源于人單性生殖胚泡的患者特異性干細胞系的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2008年04月07日，申請?zhí)枮?200880018767. X(PCT/US2008/004529)，發(fā)明名稱為"源于人單性生殖胚泡的患者特異性干 細胞系"。
技術領域
[0002] 本發(fā)明一般性地涉及胚胎干細胞，以及更具體地涉及獲得HLA純合單性生殖人干 細胞系進行基于細胞的治療的方法。
【背景技術】
[0003] 最初的人胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESC)源于獲自受精卵母細胞的胚 泡內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM)，其能夠無限分裂并分化成所有組織類型的細胞。胚 胎干細胞是多能細胞的潛在的無限來源，所述多能細胞用于基于移植的細胞治療。
[0004] 人胚胎干細胞（ES)細胞是多能細胞，其可分化成大量細胞類型。當注射到免 疫缺陷鼠中時，胚胎干細胞形成分化的腫瘤（畸胎瘤）。但是，被體外誘導以形成胚狀體 (embryoid bodies, EBs)的胚胎干細胞提供了胚胎干細胞系的來源,其在某些生長條件下 被控制分化成表征幾種組織的多種細胞類型。例如，在神經(jīng)生長因子和視黃酸存在的情況 下，ES細胞分化成神經(jīng)元。
[0005] 如果免疫排斥的問題可以解決，則人胚胎干細胞具有給予患者顯著治療益處的潛 能。與受體（recipient)遺傳相關的胚胎干細胞可克服這些排斥問題。目前，人胚胎干細 胞（human embryonic stem cells，hES)源于三種來源：不育治療后剩余的并捐贈用于研究 的胚泡，從捐贈的配子（卵母細胞和精子）產(chǎn)生的胚泡，以及核移植（nuclear transfer, NT)的產(chǎn)物。死胎組織是人胚胎生殖細胞（human embryonic germ cells, hEG)的唯一來 源。hES和hEG細胞提供顯著的科學和治療可能性，其涉及產(chǎn)生更專一化的細胞或組織的潛 能。但是，有關hES和hEG細胞的來源的倫理關注，以及用NT進行研究會導致用NT產(chǎn)生人 類的擔心，已引發(fā)了大量的公眾討論和辯論。
[0006] 哺乳動物卵母細胞的單性生殖活化（parthenogeneic activation)可作為對通過 精子受精/NT的替代而應用，以便制備用于胚胎干細胞產(chǎn)生的卵母細胞。單性生殖活化是 在缺乏來自雄性配子的任何貢獻的情況下，從雌性配子產(chǎn)生胚胎細胞，其最終發(fā)育為成體 或不最終發(fā)育為成體。
[0007] 與SCNT相比，卵母細胞的單性生殖活化是產(chǎn)生組織相容性干細胞的相對簡單的 方法，原因在于它不需要顯微操作卵母細胞所需的復雜設備。單性生殖干細胞從未受精的 卵母細胞產(chǎn)生并且含有卵母細胞供體（潛在患者）專有的遺傳物質。進一步，在定向細胞 分化后，自體細胞可被移植而沒有免疫排斥的威脅。單性生殖小鼠MHC-純合干細胞系和一 種單性生殖靈長類動物雜合胚胎干細胞系（Cyno-1)已被得到并且在這些細胞系中已表明 細胞多能性。
[0008] 如上所述，同種異體組織和器官移植造成的最大風險是免疫排斥。風險的程度與 供體和受體細胞表面抗原遞呈蛋白之間的差異程度成比例。在理想的移植中，在主要組織 相容性復合物（MHC)方面，供體組織與受體是組織相容的。人白細胞抗原（HLA)系統(tǒng)是命 名人MHC的術語，并且代表對移植重要的抗原。HLA抗原匹配的供體和受體組織降低在受體 中細胞毒性T-細胞應答的機會，以及因此大大增加移植物存活的可能性。
[0009] MHC I類和II類HLA單元型是共同遺傳自親本的特定組的HLA-A、-B、-DR基因座 等位基因。盡管存在高度HLA多態(tài)性，但是在美國高加索人群中僅存在200個共有HLA單元 型。這種HLA多樣性與雜合選擇系數(shù)組合，意味著發(fā)現(xiàn)供體-受體匹配的機率范圍是一千 分之一至幾百萬分之一，其原因在于在雜合個體中由這些等位基因變體的組合提供的獨特 的組織類型。
