專利名稱：分離的純合干細胞,由其衍生的分化細胞,以及制備和使用上述細胞的材料和方法
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明公開了多能純合干(HS)細胞及制備所述細胞的材料和方法。本發(fā)明還提供用于使HS細胞分化成祖細胞或其他所需細胞、細胞群或組織的方法。此外，在此公開的HS細胞可用于診斷和治療多種疾病，例如，遺傳疾病，神經(jīng)變性疾病，內(nèi)分泌相關(guān)的紊亂和癌癥，創(chuàng)傷，并可用于美容和治療性移植，以及基因治療和細胞替代治療。
II.發(fā)明背景及現(xiàn)有技術(shù)的描述1981年，Evans和Kaufman描述了從小鼠胚泡分離胚胎干(ES)細胞系的技術(shù)?！癊stablishmentin Culture of pluripotent CEllsfror Mouse Embryos，″Nature 292154-6(1981)。在這一過程中，使用內(nèi)細胞團(ICM)產(chǎn)生保持未分化和多能的細胞系，即能發(fā)育成任意細胞類型的細胞。隨后在其他動物模型包括雞(Pain等，Development1222339-48(1996))，倉鼠(Doetschmann等，Dev.Biol.127224-7(1988))，豬(Wheeler等，Reprod.Fertil.Dev.6563-8(1994))，狨猴(Thompson等，Biol.Reprod.55254-9(1996))，及恒河猴(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844-8(1995))中生產(chǎn)出了ES細胞系。
Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)報道了牛胚胎干細胞樣細胞系，其可存活三代，但在第四代后失去。另外，Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)公開了在允許分離由小鼠內(nèi)細胞團(″ICM″)衍生的小鼠ES細胞系的條件下，對免疫外科分離的綿羊胚胎內(nèi)細胞團的培養(yǎng)。其進一步報道，在這種條件下綿羊ICM附著、擴散并發(fā)育成ES細胞樣和內(nèi)胚層樣細胞區(qū)域，但延長培養(yǎng)后僅內(nèi)胚層樣細胞可見。同前。
早先已確證，在體內(nèi)將ES細胞注射到小鼠胚泡中后，其摻入受體胚胎的ICM中并發(fā)育成多種不同的組織類型，包括生殖細胞系。Stewart等，″Stem Cells from Prifaordial Germ Cells Can Reenterthe Germ Line，″Dev.Biol.161626-8(1984)。還可參見Bradley等，Nature 309255-256(1984)。
最近，Cherny等，Theriogenology，41175(1994)報道了在長期培養(yǎng)下保持的多能牛原始生殖細胞衍生的細胞系。在培養(yǎng)了約7天后，所述細胞產(chǎn)生出堿性磷酸酶(AP)染色陽性的ES樣集落，表現(xiàn)出形成胚胎體的能力，并自發(fā)地分化為至少兩種不同的細胞類型。還有報道稱這些細胞表達轉(zhuǎn)錄因子OCT4，OCT6和HES 1的mRNA。
Campbell等，Theriogenology，43181(1995)(摘要)報道了從經(jīng)培養(yǎng)的來自第9天的綿羊胚胎的胚盤(ED)細胞通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生活的小羊，其是在促進小鼠ES細胞系分離的條件下培養(yǎng)的。基于上述結(jié)果，作者得出了下述結(jié)論，即由第9天的綿羊胚胎分離的ED細胞經(jīng)核轉(zhuǎn)移后是全能的，且這種全能性可在培養(yǎng)過程中保持多達3代。Campbell等，Nature，38064-68(1996)進一步報道了由經(jīng)培養(yǎng)的細胞系通過核轉(zhuǎn)移進行的綿羊克隆。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)，報道了對來自牛胚泡ICM細胞的所謂永久細胞系的分離和表征。作者在不同條件下分離并培養(yǎng)了來自8或9天的牛胚泡的ICM以確定哪種飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)基對支持牛ICM細胞的附著和生長最有效。他們認定，基于他們所獲得的結(jié)果，培養(yǎng)的ICM細胞的附著和生長可通過使用STO(小鼠成纖維細胞)飼養(yǎng)細胞(而非牛子宮上皮細胞)和炭萃取的血清(而非正常血清)添加到培養(yǎng)基中得以有效地增強。Van Stekelenburg等報道，與多能ICM細胞相比他們的細胞系更類似于上皮細胞，同前。
Smith等，1994年10月27日公開的WO 94/24274，Evans等1990年4月5日公開的WO 90/03432和Wheeler等1994年11月24日公開的WO 94/26889報道了據(jù)稱可能在獲得轉(zhuǎn)基因動物中使用的動物干細胞的分離、篩選和繁殖。此外，Evans等，1990年4月5日公開的WO 90/03432，報道了來自豬和牛的所謂多能胚胎干細胞衍生以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。而且，Wheeler等，1994年11月24日公開的WO 94/26884公開用于產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)基因有蹄動物的胚胎干細胞。
也有有關(guān)使用有蹄動物ICM細胞進行核移植的報道。例如，Collas等，Mol.Rep rod.Dev.，38264-267(1994)公開了一種將裂解的供體細胞微注射到去核成熟卵母細胞中的牛ICM核移植技術(shù)。該文獻公開了，將胚胎在體外培養(yǎng)7天以產(chǎn)生15個胚泡，將其轉(zhuǎn)入牛受體中導致4例受孕2例分娩。另外，Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994)，公開了用牛ICM作為核轉(zhuǎn)移過程中的供體核以產(chǎn)生胚泡，將其移植到牛受體中后產(chǎn)生了多例活的子代。再有，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)公開了將短期體外培養(yǎng)的牛ICM細胞的核轉(zhuǎn)移到去核成熟卵母細胞來產(chǎn)生小牛。
也有關(guān)于通過短期培養(yǎng)的胚盤細胞(多達三代)的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生活的小羊的報道。(Campbell等，Theriogenology，43181(1995))。另外也有報道將牛多能胚胎細胞用于核轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生嵌合胎(Stice等，Theriogenology，41301(1994))。
最近，Cibelli等，轉(zhuǎn)讓于Advanced Cell Technology的2001年4月26日公開的WO 01/29206，公開了使分離自胚泡內(nèi)細胞團的哺乳動物，包括人的ES細胞分化以產(chǎn)生同基因的、異基因的和/或異種移植細胞或器官的方法。但是，其所公開的由受精胚胎建立的干細胞不同于本發(fā)明。而且ACT的研究人員由未受精胚胎建立干細胞系的努力失敗了，參見2001年11月26日出版的華盛頓郵報，″First HumanEmbryos Are Cloned in US″。
基于上文，顯然許多研究組都已試圖制造ES細胞系。ES細胞受到關(guān)注主要是由于ES細胞是多能的，并能產(chǎn)生成熟的、分化的和功能性的細胞。ES細胞除有希望的治療前景和預防應用外，對ES細胞的使用也引發(fā)了許多有關(guān)倫理的問題。如前所述ES細胞來自卵母細胞受精后產(chǎn)生的胚泡。因此，ES細胞天然地來源于或收獲于可能存活的胚胎，而所建立的胚胎將被特意破壞。
而且還存在與ES細胞的使用或發(fā)育相關(guān)的技術(shù)問題。例如，來自其他個體的ES細胞，如，當前存在的細胞系，移植到不相容的受體中將引起免疫反應，由體細胞核轉(zhuǎn)移衍生的ES細胞系作為治療用途不甚理想，這是由于在核供體一生中所需的遺傳突變將帶入到所述多能細胞系中。
但是，由于包括ES細胞的多能細胞具有治療性用途，可用以治療遺傳疾病，神經(jīng)變性疾病和癌癥，例如修復或復原受損神經(jīng)功能，或作為替代組織或器官的來源，因此非常有用。鑒于多能細胞具有產(chǎn)生種系嵌合體或?qū)⑵浠蚪M傳遞到下一世代的能力，還可將其用于發(fā)育生物學和移植療法研究。
本領(lǐng)域需要開發(fā)其他來源的多能細胞。本發(fā)明即提供了一種這樣的來源。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了由通過下述步驟產(chǎn)生的胚泡樣團分離的純合干(HS)細胞(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；(b)在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；(c)在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的基因組自我復制；或，(d)將兩個單倍體卵或精子核轉(zhuǎn)入去核卵母細胞?；蛘撸褂梅椒?a)或(d)時利用基因型分析篩選純合干細胞。
本發(fā)明的HS細胞是多能的，并且由于它們是從未受精的且不能發(fā)育成存活胚胎的細胞團分離的，所以不涉及倫理問題。此外，當雜合ES細胞系應用于組織或細胞移植治療、或者在文庫和/或保藏中心中保存時很難實現(xiàn)免疫組織相容性匹配。這是因為所述的ES細胞系，包括由Advanced Cell Technology或其他組織開發(fā)的細胞系都是來自于受精的胚胎或通過核轉(zhuǎn)移技術(shù)利用成人的已分化細胞獲得的，都是基因組雜合的。由于本發(fā)明的多能干細胞是純合的(極低的雜合性或均一的純合性)，這種細胞可用于克服目前應用ES細胞系的移植、細胞替換，和基因治療技術(shù)，或維持ES細胞系和/或保藏物中所遇到的免疫組織相容性問題。
在配子形成過程中，雜合的生殖細胞，即帶有父本和母本染色體的生殖細胞進行減數(shù)分裂。在第一次減數(shù)分裂(減數(shù)分裂I)中，同源染色體分離，形成兩個含有父本或母本的染色體的雜合子細胞，由于交換現(xiàn)象的存在向子細胞中引入了一定程度的雜合性。并且，在卵子發(fā)生過程中，觀察到一個子細胞(第一極體)的擠出。另一個子細胞在中期II停頓。這種中期II二倍體卵母細胞可用于衍生帶有極低雜合性的純合干細胞。
