用于人胚胎腎細(xì)胞高密度大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用透析血清高密度大規(guī)模懸浮培 養(yǎng)人胚胎腎細(xì)胞HEK293S GnH_的培養(yǎng)基及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人胚胎腎細(xì)胞HEK293S是一種適用于懸浮培養(yǎng)的理想哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而HEK293S GnlT細(xì)胞為N端修飾后的糖基均一化的293S細(xì)胞，首先由美國(guó)MIT科學(xué)家在2002年建立 起來的，其特點(diǎn)是所表達(dá)的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)構(gòu)象相對(duì)簡(jiǎn)單、單一，特別適用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)及新藥 開發(fā)等研究工作，例如：GPCRs的結(jié)構(gòu)解析及對(duì)應(yīng)的的藥物開發(fā)。
[0003] 目前，HEK293S GnlT細(xì)胞培養(yǎng)通常使用的基本培養(yǎng)基為DMEM(Dulbeccc^ s modified eagle medium),在添加胎牛血清后進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。然而，由于胎牛血清的組成 復(fù)雜，特別是它含有的各種氨基酸勢(shì)必造成培養(yǎng)基氨基酸組成含量的不確定以及濃度的稀 釋。因此，對(duì)需要明確氨基酸含量的蛋白樣品制備，則必須使用經(jīng)過透析后的血清，以保證 培養(yǎng)基氨基酸組成和含量的確定。但使用透析血清可造成細(xì)胞生長(zhǎng)密度低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等 問題，從而導(dǎo)致了最終的蛋白產(chǎn)量過低，難于滿足工作的需求。目前唯一的解決辦法就是增 大培養(yǎng)體積，但這勢(shì)必大大增加了培養(yǎng)成本。因此，通過提高細(xì)胞在透析血清生長(zhǎng)環(huán)境中的 生長(zhǎng)密度以增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從而達(dá)到降低成本就成了目前急迫需要解決的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，為人胚胎腎（HEK)293S Gnir細(xì)胞在透析血清培養(yǎng)環(huán)境中的 大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，提供一種能使人胚胎腎細(xì)胞高密度生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，即本發(fā)明提出了一種 用于人胚胎腎細(xì)胞高密度大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的確定組成的培養(yǎng)基，其組成成分包括氨基酸、 維生素、無機(jī)鹽和其他成分，各組成成分及相應(yīng)的含量包括如下：
[0005]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于人胚胎腎細(xì)胞高密度大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于，其組成成分 包括多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽和其他成分，所述組成成分及含量范圍如下： 所述氨基酸包括： L-ffiM酸 50-200 mg/L 1_-.1'.,暖￥酸 20-300 mg/L 3fM00mg/L L-11'??? 10-50 mg/L 酸 40-200 mg/L. L-4?? 酸 50-600mg/L 50-600 nig/L L-賴氣_ 90-I000tng/L L- Φ 硫 (酸 20-3 CM) mg/L L-笨?jī)?nèi)▼ ￥ _ 30-400 mg/L KWOOmgiL 50-300 mg/L L-GiMffi 10-200 mg/L L-酪氨ft 50-600 mg/L L?_M_ 50-300 mg/L 所述維生素包括： 泛酸側(cè) 2-8 rag/L M化Iliii 3-10 mg/L 葉酸 2-5 mg/L 肌醇 5-15 mg/L 煙酸靈 2-5 mg/L 維生素 B6 2-10 mg/L 維4:索 B2 0.1-0.5 mg/L 維 1·:索 BI 2-10 mg/L 所述無機(jī)鹽包括： CaCl2OH2O 20.6-30 mg/L Fc(N03X；?9 H2O 0.1-2 mg/L MgS04*7 H2O 150-300 mg/L KCl 300-500 mg/L NaCI 6400 mg/L NaH2P〇4*2 H2O _-200mg/L 檸朦f?