。
[0147] 用1M HC1將pH值調(diào)節(jié)至7.5,和加入50%乙醇至體積500 mL。將pH值調(diào)節(jié)至7.5。測 量電導(dǎo)率為1.6 mS/Cm。
[0148] 通過陰離子交換色譜在Akta Explorer上進行純化： 柱：150 mL (2.6x28 cm) Poros 50HQ A緩沖液:含 15 mM TRIS, 50 mM乙酸銨的50%乙醇pH 7.5 (1.6 mS/cm) B緩沖液:含 15 mM TRIS, 500mM乙酸銨的50%乙醇pH 7.5 (14 mS/cm) 梯度:0-80%B，經(jīng) 20CV 流速：25mL/min〇
[0149] 將產(chǎn)物合并液700 mL用700 mL的50%乙醇稀釋和再純化一次： 柱：150 mL (2.6x28 cm) Poros 50HQ A緩沖液:含 15 mM TRIS, 50 mM乙酸銨的50%乙醇pH 7.5 (1.6 mS/cm) B緩沖液:含 15 mM TRIS, 500mM乙酸銨的50%乙醇pH 7.5 (14 mS/cm) 梯度:0-100% B，經(jīng)12CV 流速：25 mL/min〇
[0150] 將產(chǎn)物合并液300 mL用300 mL水稀釋，和在C18柱上脫鹽： 柱：30x250 mm (Daiso_200_15um_FEFgel304_0DDMS_30x250 mm), CV=177 mL A緩沖液:含10%乙腈的milli-Q水+ 0.1% TFA B緩沖液:含80%乙腈的milli-Q水+ 0.1% TFA 梯度：25-80%B，經(jīng)20 min 流速：35 mL/min〇
[0151] 將產(chǎn)物流分凍干，得到TFA鹽，將其溶于50 mL水加10 mL乙腈，用0.5M含水NaOH調(diào) 節(jié)pH至8.0和凍干，得到1.25 g (36%)的標題胰島素。
[0152] LC-MS (電噴射）：m/z = 1593.1 (M+4)/4。計算值：1594.1。
[0153] 實施例2 胰島素受體親和力 本發(fā)明的?；葝u素類似物對人胰島素受體的親和力通過SPA測定法(Scintillation Proximity Assay)微量滴定板抗體捕獲測定法測定。SPA-PVT抗體結(jié)合珠、抗小鼠試劑 (Amersham Biosciences，目錄號PRNQ0017)與25 mL的結(jié)合緩沖液（100 mM HEPES pH 7.8; 100 mM氯化鈉，10 mM MgS〇4，0.025% Tween-20)混合。用于單次Packard Optiplate (Packard No. 6005190)的試劑混合物包括2.4 μL的1:5000稀釋的純化重組人 胰島素受體(有或沒有外顯子11)、一定量的A14Tyr[125I]_人胰島素儲液(對應(yīng)于5000 cpm/ 100 μL試劑混合物）、12 μL的1:1000稀釋的F12抗體、3 mL的SPA-珠和結(jié)合緩沖液至總共12 mL。然后將總共100 μL試劑混合物加入至Packard Optiplate的各孔和在Optiplate中自合 適的樣品制備胰島素衍生物的稀釋系列。然后將樣品孵育16小時，同時輕輕振蕩。然后通過 離心1 min分離各相和將板在Topcounter中計數(shù)。結(jié)合數(shù)據(jù)使用非線性回歸算法在 GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA)中擬合，和親和力相對于 (以百分比(％)計)人胰島素的親和力表示。
[0154] 還使用相關(guān)的測定法，其中結(jié)合緩沖液還包含1.5%HSA以模擬生理條件。
[0155] 表1 本發(fā)明選擇的胰島素的胰島素受體親和力