適當?shù)募せ詈?，中期II卵母細胞可通過擠出染色單體(即所謂第二極體)之一而繼續(xù)完成減數(shù)分裂，并產(chǎn)生單倍體細胞。這種減數(shù)分裂完成后的單倍體卵母細胞可在無胞質(zhì)分裂下自我復制形成二倍體并且均一地純合。因此，這些完成了減數(shù)分裂的單倍體卵母細胞可用于構(gòu)建本發(fā)明的無雜合性的純合干細胞。參見Kaufman M.H.，RobertsonE.J.，Handyside A.H.，Evans M.J.，″Establishment ofpiuripotential cell lines from haploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol.，73249-61(1983)。
帶有極低雜合性的及均一純合的HS細胞均優(yōu)于雜合ES細胞(如來源于受精胚胎胚，治療性克隆胚胎和成人干細胞的)，其中純合干細胞可包含兩套相同的主要組織相容性復合體(MHC)單倍型。因此，易于利用ES細胞實現(xiàn)供體和需要移植治療的個體間的免疫組織相容性匹配。這種對于一個MHC單倍型純合的干細胞不僅可被帶有相同單倍型的受體所耐受，也可被任一親本單倍型帶有相同MHC成分的受體所耐受。
而且，人MHC基因座在6號染色體上4Mb內(nèi)，并且MHC等位基因通常全部一起遺傳。一些MHC等位基因組合在人群中以相當高的頻率共有，例如21.3％白種美國人共有15種最常見的HLA-A，-B，-DR單倍型，在其他的種族背景下也觀察到類似的單倍型頻率Mori，M.，等，″HLA gene and haplotype frequeizcies in the North Americanpopulationthe National Marrow Donor Program DonorRegistry，″Transplantation，64(7)1017-27(1997)?？紤]到這種現(xiàn)象支持這種連鎖不均衡，利用未受精的減數(shù)分裂I后的二倍體配子衍生的HS細胞可減少需要在干細胞庫或組織或細胞移植物保藏庫中維持的免疫差異細胞系的數(shù)量。
因此，可能僅幾百個對于不同單倍型為純合的干細胞系即足以與所述人群中的大部分相匹配。這一數(shù)量與維持由胚胎干細胞，成人干細胞，或治療性克隆干細胞衍生的干細胞庫或保藏庫所需的單倍型數(shù)量相比要少得多。例如，每200個單倍型即存在20,000多種雜合的可能性。
由此，在本發(fā)明的一個實施方案中提供了對于MHC基因座和一個野生型(正常的)基因為純合的干細胞，其可由與受體相關(guān)的雌性供體的未受精的卵母細胞衍生而來，該干細胞用以治療遺傳性疾病，如血友病，糖尿病，亨廷頓氏舞蹈病等。從本發(fā)明的HS細胞中排除異常(引起疾病的)等位基因的優(yōu)越性并不能由目前可得的ES細胞系實現(xiàn)。
畸胎瘤屬良性腫瘤，由多種組織元件組成，提示是三個胚層中的任意一層的正常衍生物。天然發(fā)現(xiàn)的畸胎瘤來源于二倍體全能細胞，典型的是未受精的生殖細胞，這種生殖細胞具有分化成代表三個胚層一外胚層，中胚層，和內(nèi)胚層中任意一層的元件的能力。有關(guān)畸胎瘤起源的科學理論包括不完全對裂(twinning)，隱蔽的全能裂球或原生殖細胞的瘤形成性增殖，體細胞核中的全能種屬信息脫抑制和生殖細胞的孤雌生殖發(fā)育。
天然存在的自發(fā)畸胎瘤是二倍體，偶爾呈多倍體(Surti等，Am.J.Hum.Gene.47635-643(1990))。據(jù)認為，二倍體畸胎瘤組織出現(xiàn)在減數(shù)分裂I后，或由于第二極體與卵融合而發(fā)生(Eppig和Eicher，Genetics，103797-812(1983)；Eppig和Eicher，J.Hered.，79425-429(1988))。另外，已證明畸胎瘤在雜合宿主中通常是純合的(Linder，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63699-704(1969)；Linder和Power，Ann.Hum.Genet.3421-30，(1970)；Linder等，Nature，254597-598(1975)；Kaiser-McCaw等，Cytogenet.Cell.Genet.，16391-395(1975))。但后續(xù)研究中未能持續(xù)再現(xiàn)所述結(jié)果(Surti等，Am.J.Hum.Gene.，47635-643(1990)；Carritt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797400-7404(1982)；Parrington等，J.Med.Genet.，211-12(1984)；Deka等，Am.J.Hum.Genet.，47644-655(1990)；Dahl等，Cancer Genet.Cytogenet.，46115-123(1990))。
與其他腫瘤相比，畸胎瘤表現(xiàn)出獨特的組織學特征。它們由多種分化組織組成，包括如表皮，中樞神經(jīng)組織或成熟的軟骨等組織。它們也包含非特異的組織類型，如淋巴組織或纖維基質(zhì)。″干質(zhì)(干質(zhì))″是新派生出的術(shù)語，用以描述HS細胞移植到宿主時發(fā)育成的團。與畸胎瘤不同，盡管干質(zhì)包含來自三個胚層的細胞，但表現(xiàn)為受控生長。由此，可將其用作本發(fā)明的HS細胞在體內(nèi)分化的工具。
顯然本領(lǐng)域需要能定向分化的干細胞的可靠來源。本發(fā)明通過提供無需受精過程的純合干細胞來滿足這一要求。本發(fā)明公開了由未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞衍生的純合干(HS)細胞。利用本領(lǐng)域常用的體外受精技術(shù)，從個體供體中收獲的供體細胞可以被誘導形成胚泡樣團，由此可衍生出本發(fā)明的HS細胞，這種HS可分化成任何細胞類型，細胞群或組織類型。進而，接下來用HS-衍生的分化細胞和/或組織可進行診斷和治療，特別是細胞替代治療和基因治療，以及用于美容和/或治療性移植。而且，所述的用途僅是示例性的并非窮舉。
III發(fā)明簡述本發(fā)明涉及制備分離的純合干(HS)細胞，并發(fā)現(xiàn)這些細胞具有以定向和可預測的方式進行分化的獨特的性質(zhì)。以此方式，HS模擬ES細胞，但無需受精過程或獲取胚胎組織。
本發(fā)明的一個目的在于提供新的改進的制備分離純合干細胞的方法，所得的干細胞可用作細胞治療和產(chǎn)生移植用細胞，細胞團，組織和器官的來源。
本發(fā)明的一個目的在于提供分離的純合干(HS)細胞。本發(fā)明進一步的目的是提供由動物供體物質(zhì)衍生的HS細胞，所述的動物包括下述種哺乳動物，鳥，魚，兩棲動物和爬行動物。在一個優(yōu)選的實施方案中所述的動物是哺乳動物，更優(yōu)選人。由從供體回收的未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞衍生HS細胞，其中可利用現(xiàn)有的或未來開發(fā)的體外受精技術(shù)獲得供體細胞。
本發(fā)明的另一個目的在于提供由通過下述步驟產(chǎn)生的胚泡樣團分離的純合干(HS)細胞(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；(b)在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；(c)在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的基因組自我復制；或，(d)將兩個單倍體卵或精子核轉(zhuǎn)入去核卵母細胞?；蛘撸褂梅椒?a)或(d)時利用基因型分析篩選純合干細胞。
本發(fā)明的又一目的在于提供由未受精的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞衍生純合干細胞的方法。優(yōu)選地，通過下述方法衍生HS細胞，即在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出，或在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和所述單倍體卵母細胞的自發(fā)基因組自我復制，從而產(chǎn)生胚泡樣團，再從所述胚泡樣團中提取HS細胞。
通過激活未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞構(gòu)建的HS細胞在移植到活的動物后形成干質(zhì)。本發(fā)明的另一個目的是從所述的干質(zhì)中在不同發(fā)育階段分離HS細胞。本發(fā)明的又一目的在于提供由所述的干質(zhì)中篩選待分離的細胞的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種構(gòu)建所需細胞、細胞群或組織的方法，該方法包括在適當?shù)臈l件下指導上述分離的HS細胞分化以便形成所需的細胞、細胞群或組織。本發(fā)明進一步的目的在于提供由HS細胞分化的細胞，并利用所述細胞進行治療和/或診斷。舉例來說，所述的組織包括但不限于上皮組織，結(jié)締組織，肌肉組織或神經(jīng)組織。
舉例來說上皮細胞的類型包括但不限于角質(zhì)化上皮細胞；濕復層屏障上皮細胞；內(nèi)襯上皮細胞；外分泌上皮細胞；內(nèi)分泌上皮細胞；胞外基質(zhì)分泌上皮細胞；吸收性上皮細胞，例如腸，外分泌腺和泌尿生殖道的上皮細胞；和收縮性上皮細胞。舉例來說，結(jié)締組織細胞包括但不限于胞外基質(zhì)分泌細胞；為代謝和貯存特化的細胞；及血液和免疫系統(tǒng)循環(huán)的細胞。舉例來說，肌細胞包括但不限于收縮細胞和具有推進功能的纖毛細胞。舉例來說，神經(jīng)或感覺細胞包括但不限于a)感覺傳導器；b)自主神經(jīng)元；c)感覺器官的支持細胞；和d)周圍神經(jīng)元，及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。舉例來說，生殖細胞類型包括但不限于生殖細胞和撫育細胞。
本發(fā)明更具體的目的在于提供誘導由HS細胞衍生的細胞分化成多能祖細胞的新方法，所述的祖細胞可用作診斷、治療，例如細胞治療、基因治療的細胞來源，以及產(chǎn)生用于移植的細胞、細胞團、組織和器官的細胞。這些用途僅是示例性的，并非窮例。
本發(fā)明的一個目的在于提供改進的方法以產(chǎn)生由HS細胞衍生的遺傳工程化的祖細胞，所述的祖細胞可用作診斷、治療，例如細胞治療、基因治療的細胞來源，以及產(chǎn)生用于移植的細胞、細胞團、組織和器官的細胞。這些用途僅是示例性的，并非窮例。在一個優(yōu)選的實施方案中，在被導致進一步分化成祖細胞的HS細胞中可將所需基因插入、去除或修飾。在進一步的實施方案中，可使祖細胞自身發(fā)生遺傳改變并進一步培養(yǎng)以產(chǎn)生遺傳改變的祖細胞集落。
本發(fā)明的又一目的在于提供由HS細胞衍生的祖細胞，優(yōu)選人祖細胞。在一個實施方案中，這些祖細胞被誘導分化成細胞、細胞群、組織和/或器官。另外，本發(fā)明的目的還在于利用這些祖細胞培養(yǎng)治療和/或診斷用的分化細胞和/或組織。
本發(fā)明的一個特定的目的在于提供治療或診斷疾病的祖細胞，優(yōu)選人祖細胞，在所述疾病中，細胞、組織或器官移植，基因治療和/或細胞治療對治療或診斷有益。本發(fā)明的HS細胞、祖細胞和/或分化細胞可在種內(nèi)應用也可在種間應用。
