一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域和環(huán)境保護領(lǐng)域，特別涉及一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的生物質(zhì)資源，由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素通過氫鍵和共價鍵等相互作用交織在一起，形成高度復(fù)雜的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，難以被微生物分解，從而降低了木質(zhì)纖維素資源的利用效率。為了加速木質(zhì)纖維素類資源的分解與利用，以崔宗均為代表的研宄團隊在不破壞微生物協(xié)同關(guān)系的情況下，采用長期限制性外淘汰法，篩選出多組具有穩(wěn)定木質(zhì)纖維素降解能力的復(fù)合菌，對于解決秸桿還田腐熟速度慢，推動木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的資源化利用研宄有積極作用。
[0003]有機氯酚作為一種重要的化工原料和工業(yè)環(huán)節(jié)的中間產(chǎn)物(如紡織、造紙、印染等)，被廣泛用于殺蟲劑、除草劑、防腐劑和染料中間體等，并通過噴施、揮發(fā)、泄露、排放和燃燒等途徑進入環(huán)境。為有效降解殘留于環(huán)境中的有機氯酚，陸光華等從活性污泥中篩選馴化得到一組具有降解4-氯酚、4-硝基苯酚和2，4，6-三氯酚的復(fù)合菌，在治理受酚類物質(zhì)污染的河道中有較好效果，并能與環(huán)境中的微生物有共代謝作用。
[0004]然而隨著科技發(fā)展，環(huán)境污染也越顯交錯復(fù)雜，作為終端污染產(chǎn)物的固體廢棄物，不僅包含了原料中難以降解的木質(zhì)纖維素，同時還富集了加工等過程中可能殘留的有機污染物，例如造紙污泥，不僅富含細(xì)小纖維、木質(zhì)素及其衍生物、糖類和鹽，還富集濃縮了制漿中殘余木素在氯化漂白過程中形成大量的有機氯化物。有機氯化物具有典型的“三致”特性(致畸、致癌、致突變)。將含有有機氯化物的污染物(如造紙污泥等)直接農(nóng)用將會給土壤和作物帶來外源有機污染，給生化處理系統(tǒng)的微生物帶來毒害。如何有效降解污染物中的有機氯酚，同時實現(xiàn)木質(zhì)纖維素和有機氯酚的高效轉(zhuǎn)化是提升富含木質(zhì)纖維素和有機氯酚類污染物(如造紙污泥等)資源化利用價值的關(guān)鍵，而篩選具有協(xié)同降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚功能的微生物菌種又成為解決前述問題的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，提供一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌的制備方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌的制備方法，包括如下步驟:
[0008](I)將濾紙和有機氯酚儲備液加入不滅菌的液體培養(yǎng)液中，加入蘑菇渣進行第一階段篩選馴化，在濾紙出現(xiàn)斷裂和碎化時進行下一代轉(zhuǎn)接，得到具有纖維素和有機氯酚降解能力的兩組復(fù)合菌?’每10mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加4g蘑菇渣；篩選第一階段培養(yǎng)液的添加量為150mL，每10mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加Ig濾紙；每150mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加50 μ L有機氯酚儲備液；篩選馴化過程中微生物的接種量為10% (V/V)，繼代培養(yǎng)馴化30-35代；
[0009](2)將步驟⑴中經(jīng)篩選馴化的具有纖維素和有機氯酚降解能力的兩組復(fù)合菌共混后轉(zhuǎn)接到含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液中進行第二階段篩選馴化，在水稻秸桿分解成絲狀時進行下一代轉(zhuǎn)接，得到具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚降解能力的復(fù)合菌OEMl ?’每10mL含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液添加0.5g水稻秸桿；篩選第二階段含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液的添加量為100mL，每10mL含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液添加50 μ L有機氯酚儲備液；篩選馴化過程中菌液的接種量為10% (V/V)，繼代培養(yǎng)馴化10-15代；
[0010]步驟(I)中，
[0011]所述的濾紙為市售定性濾紙，優(yōu)選裁剪成長寬為6cmX Icm ；
[0012]所述的有機氯酚儲備液為15% (W/V)的混合有機氯酚儲備液；
[0013]所述的有機氯酚優(yōu)選為鄰氯苯酚、2，4- 二氯酚和2，4，6-三氯酚，鄰氯苯酚、2, 4- 二氯酸和2，4, 6- 二氯酸的質(zhì)量比為1:1:1。
[0014]所述的不滅菌的液體培養(yǎng)液采用如下方法制備:取蛋白胨2.5g，Na2HPO4L 5g，KH2PO4L 5g，MgCl2.6H20 0.8g，CaCl2.2H20 0.8g，酵母膏 0.8g，微量元素 lmL/L，加蒸餾水定容至1000mL，搖勻，得到不滅菌的液體培養(yǎng)液；
[0015]所述的微量元素采用如下方法制備:取MnCl2.4H20 0.lg, CoCl2.6H20 0.17g，ZnCl20.10g，CaCl20.20g，H3BO40.019g，NiCl2.6H20 0.05g，Na2MoO4.2H200.020g，CuSO4.5H200.lg，加蒸餾水至1000mL，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性，得到微量元素。