[0010] 基于移植的干細胞治療面臨相同的HLA匹配問題，所述問題由于免疫排斥而限制 了實體器官同種異體移植。HLA-匹配干細胞系可克服免疫排斥的風險。對于單性生殖來源 的細胞，HLA雜合細胞系通過使用A23187和6-DMAP的組合激活卵母細胞而得自HLA雜合 供體。由于這些細胞與卵母細胞供體是HLA-匹配的，它們提供組織-匹配衍生物的能力受 到限制。
[0011] 如果供體細胞是HLA純合的，即，含有相同的每種抗原遞呈蛋白的等位基因，則供 體和受體之間的MHC相容性顯著增加。而且，如果純合供體細胞具有在群體中被高頻率發(fā) 現(xiàn)的單元型，則這些細胞在大量個體的基于移植的干細胞治療中可具有用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明公開從HLA純合和HLA雜合供體產(chǎn)生HLA純合單性生殖人干細胞 (hpSC-Hhom)系的方法。這些hpSC-Hhom系顯示人胚胎干細胞形態(tài)學，表達典型的干細胞標 記物（即，35￡六-3、55￡六-4、了狀-1-60、了狀-1-81以及0(：1'-4)并具有高水平的堿性磷酸酶和 端粒酶活性。另外，將這些細胞系注射到免疫缺陷動物中導致畸胎瘤形成。SNP數(shù)據(jù)分析表 明，源于HLA雜合卵母細胞供體的hpSC-Hhom系的整個基因組是純合的。所公開的方案將 源自動物組分的應用減到最少，其使這些干細胞理想地適合于臨床用途。
[0013] 在一個實施方式中，公開了源于單性生殖胚泡的分離的人干細胞系，其中構成該 細胞系的至少一個細胞對于一個或更多個單核苷酸多態(tài)性（SNPs)而言是雜合的，對于一 個或更多個HLA等位基因而言是純合的，或包括純合和雜合SNPs的組合。
[0014] -方面，至少一個細胞對于HLA等位基因而言是純合的。另一方面，至少一個細胞 在被移植到無免疫應答小鼠中時形成畸胎瘤。在進一步的方面，至少一個細胞與胚泡供體 是MHC相容的。
[0015] 在一個相關方面，至少一個細胞與胚泡供體的一級血親是MHC相容的，其包括至 少一個細胞按照供體來源被實質上遺傳印記。
[0016] 一方面，至少一個細胞（i)將在體外培養(yǎng)中增殖一年以上，（ii)在整個培養(yǎng)中保 持分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，以及（iii)當在成纖維細胞飼養(yǎng)層 上培養(yǎng)時被抑制分化。
[0017] 另一方面，至少一個細胞分化成下列細胞，包括：神經(jīng)元細胞、心臟細胞、平滑肌細 胞、橫紋肌細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞、以及少突膠質細胞、造血細胞、脂肪細胞、基質細胞、 軟骨細胞、星形膠質細胞、角化細胞、胰島細胞、淋巴前體細胞、肥大細胞、中胚層細胞以及 內(nèi)胚層細胞。在一個相關方面，至少一個細胞不具有形成存活生物體的能力。
[0018] 在另一個實施方式中，公開了治療需要該治療的對象的方法，其包括施用包括分 化細胞的細胞組合物，其中所述分化的細胞得自源于單性生殖胚泡的干細胞系，其中構成 所述細胞系的至少一個細胞對于一個或更多個單核苷酸多態(tài)性（SNPs)而言是雜合的，對 于一個或更多個HLA等位基因而言是純合的，或包括純合和雜合SNPs的組合。
[0019] 一方面，對象患有疾病，所述疾病包括：帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、阿爾茨海默氏 癥、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮癥、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、 黃斑變性、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管疾病、尿路疾病、AIDS以及癌癥。
[0020] 在一個實施方式中，公開了干細胞庫，其包括自體或同種異體（allogenic)干細 胞，其中所述干細胞源于來自一個或更多個人供體的單性生殖活化的卵母細胞，以及其中 所述干細胞是HLA純合干細胞。一方面，根據(jù)單核苷酸多態(tài)性（SNP)標記物，每個庫成員被 鑒定為全同胞、半同胞或不相關。另一方面，每個庫成員根據(jù)HLA-型進行表征，并且所述庫 成員與用于治療用途的潛在受體是HLA-匹配的。