本發(fā)明的HS和祖細胞，以及進一步分化的HS和祖細胞可由相同、相關(guān)或不相關(guān)的哺乳動物，優(yōu)選人的卵細胞或精子構(gòu)建。
本發(fā)明的另一特定的目的在于將依照本發(fā)明在體內(nèi)或體外產(chǎn)生的分化細胞用于細胞分化研究和試驗目的，例如用于藥物研究。
本發(fā)明的又一目的在于提供疾病狀態(tài)模型，用于利用由分離的HS細胞產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾的HS細胞、細胞群、組織或器官研究或診斷疾病。
本發(fā)明的另一目的在于通過原位或體外制備適當?shù)膩碜杂诜蛛x的HS細胞的替代細胞、細胞群或組織或器官來治療失調(diào)或疾病的方法。舉例來說，所述的失調(diào)或疾病包括但不限于創(chuàng)傷(如，創(chuàng)傷后修復和重建，肢體替換，脊髓損傷，燒傷等)和先天缺陷；細胞、組織和器官的病理和惡性狀況(如癌癥)；以及下列細胞和組織的退化或先天疾病，即肌肉(如肌肉萎縮，心臟病)，神經(jīng)(阿爾茨海默病，帕金森氏病和多發(fā)性硬化等)，上皮(如失明，肌病，動脈粥樣硬化和其他血管狹窄疾病，酶缺陷癥，如克隆氏病，和激素缺乏癥，如糖尿病)和結(jié)締組織(如免疫疾病和貧血癥)。HS衍生的細胞和組織可轉(zhuǎn)移或移植到所需受試者，優(yōu)選利用受試者自身的供體材料。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種改進的診斷和移植、基因和/或細胞替代治療的方法，該方法包括使用本發(fā)明制備的分化細胞產(chǎn)生的同基因的或同源的細胞，組織或器官的步驟。舉例來說，所述的治療包括對下述疾病和損傷的治療，即帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈病，阿爾茨海默病，ALS，脊髓損傷，多發(fā)性硬化，肌肉萎縮，糖尿病，肝病，心臟病，軟骨置換，燒傷，血管疾病，泌尿道疾病，以及免疫缺陷癥，癌癥的治療和骨髓移植。
這些以及進一步的目的在下述的發(fā)明詳述，實施例和權(quán)利要求部分予以充分描述。
IV.附圖簡述

圖1卵母細胞孤雌生殖激活產(chǎn)物。
圖2精子發(fā)生和卵子發(fā)生示意圖。
圖3卵母細胞的融合以及卵母細胞融合產(chǎn)物的發(fā)育。
圖4卵母細胞孤雌生殖激活產(chǎn)物詳述。
圖5A由小鼠HS細胞衍生的集落形成單位(CFU)形態(tài)照片。
圖5B由小鼠HS細胞衍生的紅細胞形態(tài)照片。
圖5C由小鼠HS細胞衍生的單核細胞形態(tài)照片。
圖5D由小鼠HS細胞衍生的淋巴細胞形態(tài)照片。
圖5E由小鼠HS細胞衍生的帶有顆粒的造血細胞形態(tài)照片。
圖5F由小鼠HS細胞衍生的帶有顆粒的及單核造血細胞形態(tài)照片。
圖6由小鼠HS細胞衍生的搏動肌細胞形態(tài)照片。
圖7A由小鼠HS細胞衍生的胰腺細胞簇形態(tài)照片。
圖7B由小鼠HS細胞衍生的胰島素和高血糖素染色的胰腺細胞形態(tài)照片，其中胰島素染色的呈褐色而高血糖素染色的呈紅色。
圖8A描述由人純合減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞衍生的桑椹胚樣團的發(fā)育的照片。
圖8B由人純合減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞衍生的早期胚泡樣團照片。
圖8C顯示由人純合減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞衍生的內(nèi)細胞團的胚泡樣團的照片。
圖8D在由人純合減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞衍生的飼養(yǎng)細胞層(D)上生長的分離的內(nèi)細胞團照片。
圖9A由小鼠HS細胞衍生的Nestin-陽性神經(jīng)元前體細胞形態(tài)照片。
圖9B由小鼠HS細胞衍生的酪氨酸羥化酶-陽性神經(jīng)元細胞形態(tài)照片。
V.優(yōu)選實施方案的詳細描述此處引述的所有參考文獻均全文引入作為參考。此處的任何內(nèi)容均不應解釋為對下述內(nèi)容的承認，即本發(fā)明不能通過在先的發(fā)明先于所述公開內(nèi)容，或現(xiàn)有技術(shù)提供了充分或足夠的公開。在所有描述中，所述的優(yōu)選實施方案均是示例性的，并非是對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明提供了分離的純合干(HS)細胞，生產(chǎn)HS細胞的方法，以及制備用于診斷，細胞治療，基因治療或作為為美容和治療性移植提供組織和器官的細胞來源的分化細胞的方法。而且，上述的用途僅是示例性的而并非窮舉。更具體地說，HS細胞是從由未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞衍生的胚泡樣團分離得到的。
在過去，是通過長期培養(yǎng)受精胚泡的內(nèi)細胞團衍生的細胞來獲得胚胎干(ES)細胞。接下來對ES細胞進行培養(yǎng)和遺傳修飾，并誘導分化以產(chǎn)生細胞，從而制備用于治療的轉(zhuǎn)基因動物或細胞。
本發(fā)明不同于現(xiàn)有技術(shù)中獲得具有分化能力的多能細胞的方法，因為本發(fā)明提供了純合的干細胞，并且所述干細胞是從未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞的有絲分裂激活所產(chǎn)生的胚泡樣團中分離的。而且，可誘導由胚泡樣團中分離的HS細胞分化，以獲得分化的細胞或組織，多能祖細胞或作為永久性細胞系維持下來。需要時，可向本發(fā)明的HS細胞或祖細胞中引入遺傳修飾。
因此，本發(fā)明提供多能HS細胞，多能祖細胞，和/或最終分化的細胞及其制造方法，其中，所述的細胞可用于多種治療和診斷目的。
A.定義在本發(fā)明的上下文中應用下述定義。
″分化″是一種高度調(diào)控的過程，即細胞成熟為正常功能細胞所經(jīng)歷的過程。分化細胞具有顯著的特性，其執(zhí)行特定的功能并且進行分裂的可能性很小。與此相反，未分化的細胞是迅速分裂的未成熟的、胚胎或原始細胞，其沒有特定的形狀且具有多種非特異的活性和功能。
此處所用到的術(shù)語″干細胞″指相對未分化的細胞，其活躍地分裂和循環(huán)，對成熟的、分化的和功能細胞系產(chǎn)生適當?shù)拇碳?。對所述干細胞所定義的性質(zhì)包括(a)自身不是最終分化的；(b)可在動物一生中無限分裂；和(c)在其分裂時，每個子細胞可選擇繼續(xù)維持為干細胞或進入不可逆導致最終分化的過程。那些起初能力沒有限定的(即能形成多種分化細胞類型)干細胞的稱為″多能″。多能細胞的來源包括胚胎干(ES)細胞，胚胎癌(EC)細胞，由體細胞克隆產(chǎn)生的細胞，畸胎瘤和畸胎癌。
能夠由三個胚層，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層之一產(chǎn)生細胞的祖細胞系在本申請中稱作“多能”。每一祖細胞系并非最終分化，而是可在動物的一生中繼續(xù)分裂，認為其可僅由一種類型的胚層形成不同的組織或細胞。因此特定的祖細胞系可分化成骨，軟骨，平滑肌，橫紋肌和造血細胞(中胚層)；肝，原腸，和呼吸上皮(內(nèi)胚層)；或神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，毛囊和齒芽(外胚層)。此處術(shù)語″祖細胞″與“多能干細胞”或“前體細胞”在使用中具有相同的意義。這種由HS細胞在體內(nèi)或體外定向分化形成的祖細胞系可在培養(yǎng)物中作為永久細胞系維持(其中的術(shù)語“體內(nèi)”包括通過下述方式誘導的分化，即在同基因的或異基因動物中將所述HS細胞裝入膠囊，以由這些裝入膠囊的的細胞產(chǎn)生干質(zhì))。
″畸胎瘤″通常出現(xiàn)在自發(fā)的異常細胞團中，包含多種類型的分化組織，由三個胚層衍生的組織，如骨、肌肉、軟骨、神經(jīng)、齒芽和腺上皮等，其與未分化的干細胞混合在一起，其中的干細胞可繼續(xù)分裂產(chǎn)生更多的這些分化組織。
畸胎瘤可自發(fā)地形成在生殖系統(tǒng)中常見的包含來自全部三個胚層的細胞的腫瘤。此外，其以非調(diào)控生長為特征。″干質(zhì)″是新近派生的術(shù)語，用以描述HS細胞移植到宿主中衍生出的物質(zhì)。與畸胎瘤不同，干質(zhì)雖然也包含來自三個胚層的細胞但表現(xiàn)為受控生長。因此，可將其用作在體內(nèi)分化本發(fā)明的HS細胞的工具。
″畸胎癌″是繼發(fā)于畸胎瘤?；チ龃蟛糠质橇夹缘模坏绻渥?yōu)閻盒缘?，可發(fā)展為畸胎癌并使宿主致死。
″純合干細胞″，先前稱為″畸胎瘤干細胞″或″TS細胞″，是來自未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞的未分化干細胞。優(yōu)選地，其是在卵子發(fā)生(或″激活″)的過程中阻止第二極體擠出，或在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和單倍體卵母細胞自發(fā)的染色體自我復制而形成的。純合干細胞(HS)是通過由″有絲分裂激活″未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞發(fā)育的胚泡樣團的內(nèi)細胞團產(chǎn)生的分離細胞，其可通過下述步驟完成(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；(b)在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；(c)在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的基因組自我復制；或，(d)將兩個單倍體卵或精子核轉(zhuǎn)入去核卵母細胞?；蛘?，使用方法(a)或(d)時利用基因型分析篩選純合干細胞。
在哺乳動物發(fā)育過程中，卵裂產(chǎn)生一種薄壁的中空球，即“胚泡”，而胚通常適當表示為一端的細胞團，又稱作″內(nèi)細胞團″。所述的胚泡是在植入前形成的，相當于″囊胚″。薄壁的中空球的壁是指″滋養(yǎng)層″，是在哺乳動物胚泡周圍形成的上皮組織的胚外層，將胚胎附著于子宮壁。所述的滋養(yǎng)層形成絨毛膜的外層，與母體組織一起形成胎盤。
在本發(fā)明中″胚泡樣團″不同于″胚泡″(本領(lǐng)域中所用的)之處在于它是有絲分裂激活的未受精減數(shù)分裂I后的生殖細胞的產(chǎn)物。
此處所用的術(shù)語“有絲分裂激活的”指需要進行正常細胞有絲分裂的能力，包括卵母細胞孤雌生殖激活和精子細胞單雄生殖激活。依本申請的目的，有絲分裂激活的與孤雌生殖激活或單雄生殖激活同義。
此處所用的術(shù)語″純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞″是指處于配子形成階段的生殖細胞，在此階段該細胞包含兩個拷貝的父本或母本同源染色體。