[0016]所述的蘑菇渣為蘑菇培植后遺棄的生長基質(zhì)，將蘑菇渣作為木質(zhì)纖維素和有機氯酚降解的初始菌種來源添加到篩選體系中；
[0017]所述的蘑菇為平菇、杏鮑菇或草菇中的至少一種。
[0018]步驟⑵中，
[0019]所述的水稻秸桿優(yōu)選采用如下方法進行處理:將水稻秸桿用I %氫氧化鈉溶液浸泡I天后，用自來水沖洗至中性，烘干，剪成0.3-0.5cm長。
[0020]一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚降解能力的復(fù)合菌0EM1，由上述制備方法得到。
[0021]所述的具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚降解能力的復(fù)合菌OEMl以30%的甘油保存，置于-80°C冰箱保存。
[0022]所述的復(fù)合菌OEMl可以應(yīng)用于降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚。
[0023]優(yōu)選的，所述的復(fù)合菌OEMl應(yīng)用于降解含有0.5-4.0 %木質(zhì)纖維素和50_75mg/L有機氯酚的底物。
[0024]所述的降解的條件優(yōu)選為于28°C、120r/min、降解12d。
[0025]所述的復(fù)合菌OEMl應(yīng)用于降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚時，活化兩代，降解時復(fù)合菌OEMl的接種量為10% (V/V)。
[0026]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0027](I)本發(fā)明以木質(zhì)纖維素和有機氯酚為目標(biāo)降解底物，蘑菇渣為菌種來源，篩選構(gòu)建出了一組在常溫好氧條件下具有高效降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚功能的復(fù)合菌0EM1，并通過降解水稻秸桿和有機氯酚試驗，驗證該復(fù)合菌的降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚的效能及功能穩(wěn)定性。
[0028](2)本發(fā)明針對目前工業(yè)固體廢物(如造紙污泥等)不僅包含了生產(chǎn)原料中剩余的難降解的木質(zhì)纖維素，同時還富集了加工等過程中可能殘留的有機氯化物，如何高效降解固體廢棄物中殘留的木質(zhì)纖維素和有機氯化物成為其資源化利用的關(guān)鍵。該發(fā)明提供了解決富含木質(zhì)纖維素和有機氯化物環(huán)境污染及其實現(xiàn)資源化利用關(guān)鍵問題的途徑，實現(xiàn)了木質(zhì)纖維素和有機氯化物高效協(xié)同降解，具有開發(fā)新的木質(zhì)纖維素和有機氯化物高效降解復(fù)合菌資源、促進微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展、防止含有木質(zhì)纖維素或有機氯化物的工業(yè)廢棄物如造紙污泥的環(huán)境污染及提高其資源化利用率的重要意義。
[0029](3)本發(fā)明的篩選流程簡單，可操作性強；得到的復(fù)合菌OEMl組成及性質(zhì)穩(wěn)定，可以高效降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，同時有效降解有機氯酚。
【附圖說明】
[0030]圖1為實施例2的復(fù)合菌OEMl對水稻秸桿的降解結(jié)果；
[0031]圖2為實施例2的復(fù)合菌OEMl對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解結(jié)果；
[0032]圖3為實施例2的復(fù)合菌OEMl對有機氯酚的降解結(jié)果；
[0033]圖4為實施例2的復(fù)合菌OEMl降解木質(zhì)纖維素和有機氯酚過程中pH值變化結(jié)果。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0035]實施例1
[0036]一種具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚協(xié)同降解功能的復(fù)合菌的制備方法，包括如下步驟:
[0037](I)將濾紙和有機氯酚儲備液加入不滅菌的液體培養(yǎng)液中，加入蘑菇渣進行第一階段篩選馴化，在濾紙出現(xiàn)明顯斷裂和碎化時進行下一代轉(zhuǎn)接，得到具有纖維素和有機氯酚降解能力的兩組復(fù)合菌?’每10mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加4g蘑菇渣；篩選第一階段不滅菌的液體培養(yǎng)液的添加量為150mL，每10mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加Ig濾紙；每150mL不滅菌的液體培養(yǎng)液添加50 μ L有機氯酚儲備液；篩選馴化過程中微生物的接種量為10%(V/V)，繼代培養(yǎng)馴化30-35代；
[0038](2)將步驟⑴中經(jīng)篩選馴化的具有纖維素和有機氯酚降解能力的兩組復(fù)合菌共混后轉(zhuǎn)接到含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液中進行第二階段篩選馴化，在水稻秸桿分解成絲狀時進行下一代轉(zhuǎn)接，得到具有木質(zhì)纖維素和有機氯酚降解能力的復(fù)合菌OEMl ?’每10mL含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液添加0.5g水稻秸桿；篩選第二階段含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液的添加量為100mL，每10mL含有水稻秸桿和有機氯酚的不滅菌的液體培養(yǎng)液添加50 μ L有機氯酚儲備液；篩選馴化過程中菌液的接種量為10% (V/V)，繼代培養(yǎng)馴化10-15代；
[0039]步驟(I)中，
[0040]所述的濾紙為市售定