[0021] 另一方面，卵母細胞供體與庫成員是組織相容的。在一個相關方面，庫成員根據(jù) 卵母細胞供體來源被基因組印記，其包括庫的干細胞可源于HLA雜合卵母細胞供體。在進 一步的方面，庫中的每個成員對于不同于其它庫成員的MHC/HLA等位基因組合而言是純合 的。
[0022] -方面，庫中的每個成員是至少一個或更多個HLA I類基因和HLA II類基因純合 的。在一個相關方面，HLA I類基因包括HLA A*、HLA B*、HLA以及Cw*單元型組合。在另 一個相關方面，HLA II 類基因包括 HLA DRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1* 以及 DQB1* 單 元型組合。
[0023] 在另一個實施方式中，公開了產(chǎn)生HLA純合干細胞的方法，其包括：篩選卵母細胞 供體，尋找在給定群體中常見的HLA-單元型；在體外受精（IVF)培養(yǎng)基中溫育人中期II卵 母細胞；在包括離子載體的IVF培養(yǎng)基中溫育細胞；在包括嘌呤霉素的IVF培養(yǎng)基中溫育 細胞；以及在新鮮的IVF培養(yǎng)基中溫育細胞，其中一個或更多個溫育在不同0 2張力下進行， 并且其中獲自細胞的內(nèi)細胞團（ICM)產(chǎn)生可培養(yǎng)的干細胞。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的示例性方法和組合物在下文更詳細地描述。
【附圖說明】
[0025] 圖1顯示phESC系的特征性特異性標記物。在人飼養(yǎng)層細胞上phESC的未分化集 落（A-F)，SSEA-1陰性染色（G-L)，細胞表面標記物SSEA-3(M-R)、SSEA-4(S-X)的表達。放 大倍數(shù)：(A)至（E) 100倍，（F) 200倍，（G)至（X) 400倍。在飼養(yǎng)細胞上phESC集落的堿性 磷酸酶陽性染色（A-F)、OCT-4 (G-L)、TRA-1-60 (K-R)和 TRA-1-81 (S-X)。放大倍數(shù)：(A、B、 0、R) 100 倍，（C-F、M、S、X) 200 倍，（G-L、N、P、Q、T-W) 400 倍。
[0026] 圖2顯示，phESC表明與陽性對照細胞相比高水平的端粒酶活性來自500個 細胞的提取物；熱處理的細胞提取物，端粒酶失活；"對照+"_端粒酶陽性細胞提取物 (應用TRAPEZE試劑盒）；"B" -CHAPS裂解緩沖液，引物-二聚體/PCR污染對照；TSR8-端 粒酶定量對照模板（〇.1和〇.2amole/ ill) ;"M"-標記，DNA梯形條帶。
[0027] 圖 3 顯示 phESC 系的 G-帶核型分析。phESC-1 (A)、phESC-3(B)、phESC-4 (C)、 phESC-5 (D)和 phESC-6 (E)系具有正常的 46, XX 核型。phESC-7 系具有 47, XXX 核型（F)。
[0028] 圖4顯示將phESC體外分化為所有三個胚層的衍生物。外胚層分化通過神經(jīng)元特 異性標記物神經(jīng)絲68 (A)、NCAM(B)、0 III微管蛋白（C)和神經(jīng)膠質細胞標記物GFAP (D，M) 的陽性免疫細胞化學染色來顯示。分化的細胞對于下列中胚層標記物是陽性的：肌肉特異 性a-輔肌動蛋白（G)和結蛋白（J)、內(nèi)皮標記物PECAM-l(E)和VE-鈣粘蛋白（F)。內(nèi)胚 層分化通過a-胎蛋白（H，L)陽性染色來顯示。phESC產(chǎn)生色素上皮-樣細胞（I，K)。放 大倍數(shù)：（I) 100 倍，（A-H，J-M) 400 倍。
[0029] 圖5顯示在SCID小鼠中phESC的體內(nèi)分化和畸胎瘤形成。對三個胚層的標記物 進行免疫熒光染色。中胚層細胞標記物肌肉肌動蛋白圍繞其它成分進行組織并且可清晰鑒 別（A)。纖維連接蛋白以較高量存在對于中胚層來源的結締組織具有特異性（B)。神經(jīng)分 化細胞（外胚層來源）區(qū)域是廣泛的并用0微管蛋白抗體進行強烈標記（C)。不成熟的 內(nèi)胚層細胞標記物a-胎蛋白可在腺體外觀的區(qū)域找到（D)。用DAPI對細胞核染色-(A)、 〇))。放大倍數(shù)：(A)、（C)、⑶，100 倍；(B) 200 倍。