B.本發(fā)明的分離干細胞如上文所述，本發(fā)明的純合干(HS)細胞來自于激活的未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞。例如，使兩個成熟的卵母細胞或精子融合形成胚泡樣團，由此衍生出HS細胞。由這種胚泡樣團衍生的干細胞具有減數(shù)分裂后的基因型，表現(xiàn)為純合、多能及生物學良性。
而且，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的HS細胞可由任意個體產(chǎn)生，并應用于相同的個體或者相關(guān)或不相關(guān)的免疫組織相容性個體，所述不相關(guān)的免疫組織相容性個體在受體和HS細胞，祖細胞，或者由HS細胞或祖細胞衍生的分化細胞和/或組織間之間具有高度免疫相容性。
可在體內(nèi)或在體外誘導HS細胞分化成起源于三個胚層的多種類型的組織。在優(yōu)選的實施方案中，在同基因的或異基因動物中將所述HS細胞裝入膠囊，以產(chǎn)生干質(zhì)，在其中所述的細胞分化成起源于內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的多種類型的組織，其包括但不限于皮膚，毛發(fā)，神經(jīng)組織，胰島細胞，骨，骨髓，垂體，肝，膀胱，及其他在動物，包括人中有診斷或治療用途的組織。而且，分化技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，特別是那些開發(fā)ES細胞和胚胎癌(畸胎癌)細胞分化的人員可在不花費過多勞動的前提下誘導多能細胞分化成所需的細胞類型。
例如，Hole，Cells Tissues Organs，165181-189(1999)(該文獻在此引入作為參考)中描述了在體外使胚胎干細胞定向分化成造血細胞的方法。此外，Doetsehman等，Embryol.Exp.Morphol.，8727-45(1985)(該文獻在此引入作為參考)提示由在懸浮培養(yǎng)物中生長的ES細胞中去除白血病抑制因子(LIF)導致囊狀胚狀體的形成，所述的囊狀胚狀體包含由紅細胞和巨嗜細胞組成的血島。也描述了來自干細胞的其他造血細胞，包括中性粒細胞，肥大細胞，巨噬細胞，和紅細胞(參見，如Wiles和Keller，Development，111259-267(1991)；Keller等，Mol.Cell.Biol.13473-486(1993a)；及Lieschke和Dunn，Exp.Hematol.，23328-334(1995)，上述文獻均在此全文引入作為參考)。這些方法適用于本發(fā)明的HS細胞。
Cho等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，969797-9802(1999)所述的使ES細胞有效分化為成熟的Ig-分泌B淋巴細胞的技術(shù)也適用于本發(fā)明的HS細胞，相關(guān)文獻在此引入作為參考。類似地，Dani，CellsTissues Organs，165173-180(1999)中描述的用于細胞使ES細胞分化成脂肪細胞的方法，可作為一種有應用前景的模型應用于本發(fā)明，相關(guān)文獻在此引入作為參考。例如用視黃酸(RA)對分化早期的胚狀體處理一段時間可能與脂肪形成相聯(lián)系。
Okabe等Mech.Dev.，5989-102(1996)中描述了使干細胞分化為多種神經(jīng)元細胞的方法，相關(guān)文獻在此引入作為參考。類似地，McDonald等，Nature Medicine，51410-1412(1999)中描述了由干細胞衍生的少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，其對治療脊髓損傷具有特定的用途，相關(guān)文獻在此引入作為參考。這些技術(shù)均可應用于本發(fā)明的HS細胞。
應用輔助細胞系，如OP9，衍生特定的細胞系也有描述，參見，例如Nakano等，Science，2651098-1101(1994)和Nakayama等，Blood，91228 3-2295(1998)涉及紅細胞，髓細胞和淋巴細胞系，上述文獻均在此引入作為參考。
使本發(fā)明的HS細胞分化成濾泡細胞及上皮細胞的方法也有描述。例如Taylor等，Cell，102451-361(2000)中描述了ES細胞衍生的濾泡和上皮細胞可用于毛發(fā)的替換和皮膚移植治療，可對這些技術(shù)進行修飾以應用于本發(fā)明的HS細胞，在此引入作為參考。特定調(diào)節(jié)基因的表達也可用于指導分化。參見，例如Hole等，Blood，901266-1276(1996a)和Battieres.Clin.Hematol.，3467-483(1997)涉及造血基因，相關(guān)文獻在此引入作為參考。同樣的，初步證據(jù)表明核調(diào)節(jié)因子與脂代謝相關(guān)，其包括但不限于PPARs(PPARδ和PPARγ)和C/EBPS(C/EBPβ，C/EBPδ和C/EBPα)，可能引發(fā)前脂肪細胞到脂肪細胞的最終分化。這種因子也可在本發(fā)明的分化方法中發(fā)揮作用。
依所需功能，可通過檢測分化特異的基因的表達、檢測組織特異性抗原、或檢測細胞或組織的形態(tài)、檢測功能表達，如離子通道功能或任何適合于檢測HS細胞分化的方法對分化作出評估。
通過體外或體內(nèi)定向分化技術(shù)由本發(fā)明的HS細胞衍生的多能祖細胞能夠產(chǎn)生來自全部三個胚層，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的細胞。例如祖細胞可分化成骨，軟骨，平滑肌，橫紋肌和造血細胞(中胚層)；肝，原腸，和呼吸道上皮(內(nèi)胚層)；或神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，毛囊和齒芽(外胚層)。盡管本發(fā)明的祖細胞不必是永生化的，但其可作為永生化細胞系維持下來。形態(tài)上，祖細胞不表達ES細胞表面的標記，如靈長類動物ES細胞系特征性表面標記，對于SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，堿性磷酸酶活性為陽性，對SSEA-1為陰性。
優(yōu)選地，在不存在其他多能HS細胞時培養(yǎng)HS細胞來生產(chǎn)本發(fā)明的祖細胞。而且通過阻止衍生所述祖細胞的多能HS細胞的生長和增殖輔助所述祖細胞增殖?？衫帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生祖細胞，例如，可在分化誘導劑存在下培養(yǎng)由胚泡樣團分離的HS細胞，在沒有其他HS細胞存在下生產(chǎn)多能祖細胞并阻止未分化的HS細胞進一步增殖。
另外，本發(fā)明中分離的HS細胞由于基因組印記而不能發(fā)育成足月胚胎；但如后面的實施例所述HS保持其分化成功能性分化細胞，和/或組織的能力。基因組印記的機理目前仍知之甚少，但已清楚表明孤雌生殖胚胎由于印跡不能發(fā)育成足月(Surani等，DevelopmentSupplement，89-98(1990))。鑒于印記基因的表達是由其親本來源決定的，印記包括種系特異的漸成標記過程(Allen等，Development，1201473-1482(1994))。可應用于印跡機制的可遺傳漸成修飾包括等位基因特異的DNA甲基化作用和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾，如可由DNA酶過敏性試驗檢測的那些。同上。對于某些基因(例如，Igf2r和H19)，父本基因是經(jīng)印記的，而對于其他的基因(如，Igf2和Snrpn)母本的等位基因總是經(jīng)印記的，同上(還可參見Mann等，Cell，62251-260(1990)，和Devel.Biol.，377-85(1992)，在此引入作為參考以討論單雄生殖和孤雌生殖胚胎的多能性，以及遺傳印記的含義)。
C.制備本發(fā)明的純合干細胞如上所述，由經(jīng)有絲分裂激活或未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞建立而發(fā)育的胚泡樣團分離HS。圖1是由未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞發(fā)育HS細胞的優(yōu)選方法流程圖。
生殖細胞發(fā)育成未受精減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞，其在受到激活后產(chǎn)生衍生出本發(fā)明的HS細胞的胚泡樣團。本發(fā)明的HS細胞和/或分化細胞可應用于疾病的診斷和/或治療，例如通過向需要這種治療的個體植入或移植。
盡管由相同的個體或免疫相容性個體均可獲得純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞，但在某些情況下優(yōu)選自身供體。但是當選擇治療患有遺傳疾病(即，以由于突變或不適當?shù)谋磉_而缺失關(guān)鍵基因為特征的疾病)的個體時，優(yōu)選使用非自身供體。換言之，選擇程序領(lǐng)域的技術(shù)人員會選擇那些表現(xiàn)所需基因型的自體生殖細胞(如，沒有缺陷或突變基因的細胞)，這些細胞可以表達上述的缺陷基因。這種選擇技術(shù)可用于避免對組織移植而言免疫不相容的基因型或表型。
可通過常規(guī)的技術(shù)，特別是那些在體外受精領(lǐng)域中常用的技術(shù)從供體收獲純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞。參見，例如Jones HWJr.等，F(xiàn)ertil.Steril.，37(1)26-29(1982)，該文獻描述由人卵巢濾泡中抽吸卵母細胞的技術(shù)；Lisek等，Tech.Urol.，3(2)81-85(1997)，該文獻描述從附睪和睪丸中收集精子的技術(shù)；和Stice等，Mol.Reprod.Dev.，38(1)61-8(1994)，及Takeuchi等，Hum.Reprod.，14(5)1312-7(1999)，該文獻描述將一個供體的核物質(zhì)移植到另一個去核卵母細胞中的技術(shù)。所有這些文獻均在此全文引入作為參考。
HS細胞是通過(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合，然后通過基因型分析篩選純合干細胞；(b)在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；(c)在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的基因組自我復制；或，(d)將兩個單倍體卵或精子核轉(zhuǎn)入去核卵母細胞，然后利用基因型分析篩選純合干細胞。圖2是精子發(fā)生和卵子發(fā)生的示意圖，表示在雄性和雌性中有絲分裂和減數(shù)分裂階段的不同。
