工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間 體中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑藥物， 是目前臨床上應(yīng)用廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲基-3， 5-二羥基戊酸的反應(yīng)是膽固醇的生物合成途徑，他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶的 合成，可抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)水平，對(duì)以膽固醇升 高為主的高血脂癥和冠心病有較好的療效。在結(jié)構(gòu)上，他汀類藥物通常由憎水性的剛性 平面結(jié)構(gòu)母核和具有雙手性中心的（3R，5S/R)_雙羥基己酸酯組成。其中，阿托伐他汀 (Atorvastatin)和瑞舒伐他?。≧osuvastatin)是全新第三代、全合成、高純化、高選擇性 的HMG-CoA還原酶抑制劑，多年來占據(jù)降血脂藥物的主要市場份額。合成阿托伐他汀的關(guān) 鍵手性中間體是（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯和（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰 基己酸叔丁酯。（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯是一個(gè)擁有兩個(gè)手性中心的化合 物，可以通過（3R，5S)-6-氯_3,5,二羥基己酸叔丁酯脫鹵上氰基得到，（R)-6-氰基-5-羥 基-3-羰基己酸叔丁酯同樣也可以通過（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的脫鹵上 氰基得到。因此，開展對(duì)鹵代醇脫鹵酶的脫鹵上氰基的作用的研宄，對(duì)兩種他汀類藥物的制 備均具有十分重要的作用。
[0003] 目前，報(bào)道的制備（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯的方法主要有兩種， 一種為化學(xué)酶法，即先采用鹵代醇脫鹵酶或者腈水解酶得到4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，再 通過克萊森反應(yīng)與醋酸叔丁酯縮合加長碳鏈來合成6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁 酯，最后通過羰基還原酶的作用得到6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯。另一種是兩酶三 步法，有兩條路線，其一為以6-氯-3, 5-二羰基己酸叔丁酯為底物，通過一種羰基還原酶不 對(duì)稱還原作用直接生成（S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，再與NaCN作用生成6-氰 基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，最后在羰基還原酶的作用下生成6-氰基-3, 5-二羥基己 酸叔丁酯；另一條同樣以6-氯-3, 5-二羰基己酸叔丁酯為底物，通過一種羰基還原酶不對(duì) 稱還原作用直接生成（S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，再在羰基還原酶的作用下生 成6-氯-3, 5-二羥基己酸叔丁酯，最后在鹵代醇脫鹵酶的作用下生成6-氰基-3, 5-二羥 基己酸叔丁酯。
[0004] 報(bào)道的制備（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有三種，兩種 為化學(xué)酶法，其中之一是由美國Codexis公司開發(fā)出來，采用兩步三酶[游離酶]全生物 催化法合成4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，另外一種是腈水解酶的不對(duì)稱水解4-氰基-3-羥 基丁酸按得到4-氰基-3-羥基丁酸乙醋，由法國的Diversa Corporation研發(fā)，兩者再通 過克萊森反應(yīng)與醋酸叔丁酯縮合加長碳鏈來合成（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁 酯，這過程中需要鋰催化劑和無水無氧反應(yīng)，反應(yīng)條件較為苛刻；另一種是一步化學(xué)法，以 (S) -6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，與NaCN在堿性條件下反應(yīng)生成（R) -6-氰 基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，但底物和產(chǎn)物在強(qiáng)堿性的反應(yīng)條件下通常是不穩(wěn)定的。 [0005] 酶法與化學(xué)法相比反應(yīng)溫和，費(fèi)用相對(duì)低，過程更綠色化，區(qū)域和立體選擇性好， 是優(yōu)先選擇的路線，更值得深入研宄。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種工程菌，包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 為堿基序列如SEQ ID NO. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物制 備（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的工程菌在以（3R，5S) -6-氯-3, 5-二羥基己酸叔丁酯為底物制 備（3R，5R) -6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
4. 一種制備方法，其特征在于，包括： (1) 制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因的工程菌； (2) 制備所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液； (3) 將靜息細(xì)胞懸液與底物、氰化物混合，反應(yīng)制得產(chǎn)物； 所述底物為（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯或（3R，5S)-6-氯-3, 5-二羥基己 酸叔丁酯；所述產(chǎn)物為（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯或（3R，5R)-6-氰基-3， 5-二羥基己酸叔丁酯。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)的溫度為18~40°C，反應(yīng)液 的pH值為7.0~9.0。
6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述靜息細(xì)胞懸液的制備方法包括：將 所述工程菌活化后，擴(kuò)大培養(yǎng)至〇D_達(dá)到0. 6~1. 2,加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)，離心收集細(xì) 胞，用緩沖液重懸，獲得靜息細(xì)胞懸液。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑為IPTG ;誘導(dǎo)劑的濃度為 0· 1 ~0· 5mM〇
8. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為HEPES緩沖液。
9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液在反應(yīng)液中的濃度為1~ IOOmM0
10. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述氰化物為NaCN。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程菌及其在制備阿托伐他汀藥物中間體中應(yīng)用，該工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的目的基因，所述目的基因?yàn)閴A基序列如SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。本發(fā)明將SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞構(gòu)建的工程菌可表達(dá)鹵代醇脫鹵酶HheA，通過該酶的催化作用可實(shí)現(xiàn)將(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯和(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯催化成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯。該反應(yīng)條件溫和，操作簡便，提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和純度。
【IPC分類】C12R1-19, C12P13-00, C12N15-70, C12N1-21
【公開號(hào)】CN104651290
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066577
【發(fā)明人】楊立榮, 王金玉, 陳少云, 吳堅(jiān)平, 徐剛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日