[0030] 圖6顯示印記基因表達的RT-PCR分析。來自丟棄IVF胚胎的兩個hESC系hESl和 hES2用作在下列phESC系中父本表達的基因SNRPN和PEG1_2以及母本表達的基因TSSC5和 H19 的表達分析的陽性對照：phESC-1 ;phESC-3 ;phESC-4 ;phESC-5 ;phESC-6 和 phESC-7(分 別為1、3、4、5、6以及7)。PEG1_1基因是雙等位基因表達的并用作另外的對照。包括GAPDH 作為mRNA定量對照。RT-數(shù)據(jù)表明RT樣本沒有基因組污染。
[0031] 圖7顯示hpSC-Hhom系的特異性標記物特征。來自所有四種hpSC-Hhom系的細胞 表明SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT-4(用DAPI進行細胞核染色）、堿性磷酸酶 陽性染色，以及SSEA-1陰性染色。小鼠胚胎干細胞（ESC)用作SSAE-1染色的陽性對照。
[0032] 圖8顯示，hpSC-Hhom系表明與陽性對照細胞相比高水平的端粒酶活性： "K1+"-端粒酶陽性細胞提取物（應用TRAPEZE試劑盒）；"K2+"_來自500個細胞的提取 物；"K-"或熱處理的細胞提取物，端粒酶失活；Buf-CHAPS裂解緩沖液，引物-二聚體 /PCR污染對照；TSR-端粒酶定量對照模板（0.1和0.2amole/ ill) ;"M"_標記物，DNA梯形 條帶。
[0033] 圖9顯示人HLA純合單性生殖干細胞系的G-帶核型分析：hpSC-Hhom-1 (A)和 hpSC-Hhom-4(B)系具有正常的 46，XX 核型；hpSC-Hhom-2(C)系的 15%細胞具有 47，XX，+8 核型-染色體8的非整倍性；1^5(：-扭1〇111-3(0)系的4.2%細胞具有47，乂乂，+1核型-染色 體1的非整倍性。
[0034] 圖10顯示hpSC-Hhom-4體外分化成來自所有三個胚層的衍生物：外胚層分化是明 顯的，因為神經(jīng)元特異性標記物神經(jīng)絲68(A)和NCAM(B)是免疫細胞化學染色陽性的；內(nèi)胚 層分化是明顯的，因為a-胎蛋白（C)的染色是陽性的；分化的細胞是中胚層標記物肌肉特 異性結蛋白⑶和a -輔肌動蛋白（E)陽性的；放大倍數(shù)200倍（A-E)。
[0035] 圖11顯示hpSC-Hhom-4的體內(nèi)分化。SCID小鼠中的畸胎瘤形成。來自所有三個 胚層（外胚層、內(nèi)胚層和中胚層）的衍生物：由間充質細胞包繞的充分形成的呼吸型腺體， 蘇木精/伊紅（h/e)染色，放大倍數(shù)140倍（A);可能的具有單層細胞的神經(jīng)管，右側為內(nèi) 胚層腺體和底部為軟骨-分化，h/e染色，放大倍數(shù)70倍（B);由間充質細胞包繞的骨骼，中 心是具有立方上皮的管狀腺，picrofucsin染色，放大倍數(shù)140倍（C);充分形成的由間充質 細胞包繞的骨骼和脂肪組織，h/e染色，放大倍數(shù)140倍（D);左側是內(nèi)胚層腺體、中胚層和 脂肪組織、膠原，骨骼見于右側和底部，Kraberg染色，放大倍數(shù)70倍（E);由間充質細胞包 圍繞的內(nèi)胚層腺體結構，膠原纖維大量產(chǎn)生，Van Gieson染色，放大倍數(shù)280倍（F);復層上 皮，中心為角化過度的珠狀物（pearl)，左側為另一個腺體，h/e染色，放大倍數(shù)140倍（G); 腺體集落，h/e染色，放大倍數(shù)70倍（H);含有產(chǎn)生褐色色素--可能為膽汁色素--的細 胞的腺體，由脂肪組織和間充質細胞包繞，h/e染色，放大倍數(shù)140倍（I)。
【具體實施方式】
[0036] 在描述本發(fā)明的組合物、方法以及培養(yǎng)方法學之前，應理解的是，本發(fā)明不限于所 描述的具體組合物、方法以及實驗條件，因為這些組合物、方法以及條件可變化。還應理解 的是，本文所使用的術語目的僅在于描述【具體實施方式】，而不意圖進行限制，因為本發(fā)明的 范圍將僅由所附權利要求書來限制。
[0037] 如本說明書和所附權利要求書中所用，除非上下文另外明確指出，單數(shù)形式"一 (a) "，"一（an) "和"該（the) "包括復數(shù)指代物。因此，例如，提及"該方法"包括一種或更 多種方法，和/或本文描述類型的步驟，其在本領域技術人員閱讀本公開內(nèi)容等