本發(fā)明中所用到的卵母細胞可通過任何本領(lǐng)域中已知和尚待開發(fā)的適宜方法獲得。典型地，可從供體的卵巢濾泡中獲得人卵母細胞，由周圍或粘附的細胞分離?？蓡为毣蚪Y(jié)合克羅米酚檸檬酸鹽施用適當?shù)拇傩韵偎鼗虼傩韵偎仡愃莆镎T導超數(shù)排卵(Barriere等，Rev.Prat.，40(29)2689-93(1990)，在此引入作為參考)。在小鼠中，示例性的方法包括施用孕馬血清(PMS)模擬促濾泡激素(FSH)，和人絨毛膜促性腺素(hCG)模擬促黃體激素(LH)(參見Hogan等，Manipulating the mouse embryoA Laboratory Manual，2ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994)。有效的超數(shù)排卵誘導依賴于多種不同的因素，其包括但不限于雌性的年齡、體重，促性腺素劑量、施用時間和所用的株。
排卵超誘導和卵母細胞收獲是本領(lǐng)域已知的。舉例來說，對小鼠而言，詳細的方法參見Hogan等，同上，P130-132，該文獻的全部內(nèi)容在此引入作為參考。例如Hogan描述了腹膜內(nèi)施用由冷凍的干粉重懸于無菌的0.9％NaCl中的PMS和hCG以誘導超數(shù)排卵。PMS和hCG應在內(nèi)源LH釋放之前施用。Hogan方法針對從小鼠中收獲卵母細胞，按照慣例也可在不進行過多實驗的情況下適用于人。
聚乙二醇也表現(xiàn)出誘導排卵的卵母細胞融合的作用(參見如，GGSekirina，Ontogenez，16(6)583-8(1985)，和Gulyas BJ，Dev.Biol.101(1)246-50(1984)，在此引入作為參考)。另外Nogues等，Zygote，2(1)15-28(1994)，(在此引入作為參考)中描述了通過滅活的仙臺病毒誘導卵母細胞融合，產(chǎn)生可進行胚胎發(fā)育第一階段的″受精卵″或″卵母細胞融合產(chǎn)物(OFP)″。有關(guān)卵母細胞融合技術(shù)的綜述，參見Gulyas BJ，Dev.Biol.，457-80(1986)，在此引入作為參考。有關(guān)小鼠卵母細胞融合技術(shù)的細節(jié)，參見Hogan等，同上，P148-150，其中所獲得的帶有卵丘細胞的卵在溶于Dulbecco′s PBS的7％乙醇中維持5min，用培養(yǎng)基洗滌，然后于37℃下溫育5h。接下來用透明酯酸酶處理去除卵丘細胞。圖3描述的是卵母細胞的融合及卵母細胞融合產(chǎn)物的發(fā)育。
另外，阻止第二極體從卵母細胞擠出可產(chǎn)生HS細胞。事實上，在第一次減數(shù)分裂和第一極體分離后即出現(xiàn)第二次減數(shù)分裂。在第二極體擠出前將卵母細胞暴露于下述試劑，包括但不限于，Ca++離子載體(A23187)，或乙醇，接下來暴露于下述試劑，包括6-二甲基氨基喋呤(6-DMAP)，嘌呤霉素，或細胞松弛素D，由此激活所述的二倍體卵母細胞形成胚泡樣團。圖4描述了可能的激活產(chǎn)物。
在另一個實施方案中，允許第二極體擠出，并且自發(fā)的基因組自我復制可以用于衍生HS細胞。在孤雌生殖激活時，卵母細胞擠出第二極體形成單倍體。在合適的條件下溫育這種單倍體卵母細胞使其分裂并形成胚泡樣團。參見Taylor，A.S.，等，″The early developmentand DNA content of activated human oocytes and parthenogenetichuman embryos，″Hum.Reprod.，9(12)2389-97(1994)；Kaufman，M.H.等，″Establishment of pluripotential cell lines fromhaploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol，73249-61(1983)。
本發(fā)明中所用的精子細胞可利用任何本領(lǐng)域中已知的或尚待開發(fā)的方法獲得，特別是那些體外受精領(lǐng)域中的常規(guī)方法。收獲精子細胞(減數(shù)分裂II完成的)，而后誘導融合以產(chǎn)生用于雄性的HS細胞?？衫靡阎臉藴始夹g(shù)實現(xiàn)精子細胞融合，例如Asakura S，等，Exp.Cell.Res.，181(2)566-73(1989)，該文獻教導利用低滲培養(yǎng)基誘導一對精子細胞融合，最終形成單一的頂體，該文獻在此引入作為參考。另外，可用本領(lǐng)域已知的方法激活第二精母細胞(減數(shù)分裂I完成)。
最后，如上所述可由去核卵母細胞構(gòu)建HS細胞。特定地，可將兩個精子或單倍體卵核轉(zhuǎn)移到去核卵母細胞中，構(gòu)建在卵母細胞胞漿中帶有雄性或雌性供體核遺傳信息的未受精的二倍體卵母細胞。在雄性中，這一方法有利于親代的基因表達，這是由于它模擬精子對卵子受精的過程，其引發(fā)受精卵中的基因表達。可利用本領(lǐng)域的標準技術(shù)收獲和/或分離供體核物質(zhì)。類似地，也可以利用體外受精領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來實施轉(zhuǎn)移步驟(參見美國專利5,945,577，WO98/07841以及上述的S.L.Stice和T.Takeuchi，和Wobus等，Cells Tissues Organs，1661-5(2000)，這些文獻在此引入作為參考)。
也可以通過多核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)對HS細胞進行遺傳修飾，所述轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于病毒載體轉(zhuǎn)移，細菌載體轉(zhuǎn)移及合成載體轉(zhuǎn)移(如通過質(zhì)粒、脂質(zhì)體和膠體復合物)。
由受精胚泡的內(nèi)細胞團中分離ES細胞的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法也適于由胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離HS細胞。例如，參見Gardner等，″Culture and Transfer of Human Blastocysts″，CurrentOpinions in Obstetrics and Gynecology，11307-311(1999)，美國專利No.5,843,780(Thomson等)和美國專利No.5,905,042(Stice等)所述文獻的內(nèi)容在此引入作為參考。
D.由本發(fā)明的分離的HS細胞衍生祖細胞、分化細胞、細胞團和組織類型在存在或不存在細胞因子，生長因子，胞外基質(zhì)成分和其他因子的條件下通過任意合適的方法誘導分離的HS細胞分化。例如在平面的粘附環(huán)境(液體)下或在三維的粘附環(huán)境下(如1％膠原凝膠)誘導HS細胞分化。也可利用微重力環(huán)境誘導HS細胞分化，參見Ingram等，In vitro Cell Dev.Biol.Anim.，33(6)459-466(1997)。另一種誘導分化的方法是通過在免疫缺陷的小鼠(Thompson等，Science，282(5391)1145-47(1998))，或其他動物中生成干質(zhì)來進行。將HS細胞裝入膠囊使其在適當?shù)乃拗髦行纬筛少|(zhì)，由此誘導分化。例如可將人HS細胞裝入膠囊，將其放入用于衍生上述細胞的同一患者(同基因的)，或不同患者(異基因的)體內(nèi)。類似地，可將完整的胚泡樣團植入到受體動物體內(nèi)，使其形成干質(zhì)。
目前，有許多利用合成的，選擇性透過膜從機體免疫系統(tǒng)中分離細胞的技術(shù)?？衫眠@種技術(shù)通過在體內(nèi)生成干質(zhì)而分化HS細胞。例如，一旦將裝入膠囊的HS細胞植入以生成干質(zhì)，即可利用膜使養(yǎng)料、氧氣和生物治療性物質(zhì)在血液或血漿與裝入膠囊的細胞之間自由交換。這種系統(tǒng)可在膜和基質(zhì)載體的化學特性的基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)抗原、細胞因子和其他免疫成分的雙向擴散。參見Lanza等，Nat.Biotechnol.，14(9)1107-11(1996)。對于參與在動物中植入胚泡樣團的系統(tǒng)，可將單個或多個細胞團植入一種動物中。
可由任意動物供體物質(zhì)生產(chǎn)HS細胞，將其用于任意動物系統(tǒng)。本發(fā)明包含人和非人HS細胞。適當?shù)墨F醫(yī)用途包括由哺乳動物、魚類、爬行動物、鳥類和兩棲動物生產(chǎn)HS細胞并應用于所述動物中。
本發(fā)明中分離的多能HS細胞可分化成選擇的組織并應用于多種治療用途，其包括為用于研究、診斷或植入到個體中的目的在體外培養(yǎng)分化的組織。優(yōu)選地，將HS細胞以治療性目的應用于為形成HS細胞提供供體物質(zhì)的個體。
用于分化多能細胞的現(xiàn)有技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，其包括使胚胎癌(EC)細胞分化成多種胚胎和胚胎外細胞的方法(參見Andrews，APMIS，106158168(1998)，引入此處作為參考)。這些技術(shù)也可用于誘導HS細胞分化。用于EC細胞定向分化的體外方法包括使EC細胞暴露于多種已知的、可引發(fā)細胞定型和分化成所需細胞類型或組織的多種因子。另外，所應用的體外分化方案可包括去除有利于干細胞維持的生長因子。一旦由培養(yǎng)基中去除了這些因子，干細胞即形成簇，即已知的胚狀體，在其中可以找到全部三個胚層的后代。然后通過在培養(yǎng)基中添加額外的生長因子和化學物質(zhì)可以增強胚狀體中特定細胞系的存在。然后所得的細胞群將含有比例增加的所需的細胞類型，即可將其選擇性的分離出來。另參見Edwards等，ModernTrend，74(1)1-7(2000)，其中討論了多能干細胞及其在醫(yī)藥中的用途，該文在此引入作為參考。
舉例來說分化控制因子包括但不限于細胞因子、激素和細胞調(diào)節(jié)因子如LIF、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，IL-3，甲狀腺激素(T3)，干細胞因子(SCF)，成纖維細胞生長因子(FGF-2)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。盡管已知刺激性細胞因子，如GM-CSF，SCF，和IL-3可促進分化(參見Keil等，Ann.Hematol.，79(5)243-8(2000)，在此引入作為參考)，抑制因子，如LIF，可使小鼠胚胎干(ES)細胞維持在未分化的多能狀態(tài)(Zandstra等，Blood，96(4)1215-22(2000)，在此引入作為參考)。另外，已表明SCF可刺激小雞的推定祖細胞分化成破骨細胞(van′t Hof等，F(xiàn)ASEB J.，11(4)287-93(1997)，在此引入作為參考)，F(xiàn)GF-2在引發(fā)永生化GHFT細胞中垂體催乳素細胞分化和維持催乳激素表達均起作用，由此證明控制干細胞分化成不同前垂體細胞的機制(Lopez-Femandez等，J.Biol.Chem.275(28)21653 60(2000)，在此引入作為參考)。此外，血小板衍生的生長因子(PDGF-AA，-AB，和-BB)支持神經(jīng)元分化，而睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和甲狀腺激素T3產(chǎn)生星形膠質(zhì)細胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞克隆(Johe等，Genes.Dev.，10(24)3129-40(1996)，在此引入作為參考)。