實施例3 本發(fā)明的胰島素衍生物的疏水性 胰島素衍生物的疏水性通過在等度條件下運行的反相HPLC發(fā)現(xiàn)。將胰島素衍生物的洗 脫時間與人胰島素(本文稱為HI)或具有已知疏水性的另一衍生物在相同的條件下的洗脫 時間作比較。疏水性k'rel計算為 :k'relderiv = ((tderiv-t())/(tref-t()) )*k'relref。使用HI作 為參比：k'relref = k'relHi = UHPLC系統(tǒng)的排空時間to通過注入5 μL的0.1 mM NaN03測 定。
[0156] 運行條件： 柱：Lichrosorb RP-C18, 5μηι, 4 χ 250 mm 緩沖液八:〇.1]\0粦酸鈉口!17.3，1〇￥〇1%〇13〇~ 緩沖液B:50 vol% CH3CN 注入體積:5 μL 運行時間:最大60分鐘 在運行初始梯度后，選擇用于運行衍生物和參比（例如HI)的等度水平，和將在等度條 件下衍生物和參比的洗脫時間用于在上述方程中計算k'reldmv。
[0157] 表2 本發(fā)明的胰島素衍生物的疏水性
實施例4 使用十二指腸內(nèi)腔酶的胰島素類似物的降解 使用來自sro大鼠的十二指腸內(nèi)腔酶(通過過濾十二指腸內(nèi)腔內(nèi)容物制備)降解胰島素 類似物。通過自動機械在96孔板（2mL)上進行測定，其中16個孔用于胰島素類似物和標準 品。胰島素類似物約15 μΜ用十二指腸酶在100 mM Hepes，ρΗ=7·4中在37°C孵育，在1、15、 30、60、120和240 min后獲取樣品和通過加入TFA淬滅反應(yīng)。在各點的完整胰島素類似物通 過RP-HPLC測定。降解半壽期通過數(shù)據(jù)的指數(shù)擬合確定，并標準化至在各測定法中對參比胰 島素 A14E，B25H，desB30人胰島素或人胰島素測定的半壽期。為降解而加入的酶的量為使 得參比胰島素的降解半壽期為60分鐘至180分鐘的量。結(jié)果作為在大鼠十二指腸中胰島素 類似物的降解半壽期除以來自相同實驗的參比胰島素的降解半壽期(相對降解速率)示出。
[0158] 表3 降解
實施例5 靜脈內(nèi)大鼠 PK 麻醉的大鼠靜脈內(nèi)（i.v.)給予各種劑量的胰島素類似物，試驗化合物的血漿濃度使用 免疫測定法或質(zhì)譜在給藥后以指定的間隔測量4小時或更久。隨后使用WinNonLin Professional (Pharsight Inc.，Mountain View, CA, USA)計算藥代動力學(xué)參數(shù)。
[0159] 使用體重大約200克的未禁食的雄性Wistar大鼠（Taconic)。測量體重，隨后用 Hypnorm/Dormicum (各化合物分別按1:1在無菌水中稀釋，然后混合;在實驗當天新鮮制 備)將大鼠麻醉。通過2 mL/kg Hypnorm/Doricum混合物sc開始麻醉，接著以30分鐘間隔的1 mL/kg sc的兩個維持劑量，和以45分鐘間隔的1 mL/kg sc的兩個維持劑量。如果需要，為了 保持大鼠在整個過程中輕度麻醉，提供進一步的劑量1-2 mL/kg sc。在大鼠關(guān)養(yǎng)室中進行 稱重和開始麻醉，以避免因在各室之間移動動物而對動物形成壓力。
[0160] 表4 大鼠 PK
實施例6 狗靜脈內(nèi)藥代動力學(xué)(PK)概況 本方案的目標是在靜脈內(nèi)給予比格犬后自不同的胰島素類似物的血漿濃度-時間概況 獲得藥代動力學(xué)(ΡΚ)數(shù)據(jù)和計算類似物的相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)。
[0161] 動物自由獲得家用質(zhì)量飲用水。在每個給藥日，將動物稱重。各試驗物質(zhì)給予3只 動物。根據(jù)對每只動物進行的程序的數(shù)量和程度，考慮了個體動物福利。自各動物獲得完整 的血漿濃度-時間概況。在采血期間，將狗置于桌上，和由坐在旁邊的動物技術(shù)員來固定。該 程序在馴化期間經(jīng)過訓(xùn)練。根據(jù)以下時間表，將血樣0.5 mL收集到EDTA管中： 給藥前（_1〇、〇)和5、15、30、45、60、75、90、120、150、180、210、240、300、480、600、720、 960、1440、1920、2880、4320、5760、7200、8640、10080分鐘。
