括難以用等電位沉淀法從蛋白質(zhì)水溶液中分離出來的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中?；鞍踪|(zhì)選自脂肪酸?；葝u素原，脂肪酸?；葝u素和脂肪酸?；葝u素類似物。
5.專利要求4的方法，其中水溶液的pH值調(diào)節(jié)到大約4.0到6.0左右。
6.權(quán)利要求5的方法，其中?；鞍踪|(zhì)是N-棕櫚酰LysB29人胰島素。
7.權(quán)利要求6的方法，其中醇是乙醇，其加入量產(chǎn)生的濃度按水相混合物體積計為20％到35％(體積)。
8.專利要求7的方法，其中醇濃度為25％到30％(體積)。
9.一種從蛋白質(zhì)水溶液中提取粉末狀?；鞍踪|(zhì)的方法，該方法包括調(diào)節(jié)該水溶液使之接近蛋白質(zhì)的等電位pH值，并提供合適的醇濃度以助于蛋白質(zhì)在該pH值下以可濾的顆粒形式沉淀。
10.權(quán)利要求9的方法，其中?；鞍踪|(zhì)是難以用等電位沉淀法從所述水溶液中分離的?；鞍踪|(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中酰化蛋白質(zhì)選自脂肪酸?；葝u素原，脂肪酸?；葝u素和脂肪酸?；葝u素類似物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中水溶液被調(diào)節(jié)到pH約4.0到6.0。
13.權(quán)利要求12的方法，其中酰化蛋白質(zhì)是N-棕櫚酰LysB29人胰島素。
14.權(quán)利要求13的方法，其中醇是乙醇，其加入量產(chǎn)生的醇濃度按水相混合物體積計為25％到30％(體積)。
15.一種粉末狀酰化蛋白質(zhì)，其制備方法是(a)調(diào)節(jié)?；鞍踪|(zhì)水溶液達到或接近蛋白質(zhì)的等電位pH值，與(b)向該?；鞍踪|(zhì)水溶液組合物中提供合適的醇濃度以助于在該pH值下形成可濾的蛋白質(zhì)顆粒，接著通過水相蛋白質(zhì)組合物的過濾和干燥來回收沉淀出的蛋白質(zhì)粉末的可濾顆粒。
16.權(quán)利要求15的粉末狀?；鞍踪|(zhì)，其中該?；鞍踪|(zhì)包括難以由等電位沉淀從水溶液中分離出來的蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求16中的粉末狀?；鞍踪|(zhì)，其中酰化蛋白質(zhì)選自脂肪酸?；葝u素原，脂肪酸酰化胰島素和脂肪酸?；葝u素類似物。
18.權(quán)利要求17的粉末狀?；鞍踪|(zhì)，其中水溶液被調(diào)節(jié)到pH約4.0到6.0。
19.權(quán)利要求18的?；鞍踪|(zhì)，其中醇是乙醇，其加入量產(chǎn)生的醇濃度按水相蛋白質(zhì)組合物體積計為25％到30％(體積)。
全文摘要
一種提取粉末狀酰化蛋白質(zhì)的方法,特別適用于難以通過等電位沉淀法從蛋白質(zhì)水溶液中制備的?；鞍踪|(zhì),該方法包括調(diào)節(jié)水溶液使之接近蛋白質(zhì)等電位pH值,同時提供合適的醇濃度,以使蛋白質(zhì)在所調(diào)節(jié)的pH值下以可濾的顆粒物形態(tài)沉淀。
文檔編號C07K1/00GK1192218SQ96195951
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者J·C·巴克, B·A·莫澤, W·E·施雷德 申請人:伊萊利利公司