此外，2001年4月26日公開的WO 01/29206(Cibelli等)描述了多種分化因子，如分化劑，生長因子，激素和激素拮抗劑，胞外基質(zhì)成分，多種因子的抗體和可用于誘導ES分化的技術(shù)。這種技術(shù)和試劑/因子可用于本發(fā)明，在此引入上述文獻作為參考。另可參見Schuldiner等，″Effects of Eight Growth Factors On TheDifferentiation of Cells Derived From Human胚胎StemCell″PNAS 97(21)11307-12(2000)，也在此引入作為參考。
也可通過體內(nèi)移植誘導HS細胞分化，優(yōu)選原位方式，其中，所述細胞進行組織和功能分化并與宿主細胞建立適當?shù)穆?lián)系。定位于移植位點的內(nèi)源調(diào)節(jié)因子可指導干細胞分化成特定類型的分化細胞或組織?；蛘?，由干細胞產(chǎn)生的趨異分化細胞群和/或組織移植到皮下組織，腹膜和腎囊。參見Hogan，同上，第183-184頁，其詳細描述了腎囊植入過程。
1.人畸胎瘤中分化細胞的組織學特征和基因型畸胎瘤可以由成熟和/或未成熟的組織組成。在附著于玻片上的畸胎瘤切片中，對包含幾種類型的分化組織的細胞組形態(tài)學分析進行了鑒定，并用常規(guī)技術(shù)對這些畸胎瘤切片進行了組織形態(tài)分析(Zhuang等，J Pathol，146620(1995)，和Vortmeyer等，Am.J.Pathol.，154987-991(1999)，在此引入作為參考)。進行畸胎瘤顯微解剖以選擇性地采集個體組織成分，其包括成熟的鱗狀上皮，成熟的腸道上皮，成熟的軟骨和呼吸道上皮，未成熟的軟骨，成熟的神經(jīng)膠質(zhì)組織，未成熟的神經(jīng)組織，和成熟的呼吸道上皮(參見Nicolas等，CancerResearch，364224-4231(1976)，在此引入作為參考，其中詳細討論了由體外可移植畸胎癌及與此相關(guān)的技術(shù)分離的多種細胞系)。
提取DNA，利用幾條人染色體上的多個遺傳標記進行等位接合性分析。在對有限的成熟腫瘤進行的初步研究中，始終檢測到的是相同等位基因的純合性(Vortmeyer等，Am.J.Pathol.，154987-991(1999)，該文獻的全部內(nèi)容在此引入作為參考)。但對大量的畸胎瘤進行分析表明有一小部分腫瘤帶有雜合等位基因座。
為檢驗雜合畸胎瘤組織來源于減數(shù)分裂前細胞的假說，用相同的實驗方法解剖含有成熟的(已分化的)和未成熟的(未分化的)組織元件的卵巢和睪丸畸胎瘤以獲得多種成熟的和未成熟的組織元件樣品。(參見在后實施例)。在包括未成熟的鱗狀上皮，未成熟的神經(jīng)組織和未成熟的軟骨的未分化組織元件中檢測雜合等位基因。對于相同的遺傳標記而言，來源于這些腫瘤的分化組織是純合的。檢測的分化組織元件包括成熟的皮脂腺組織和成熟的鱗狀上皮，包括來自同一腫瘤相同成熟元件的不同區(qū)域的兩份樣品。
該檢測結(jié)果表明遺傳上的純合性與分化成為可識別的成熟組織類型相關(guān)，而遺傳雜合性與未分化的組織相關(guān)。因此在畸胎瘤中未分化的組織區(qū)域由減數(shù)分裂前的生殖細胞的致畸胎瘤事件引發(fā)，而畸胎瘤內(nèi)的分化組織來自減數(shù)分裂后的生殖細胞。
減數(shù)分裂前的細胞包含每條染色體的兩個拷貝，因此，減數(shù)分裂前的細胞增殖產(chǎn)生遺傳上的雜合細胞群。相反，減數(shù)分裂后的細胞僅具有每條染色體的一個拷貝并且是遺傳上純合的。減數(shù)分裂后的祖細胞增殖產(chǎn)生成熟的畸胎瘤，或畸胎瘤內(nèi)的成熟分化組織區(qū)的事實表明減數(shù)分裂并不僅是一種染色體重排和遺傳物質(zhì)重組的機制，也是特異基因激活導致組織分化發(fā)育的先決條件。
因此，沒有進行減數(shù)分裂的增殖腫瘤細胞保留未分化的，雜合特性，并發(fā)育成未分化的畸胎瘤組織。分化的畸胎瘤組織可衍生自增殖的已完成減數(shù)分裂的畸胎瘤或衍生自進行致畸胎瘤事件的減數(shù)分裂后細胞。
因此，減數(shù)分裂是畸胎瘤中組織分化所需的?；チ鲋械慕M織元件遺傳分析表明純合性與組織學上成熟分化的組織相關(guān)，遺傳雜合性與組織學上未成熟、未分化的組織相關(guān)。這一結(jié)果支持下述結(jié)論，即減數(shù)分裂必須在畸胎瘤細胞能進行后續(xù)的組織分化前完成。由此，本發(fā)明教導了阻斷生殖細胞減數(shù)分裂可構(gòu)建本發(fā)明中的分離的、未分化的多能純合干細胞。
2.HS細胞向特異的組織或細胞分化如上所述，本領(lǐng)域中已知的任何誘導分化的方法均可用于本發(fā)明。例如，可在組織培養(yǎng)孔中培養(yǎng)細胞，每孔包含一種特有的分化因子組合。編碼這種因子的核酸或cDNAs可作為裸DNA取出，作為制備用于通過轉(zhuǎn)染或病毒運送所述核酸的構(gòu)建體。通過下述方式鑒定分化細胞a)分化特異的抗體；2)形態(tài)；3)用分化特異的引物進行PCR；或4)任何其他可用于鑒定分化細胞特異類型的技術(shù)。
一旦實施了所述的分化方案，即可通過常規(guī)的技術(shù)從分化的HS細胞中分離來自特定細胞系的原始細胞。需要時可通過細胞培養(yǎng)或其他適合的方法擴增所分離的分化祖細胞。
可在任意合適的分化階段轉(zhuǎn)染祖細胞。例如在胚泡樣團形成前，可轉(zhuǎn)染HS細胞，由此所述細胞可用作去核卵母細胞的核供體。在另一實施方案中可在分離后直接轉(zhuǎn)染祖細胞，例如用造血系統(tǒng)的CD34+，或CD38細胞。
任何已知的插入、缺失或修飾所需基因的方法均可用于產(chǎn)生遺傳改變的祖細胞或HS細胞。
一旦將裝入膠囊的HS細胞或胚泡樣團植入動物中，即可產(chǎn)生畸胎瘤甚至畸胎癌。為防止HS細胞在移植受體中形成良性的或惡性腫瘤，可向所述細胞中引入或使之缺失某些基因以阻止未分化的細胞生長。例如可將誘導型啟動子，如MMTV引入細胞，然后通過地塞米松誘導而驅(qū)動阻斷未分化的細胞生長并誘導分化的基因表達?；蛘咭敕N系特異的基因的啟動子以驅(qū)動細胞周期阻斷物或凋亡基因表達。
制備分化祖細胞的優(yōu)選方法包括用鈣離子載體激活未受精的減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述激活的卵母細胞至胚泡樣團形成的階段。用鏈霉蛋白酶從細胞團中去除透明帶，然后通過免疫外科方法去除滋養(yǎng)層細胞。誘導余下的細胞團，即HS細胞聚集物在存在或不存在細胞因子的條件下，在平面的粘附環(huán)境(液體)，或在三維的粘附環(huán)境，即微重力環(huán)境中分化，在免疫缺陷的動物中或同基因的，或異基因動物中產(chǎn)生干質(zhì)。然后可將分化的祖細胞從分化的細胞團衍生物中去除。
下面討論可由多能細胞分化的特異類型的細胞/組織。但這些討論僅是示例性的而非窮舉。本發(fā)明可通過任何本領(lǐng)域已知的分化方法實施，包括那些在本說明書中未提及或尚未開發(fā)出來的方法。
分化成內(nèi)胚層細胞類型多能細胞分化成多種內(nèi)胚層細胞類型具有重要的治療意義，這包括用于移植目的，增強養(yǎng)料的攝入和加工或指導模式形成?？赏ㄟ^高劑量的RA或轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2(Pera和Herzfeld，Reprod.Fert.Dev.，80551-555(1998))處理HS細胞可誘導其分化成內(nèi)胚層祖細胞。也可利用六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)誘導一些HS細胞系向獨特的，顯著的非神經(jīng)元方向分化(Andrews，APM1S，106158-168(1998))。BMP-2可用于特異性地引發(fā)向腔壁，或內(nèi)臟內(nèi)胚層分化(Rogers等，Mol.Bio.Cell，3189-196(1992))。BMPs是能在體內(nèi)誘導軟骨和骨生長的分子，但BMP信號也在許多非骨組織，包括發(fā)育中的心臟，毛囊和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，表明其在細胞定型和分化中起關(guān)鍵作用。
向上皮組織分化上皮組織由緊密聚集的多面體細胞組成，具有極少的細胞間物質(zhì)。上皮細胞的形狀和大小各式各樣，從高圓柱形到立方體形，到低鱗片狀。上皮細胞核具有獨特的外形，在球形到長橢圓形的范圍變化。這些細胞間的粘附非常緊密。因而形成細胞薄片覆蓋在機體的表面并被覆空腔。這些薄片可以是由一種類型的上皮細胞組成的單層，或是由不同類型的上皮細胞組成的多層。
上皮細胞的功能原理包括覆蓋或襯墊(如，皮膚)，吸收(如，腸)，分泌(腺體上皮細胞)，感覺(神經(jīng)上皮)，和收縮(如，肌上皮細胞)。下面舉例討論不同類型的上皮細胞和由HS細胞分化成不同類型上皮細胞的方法。
(a)角質(zhì)化上皮細胞角質(zhì)化上皮細胞主要與機體的表皮和真皮層(如，毛發(fā)，皮膚，指甲等)相關(guān)。實例包括但不限于表皮角質(zhì)細胞和甲床(分化中的上皮細胞)；表皮基底細胞和甲床(表皮干細胞)；和毛干(如，髓的，皮層的，和表皮的)，根鞘(如，表皮的，Huxley′s和Henley′s層及外層)和基質(zhì)細胞(毛發(fā)干細胞)。
基底細胞是上皮薄片中相對未分化的細胞，其類似于干細胞可形成更為特化的細胞。皮膚鱗狀上皮的基底細胞可形成表皮和甲床的角質(zhì)細胞。類似地，附睪上皮基底細胞(吸收性上皮細胞，在后面討論)形成附睪的主要細胞。嗅覺粘膜基底細胞可形成嗅覺和支持細胞。因此，基底細胞可作為更特化上皮細胞的前體。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為成熟的角質(zhì)上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞或基底細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。參見，如Taylor等，Cell，102451-461(2000)(所述文獻的內(nèi)容引入作為參考)中描述的方案，其描述了由濾泡和表皮干細胞，特別是雙能濾泡突起干細胞形成濾泡和上皮細胞。
(b)屏障上皮細胞所述的屏障上皮細胞可分成兩類-濕的復層屏障上皮和襯墊上皮。濕的復層屏障上皮包括，例如泌尿上皮細胞(襯墊膀胱和泌尿管)，角膜，舌，口腔，食管，肛管，遠端尿道，和陰道(即，粘膜組織細胞)復層鱗狀上皮表面和基底上皮細胞。襯墊上皮包括，例如，襯墊肺，腸，外分泌腺和尿道的細胞和襯墊閉合的內(nèi)部體腔的細胞。