鐵 5-15 mg/L NaF 2-10 mg/L FcS04*7H20 2-10 mg/L MgCi2^H2O 40-80 mg/L CuS〇4?5H20 0.001-0.0! mg/L Na2HPO4* 12H20 150-300 mg/L ZnS04?7H20 0.2-1.0 mg/L €#丨酸鈉 0.003-0.01 mg/L NaHCO3 3700 mg/L 所述其他成分包括： #1 萄糖 4500 mg/L 酸紅鈉 15 mg/L WS帽I 鈉 70-140 mg/L AlbuMAX 〖（Lipid-rich BSA) 300-600 mg/L GIutaMAX supplement 500-600 mg/L 50-60 mg/L Pluronic acid F-68 1000-2000 mg/L 〇-
2.如權(quán)利要求1中所述的培養(yǎng)基，其特征在于，其組成成分包括確定含量的多種氨基 酸、維生素、無機(jī)鹽和其他成分： L-精氨酸 84 mg/L L-率魏氨'酸 63 mg/L L-谷氨酸 88 mg/L L-酸 30 mg/L L-fR-M.?? 42 mg/L 1^汁*試酸 iOSmg/L 1--?? 酸 105 mg/L L-IIM酸 146 mg/L L-iFfttft 酸 30mg/L U#；lAiM酸 66 mg/L L-MMiI 42 mg/L L-蘇酸 95 mg/L L-色M酸 16 mg/L HSMflI 97 mg/L L-顯M酸 94 mg/L 所述維生素包括： 泛酸t(yī)s 4 mg/L M化IlH喊 4 mg/L H窗 4 mg/L MftV 7.2 mg/L 煙隱胺 4 mg/L 維 泰 B6 4 mg/L 維B2 0.4 mg/L 維4:? BI 4 mg/L 所述無機(jī)鹽包括： CaCl2OH2O 20,6 mg/L Fe(NO3)3^ H2O 0.1 mg/L MgS04*7 H2O 200 mg/L KCl 400 mg/L NaCl 6400 mg/L NaH2P〇4*2 H2O 142 mg/L 衧1蒙_鐵 6.1 mg/L NaF 4.2 mg/L FcS04*7H20 3.4 mg/L MgC]2*6H2〇 61 mg/L CuS〇4*5H2〇 0.001 mg/L Na2HPO4* 12H20 178.8 mg/L ZnS04*7H20 0.432 mg/L 0.005 mg/L NaHCCb 3700 mg/L 所述其他成分包括： 偏.糖 45 00 nig/ L 酚紅鈉 15 mg/L WiW梭鈉 110 mg/L AlbuM AX 1 400 mg/L GlulaMAX supplement 521,328 mg/L 肝崠鈉 50 mg/L Pluronic acid F-68 HMK) mg/ L,:
3. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，在細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，在所述培養(yǎng)基中進(jìn) 一步添加葡萄糖、ZnCl2、氨基酸的混合液。
4. 如權(quán)利要求1-3之任何一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1或 2所述的各組成成分溶解后在20-30°C下混合，調(diào)節(jié)所述混合液的PH值至7,然后，通過濾膜 無菌過濾后即可使用。
5. 如權(quán)利要求1-3之任何一項(xiàng)所述培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基用于在IkD 截留的透析后胎牛血清中的人胚胎腎細(xì)胞培養(yǎng)。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基的使用條件為：溫度37°C，CO2濃 度5%，相對(duì)濕度> 70%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于人胚胎腎細(xì)胞高密度大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其制備方法和用途，其包括多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽和其他等組成成分，促使HEK293S GnTl-細(xì)胞的高密度旺盛生長(zhǎng)，既降低樣品制備成本，又適用于制備含有昂貴標(biāo)記氨基酸的蛋白樣品，是極具有商業(yè)價(jià)值的真核細(xì)胞培養(yǎng)基。
【IPC分類】C12N5-073, C12N5-02
【公開號(hào)】CN104651297
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310582562
【發(fā)明人】趙欣, 曹勝魁
【申請(qǐng)人】華東師范大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2013年11月19日