[0162] 在頻繁采樣期間，血樣獲自用肝素鹽水保持打開的頭靜脈中的Venflon導(dǎo)管。其它 血樣獲自頸靜脈。
[0163] 將血樣保持在冰上最多20分鐘，然后在4°C以1，300 g離心4分鐘。
[0164] 將血衆(zhòng)立即轉(zhuǎn)移至兩個micronic管中，每個管中有來自各血樣的80 μL血衆(zhòng)，和按 照支架輪廓放置。將血漿保存在_20°C直至分析。
[0165] 血衆(zhòng)濃度-時間概況通過非區(qū)室藥代動力學(xué)分析使用WinNonlin Professional (Pharsight Inc.，Mountain View, CA, USA)進行分析。
[0166] 使用來自每只動物的單獨濃度-時間值進行計算。
[0167] 表5 狗PK 實施例7
在存在鋅的情況下化合物1和比較化合物A的初始溶解度 化合物 1 和比較化合物A (即N{>-B29}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九烷?；被┒□；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰 基]-[GluA14，HisB16，HisB25]，des-ThrB30-胰島素（人）；替代名稱：A14E，B16H，B25H， Β29Κ(Νε二十烷二酰基-gGlu-2x0EG)，desB30人胰島素）在大約8的pH值下分別溶于milli-Q水。以所提及的順序加入苯酚、甲酚、乙酸鋅(Zn)、氯化鈉和甘油，得到最終的藥物組合物， 其包含:4.2-5 mM胰島素、1.6%甘油、25 mM苯酚、25 mM甲酚，pH 7.4和在下表中所示的鋅和 氯化鈉濃度。藥物組合物在22°C貯存24小時和以15,000 X g離心15分鐘。將100 μL的上清 液轉(zhuǎn)移至HPLC小管，和使用如Eur. Pharm. NovoRapid中所述的酸性凝膠過濾測定濃度?？?溶性胰島素的量以起始濃度的百分比測定。測量的準確度為+/- 2%。
[0168] 表6 在Zn存在的情況下化合物1和比較化合物A各自的溶解度
結(jié)論 在試驗條件下在存在至多12.5個鋅分子/六聚體的情況下，在沒有NaCl的組合物中比 較化合物是可溶的。在試驗條件下在存在至多10.5個鋅分子/六聚體的情況下，在含有20 mM NaCl的組合物中比較化合物A是可溶的。
[0169 ]在至多大約15.3個鋅六聚體胰島素的試驗條件下，在沒有NaCl的組合物中化合物 1是可溶的。此外，在至多大約14.5個鋅分子/六聚體胰島素的試驗條件下，在20 mM NaCl的 情況下化合物1是可溶的。
[0170] 實施例8 在存在鋅的情況下人胰島素的初始溶解度 在約8的pH值下將人胰島素溶于milli-Q水。將苯酚、甲酚、乙酸鋅(Zn)、氯化鈉和甘油 以所提及的順序加入，得到最終制劑，其包含:4.2-5 mM胰島素、1.6%甘油、25 mM苯酚、25 mM甲酚、pH 7.4和下表中示出的鋅和氯化鈉濃度。將制劑在22 °C貯存24小時，然后以15 000 X g離心15分鐘。將100 μL的上清液轉(zhuǎn)移至HPLC小管，和使用Eur. Pharm. NovoRapid中描 述的酸性凝膠過濾測定濃度?？扇苄砸葝u素的量以起始濃度的百分比測定。
[0171] 測量的準確性為+/- 2%。
[0172] 表7 在存在鋅的情況下人胰島素的溶解度 結(jié)論
當制劑包含NaCl時在包含至多6個Zn/胰島素六聚體的制劑中，和當制劑包含幾乎無 NaCl時在包含至多4個Zn/胰島素六聚體的制劑中，人胰島素是可溶的。
[0173] 實施例9 作為鋅和氯化鈉含量的函數(shù)的化學(xué)和物理穩(wěn)定性 本實驗的目的是