襯墊脈管，管道和開放的腔的上皮細胞包括但不限于I型肺細胞(襯墊肺的氣腔)；胰腺導管細胞(泡心細胞)；汗腺，唾液腺和乳腺的無橫紋導管細胞；腎小球壁細胞和足細胞；亨氏袢薄段細胞(腎)；和腎，精囊腺，前列腺，和其他腺體的導管細胞。
襯墊閉合內(nèi)部體腔的上皮細胞包括但不限于血管和淋巴管的血管上皮細胞(有孔的，連續(xù)的和脾臟的)；襯墊關(guān)節(jié)腔的滑膜細胞；襯墊腹膜、胸膜和心包腔的漿膜細胞；襯墊耳淋巴腔隙的鱗狀細胞；襯墊耳鱗狀細胞的內(nèi)淋巴腔隙的細胞；脈絡(luò)叢細胞(分泌腦脊髓液)；軟腦膜-蛛網(wǎng)膜的鱗狀細胞；眼纖毛上皮細胞；和角膜上皮細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為成熟的屏障上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞如基底細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。例如，參見Wolosin等，Progress in Retinal and Eye Research，19(2)223-255(2000)，在引入作為參考，其提供了干細胞和角膜周圍上皮分化階段的綜述。
(c)外分泌，內(nèi)分泌和基質(zhì)分泌上皮細胞外分泌腺的產(chǎn)物通過導管或管道分泌到皮膚或開放體腔的游離表面，如消化道，呼吸道和生殖道。它們的產(chǎn)物不分泌到血流中。外分泌產(chǎn)物的實例包括粘液多糖和碳水化合物，消化酶，乳汁，眼淚，蠟，皮脂，汗液，精液和陰道分泌物。特化用于外分泌的上皮細胞的實例包括但不限于唾液腺細胞(粘液和漿液)；舌von Ebner腺細胞；乳腺細胞；淚腺細胞；耳耵聹腺細胞；外分泌和頂分泌汗腺細胞；眼瞼Moll腺細胞，皮脂腺細胞；鼻嗅腺細胞；十二指腸腺細胞；精囊腺細胞；前列腺細胞；利特雷氏腺細胞；子宮內(nèi)膜細胞；隔離的呼吸和消化道杯狀細胞；胃襯墊粘液細胞；胃腺酶原和泌酸細胞；胰腺腺泡細胞；小腸潘納斯細胞，II型肺細胞和肺克立拉細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為外分泌上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。這些技術(shù)在此引入作為參考。
內(nèi)分泌腺的分泌物稱作激素，其直接分泌到血流中。激素在整個機體內(nèi)循環(huán)并送至靶區(qū)域，作為化學信使調(diào)節(jié)特定的機體功能。多數(shù)內(nèi)分泌腺也是上皮衍生物它們通過上皮薄層內(nèi)陷形成，最初具有將它們與上皮薄層游離表面相連的導管。在胚胎發(fā)育過程中，它們失去導管因而稱作無導管腺體。它們的分泌產(chǎn)物釋放到細胞之間的空腔并擴散到臨近的毛細血管的血液中。在顯微鏡下，內(nèi)分泌腺類似于任意的復層上皮組織但有一個很大的區(qū)別它們沒有游離表面，直接被其他組織所包圍。
內(nèi)分泌物的例子包括催產(chǎn)素，加壓素，5-羥色胺，內(nèi)啡肽，somastatin，分泌素，膽囊收縮素，胰島素，胰高血糖素，鈴蟾肽，降血鈣素，腎上腺素，去甲腎上腺素，類固醇，及其他激素。特化用于內(nèi)分泌的上皮細胞的例子包括但不限于垂體前、后葉細胞；腸和呼吸道細胞；甲狀腺和甲狀旁腺細胞；腎上腺細胞；生殖腺細胞；和腎小球旁器細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為內(nèi)分泌上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。這些技術(shù)在此引入作為參考。例如Ramiya等，Nature Medicine，6(3)278-282(2000)，該文獻全文引入作為參考，其描述了在體外由胰腺干細胞產(chǎn)生胰島細胞，其中產(chǎn)生胰島的干細胞(IPSC)培養(yǎng)物是通過消化由糖尿病前小鼠移植的胰腺組織得來的。胰島祖細胞從在含有正常小鼠血清的Earle′s高氨基酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單層上皮樣IPSCs出芽。同上。發(fā)現(xiàn)VEGF，肝細胞生長因子，再生基因-1，轉(zhuǎn)化生長因子α和胰島新生相關(guān)蛋白也致導管上皮細胞有絲分裂形成胰島內(nèi)分泌細胞。同上。另外，已表明肝細胞生長因子，β-動物纖維素和活化素A使腺泡細胞分化成胰島素分泌細胞。(還可參見Serup等，Nature Genetics，25134-135(2000)，Assady等，Diabetes，501691-7(2001)，和Lumelsky等，Scienee，2921389-93(2001)，所述文獻內(nèi)容在此引入作為參考)。
結(jié)締組織的主要組分是胞外基質(zhì)，其由蛋白纖維，無定型粉末狀物和組織液組成。胞外基質(zhì)組分是由上皮組織或結(jié)締組織或這兩種組織分泌的。特化用于胞外基質(zhì)分泌的上皮細胞實例包括但不限于成釉細胞(分泌釉質(zhì))；耳前庭器官的平面半規(guī)管細胞；和柯蒂氏器的齒間細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為胞外基質(zhì)分泌上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(d)上皮吸收細胞在腸、外分泌腺和泌尿生殖道中發(fā)現(xiàn)了與吸收相關(guān)的上皮細胞。這種上皮細胞的例子包括但不限于腸刷狀緣細胞；外分泌腺條紋導管細胞；膽囊上皮細胞；腎近端小管刷狀緣細胞；腎末梢的小管細胞；輸精小管無纖毛細胞；和附睪的基礎(chǔ)和基底細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為吸收上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(e)收縮上皮細胞肌上皮細胞是星形或梭形細胞，位于分泌或?qū)Ч芗毎幕搴突鶚O之間。肌上皮細胞的功能是在腺體的分泌或運送部分周圍收縮，促使分泌產(chǎn)物向外分泌。在虹膜和外分泌腺中有肌上皮細胞的實例。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為肌上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(f)雜類上皮細胞某些上皮細胞特別特化用于一種功能或環(huán)境，其本身不能歸于上述任何一類。例如，晶狀體細胞包括前晶狀體和晶狀體纖維上皮細胞。類似地，色素細胞包括視網(wǎng)膜色素沉著上皮細胞和黑素細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為特定的上皮細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
分化成結(jié)締組織結(jié)締組織的特征是它的細胞產(chǎn)生大量的細胞間物質(zhì)。結(jié)締組織提供和維持機體形狀。起機械作用，它們提供聯(lián)系和約束細胞和器官的基質(zhì)，并給機體以支持。
某些結(jié)締組織細胞，如骨細胞，成纖維細胞和脂肪組織在局部產(chǎn)生并維持。其他的細胞來自于其他的區(qū)域但循環(huán)并瞬時棲息于所述結(jié)締組織。結(jié)締組織的細胞成分可分成下述的幾類胞外基質(zhì)分泌細胞；特化用于代謝和貯存的細胞；以及血液和免疫系統(tǒng)循環(huán)細胞。
下面對上述類型的結(jié)締組織細胞進行舉例說明。
(a)胞外基質(zhì)分泌細胞結(jié)締組織胞外基質(zhì)分泌的實例包括但不限于成纖維細胞；毛細血管的外膜細胞；椎間盤髓細胞；成牙骨質(zhì)細胞和牙骨質(zhì)細胞(分泌牙根的骨樣牙骨質(zhì))；成牙質(zhì)細胞和牙細胞(分泌牙質(zhì))；軟骨細胞(分泌軟骨)；成骨細胞和骨細胞；骨祖細胞(成骨細胞干細胞)；眼玻璃體透明細胞；和耳淋巴周隙星形細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為特化的胞外基質(zhì)分泌細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞，如骨祖細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(b)特化用于代謝和貯存的細胞特化用于代謝和貯存的細胞的例子包括但不限于肝細胞和脂肪細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為特化用于代謝和貯存的細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
在一個實施方案中，例如利用Dani，Cells Tissues Organs，165173-180(1999)中描述的方法誘導HS細胞分化成脂肪細胞。HS細胞在體外能分化成脂肪細胞的能力，為研究脂肪形成中的早期分化事件以及鑒定參與間質(zhì)干細胞定型為成脂肪細胞系的調(diào)節(jié)基因提供了一個有應用前景的模型。
HS細胞定型為脂肪細胞的先決條件是在分化的早期階段用視黃酸(RA)短期處理HS細胞衍生的胚狀體。由ES細胞形成脂肪的發(fā)育可分為兩階段第一階段是胚狀體(EB)形成后的第2到第5天，相應于HS細胞定型的許可期，所述HS細胞受全反式RA的影響。第二階段相應于最終分化許可期，如前所述需要脂肪形成激素使所述細胞由前脂肪無性系進行分化。上述處理使產(chǎn)物中含有50-70％的脂肪細胞，相比之下未經(jīng)RA處理時只含有2-5％的脂肪細胞。
RA不能用其他已知用于最終分化的激素或化合物所替代。單獨或聯(lián)合應用胰島素，三碘甲狀腺氨酸，地塞米松或強效的PPAR激活劑，如噻唑烷二酮BRL49653，和不可代謝脂肪酸2-溴棕櫚酸處理早期的EB細胞，導致低水平的脂肪形成(5％)。在先前已報道的調(diào)節(jié)最終脂肪細胞分化的因子中，RA可能是唯一天然存在的、可引發(fā)由HS細胞發(fā)育成脂肪細胞的化合物。
作為能量來源的脂肪細胞的主要功能是在激素環(huán)境下儲存甘油三酯(脂肪生成活性)并釋放游離脂肪酸(脂肪分解活性)?？勺C明EB-衍生的脂肪細胞分別反應于胰島素和β-腎上腺素能的激動劑而表現(xiàn)出脂肪生成和脂肪分解活性，這表明在體外成熟的和功能性的脂肪細胞確實是由HS細胞形成的。
PPARs(PPARδ和PPARγ)及C/EBPδ(C/EBPβ，C/EBPδ和C/EBPα)是調(diào)節(jié)參與脂肪代謝的基因的核因子。C/EBPα對維持脂肪細胞分化表型而言是重要的，而一些證據(jù)表明，PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ引發(fā)前脂肪細胞最終分化成脂肪細胞。這些因子在使干細胞定型為脂肪細胞系在作用是通過研究其在HS細胞決定和分化期的表達而提出的。PPARγ和C/EBPβ在決定期的表達量低，且脂肪細胞-脂肪酸結(jié)合蛋白(a-F ABP)平行表達，a-F ABP是最終分化的標記。這一結(jié)果表明PPARγ和C/EBPβ不是HS細胞定型為脂肪細胞系的調(diào)節(jié)基因。先前已有報道，在大鼠胚胎發(fā)育早期檢測到PPARδ基因表達，且在PPARγ表達之前。在發(fā)育中的EB中表達的相同時間模式是保守的。與PPARγ相反，PPARδ在HS細胞決定期強烈表達，這表明這一因子可以成為參與間質(zhì)前體定型為脂肪細胞系過程的主要基因的良好侯選對象。但PPARδ基因的表達并非限制在脂肪組織，并且誘導HS細胞脂肪形成所需的處理也不對其表達起修飾作用。用PPARδ的強效激活劑，如脂肪酸2-溴棕櫚酸酯或carbocyclin刺激早期EB并不能引發(fā)EB沿脂肪形成途徑分化。
產(chǎn)生缺失PPARδ和/或PPARγ的HS細胞有助于闡明這些轉(zhuǎn)錄因子在脂肪形成的不同階段所起的作用。通過兩輪同源重組的基因靶定產(chǎn)生了這些突變的HS細胞。分化培養(yǎng)系統(tǒng)與對未分化HS細胞的遺傳操作，如基因捕獲，功能的獲得和喪失相結(jié)合，將提供鑒定參與在脂肪形成過程中的早期決定事件的新調(diào)節(jié)基因的工具。
而且，白血病抑制因子(LIF)和LIF受體(LIF-R)基因在由前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程中是發(fā)育調(diào)節(jié)的。LIF和LIF-R均在脂肪細胞分化的第一步中表達的事實使人們推測這一途徑在脂肪形成中起調(diào)節(jié)作用。LIF的功能是在研究是否LIFR/HS細胞能進行脂肪細胞分化時提出的。已知LIF無效ES細胞以類似于野生型細胞的效率進行脂肪形成，其與對LIP突變小鼠的研究結(jié)果相一致，這表明LIF表達的缺失并不阻止脂肪組織的發(fā)育。LIF屬于IL-6細胞因子家族，這一家族成員的一個特點在于生物功能冗余。
因此，可以推測LIF-相關(guān)的細胞因子能補償體內(nèi)和體外的LIF缺失。由此可研究出LIF-R在脂肪形成過程中的作用。然而，一旦生成LIFR/HS細胞，無LIF-R HS細胞進行脂肪細胞分化的能力急劇下降。突變細胞衍生的產(chǎn)物中僅5-7％含有脂肪細胞集落，相比之下，由野生型的HS細胞衍生的產(chǎn)物中有55-70％的脂肪細胞集落。經(jīng)遺傳修飾的HS細胞與培養(yǎng)條件結(jié)合使用使干細胞定型到脂肪形成途徑促進了確定LIP-R在脂肪細胞發(fā)育中的作用。
在另一個實施方案中，利用Hamazaki等，F(xiàn)EBS Letters，49715-19(2001)中所述的方法可使本發(fā)明的HS細胞分化為肝細胞，該文獻引入此處作為參考。
(c)血液和免疫系統(tǒng)的循環(huán)細胞血液和免疫系統(tǒng)的循環(huán)細胞包括但不限于紅細胞(紅血球)；巨核細胞；巨噬細胞(如，單核細胞，破骨細胞，郎格罕氏細胞，樹突細胞，和微膠質(zhì)細胞)；中性粒細胞；嗜酸性細胞；嗜堿性細胞；肥大細胞；殺傷細胞；T淋巴細胞(如，輔助性T細胞，抑制T細胞，殺傷細胞)；和B淋巴細胞(如，IgM，IgG，IgA，IgE，殺傷細胞)。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成為血液和免疫系統(tǒng)的循環(huán)細胞，或直接分化或是通過合適的祖細胞，如造血干細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。此種技術(shù)，包括在Suzuki等，Int′l J.of Hematology，731-5(2001)和Cho等，PNAS，969797-9802(1999)描述的技術(shù)，在此引入該文獻作為參考。
在一個實施方案中，誘導HS細胞形成造血細胞系。即便不是全部，大部分造血細胞系可在體外ES細胞分化后產(chǎn)生(Hole，Cells TissuesOrgans，165181-189(1999))。盡管在去除白血病抑制因子(LIF)后HS細胞將類似地起始分化，可以看出在分化過程中這些多能細胞的培養(yǎng)條件對接下來產(chǎn)生的細胞系所具有的性質(zhì)起著關(guān)鍵的作用。至少可用三種方法(1)使HS細胞聚集并在懸浮培養(yǎng)物中分化；(2)將HS細胞接種到半固體培養(yǎng)物中使其原位分化和(3)使HS細胞在輔助細胞存在下分化。
一些有關(guān)ES細胞體外分化的早期報道中使用的是懸浮培養(yǎng)物。Doetschman等，Embryol Exp Morphol.，8727-45(1985)報道在去除LIF后于懸浮培養(yǎng)物中生長，使ES細胞形成囊性胚狀體。這些胚狀體含血島(卵黃囊造血的殘余物)，其是由紅細胞和巨嗜細胞組成?；趯χ行粤＜毎蚀蠹毎?，巨噬細胞和紅細胞系的幾組產(chǎn)物的證明而使用在半固體培養(yǎng)基上的分化(Wiles and Keller，Development，111259-267(1991)；Keller等，Mol.Cell Biol.13473-486(1993a)；Lieschke和Dunn，Exp.Hema tol.，23328-334(1995)。也可以考慮利用輔助細胞系，如OP9，其后證明了紅細胞，髓細胞和淋巴細胞系的存在(Nakano等，Science，2651098-1101(1994))后者包括天然殺傷細胞類型(Nakayama等，Blood，912283-2295(1998))。
盡管HS細胞的確可在體外分化過程中形成大多數(shù)(即便不是全部)造血細胞系，但并不清楚它們是否可自發(fā)地進行上述過程。關(guān)于ES細胞，有幾個研究組報道其需要添加造血生長因子。Nakano等人(Nakano等，Science，2651098-1101(1994))的工作表明，巨噬細胞集落刺激因子缺陷細胞系OP9的使用對促進全面的造血細胞分化十分關(guān)鍵。在研究者利用RP010基質(zhì)細胞系進行的研究工作中也顯示出對基質(zhì)細胞的需要；在這一實例中還使用了外源生長因子。相反，其他研究組報道定型到髓細胞，紅細胞或淋巴細胞系似乎并不需要外源細胞系或生長因子(Hole等，Blood 901266-1276(1996a))。
對于ES細胞，造血細胞分化的顯著差異可能是由于這些研究組所用的幾種方法的不同造成的。一些研究組使用了外源細胞因子，其可擴增低水平的特異細胞系定型。事實上，顯然分化中的ES細胞本身包含廣泛的造血細胞因子轉(zhuǎn)錄物(Hole等，Blood，901266-1276(1996a)；Hole等，Gene Technology，Berlin，Springer，pp3-10(1996b))和可影響定型過程的因子(Keller等，Mol.Cell.Biol.，13473-486(1993b))。
在HS細胞體外分化后可產(chǎn)生并分離淋巴祖細胞。過繼轉(zhuǎn)移到小鼠中，所述小鼠的淋巴樣區(qū)室由遺傳病變受到損害，導致ES細胞衍生的淋巴細胞長期或短期再增殖(Potocnik等，Immunol.Lett.，57131-137(1997))。早期的報道顯示ES細胞衍生的造血祖細胞的再增殖能力可能限制在淋巴系統(tǒng)，但進一步的研究表明ES細胞衍生的細胞可顯示出長期的，多細胞系的造血增殖潛能(Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927530-7534(1995)；Hole等，Blood，901266-1276，(1996a))。
ES細胞在體外分化后可對長期再增殖的造血干細胞進行鑒定。通過表征這一分化的時間過程，ES細胞可用于檢測基因在造血干細胞第一次作為區(qū)別細胞表型出現(xiàn)的階段的差別表達。造血干細胞在相對短暫的分化時期存在；多細胞系增殖活性出現(xiàn)在分化的第4天，在第3天或第5天均未發(fā)現(xiàn)(Hole等，Blood，901266-1276(1996a))。已知造血基因的表達增強了在造血細胞分化中這一階段的重要性；表達在此階段顯著上調(diào)(Hole等，Blood，901266-1276(1996a)；Hole和Graham，Battieres Clin.Hematol.，3467-483(1997))。利用扣除雜交法，Hole和Graham，Battieres Clin.Hematol.，3467-483(1997)，證明這一體外分化模型是造血基因的豐富來源；至少已鑒定了兩個在胚胎發(fā)生和造血細胞系中以與早期造血細胞定型一致的方式表達的新基因。
也可利用基因捕獲鑒定可能參與早期造血細胞定型的基因。在這一方案中，通過將報道構(gòu)建體插入到HS細胞基因組中隨機誘變基因，通常與帶有藥物抗性的表達構(gòu)建體相偶聯(lián)。典型地，在嵌合動物產(chǎn)物產(chǎn)生后觀察被“捕獲”基因的表達模式；然后通過測序鑒定侯選基因。一種替代方法是利用體外TS細胞分化作為預篩選。利用OP9-依賴的體外ES細胞造血分化模型，證明了造血和內(nèi)皮細胞的表達捕獲(Stanford等，Blood 924622-4631(1998))。
在又一實施方案中，誘導HS細胞分化成淋巴細胞。示例性的方案利用Cho等描述的方法，他們建立了有效的系統(tǒng)使ES細胞分化成為成熟的Ig-分泌B淋巴細胞(Cho等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，969797-9802(1999))。
在添加了2.2g/l碳酸氫鈉和20％FCS(ES級并且批量檢測；Cyclone，Logan，UT)的αMEM中培養(yǎng)單層BM基質(zhì)細胞系，OP9細胞。OP9培養(yǎng)基也用于TS/OP9共培養(yǎng)。HS細胞在用絲裂霉素C-處理的鋪滿的單層胚胎成纖維細胞上用1ng/ml白血病抑制因子(R&DSystems，Minneapolis，MN)培養(yǎng)。HS和胚胎成纖維細胞在添加了15％PCS，2mM谷氨酰胺，110μg/ml丙酮酸鈉，50μM 2-巰基乙醇，和10mMHepes(pH7.4)的DMEM中維持。所有的共培養(yǎng)物均是在37℃、含5％CO2的潮濕的培養(yǎng)箱中進行溫育的。定期檢測表明所有的細胞系均作為無支原體培養(yǎng)物維持。
為誘導造血細胞生成，將HS細胞的單細胞懸液接種到6-孔板中鋪滿的OP9單層細胞中。在第3天更換培養(yǎng)基；到第5天有近100％的TS集落分化成為中胚層樣集落。在第5天用胰蛋白酶(0.25％；GIBCO/BRL)處理共培養(yǎng)物；所述的單細胞懸液預鋪板30min；將非粘附細胞(1-2×106)再接種到10-cm培養(yǎng)皿中新鋪滿的OP9細胞層中。在第6或7天開始出現(xiàn)小的造血細胞樣平滑圓潤的細胞簇。在第8天將松散的粘附細胞輕輕洗下，置于新的OP9細胞層(無胰蛋白酶)。這種處理富集了具有造血潛能的細胞，棄去了分化的中胚層和未分化的HS集落。
這種傳代后，造血集落在第10到12天及以后顯著迅速地增殖擴展。到第19天，由HS/OP9共培養(yǎng)物回收的CD45+細胞總數(shù)達約105。所用的Flt-3L終濃度5-20ng/ml(R&D Systems)。從第5天起在外源Flt-3L存在下培養(yǎng)細胞。在第5天添加Flt-3L似乎代表B淋巴細胞生成增強的時間窗，因為當在其后(在第8天或以后)添加Flt-3L時觀察到增強，在第8天到第15天更換培養(yǎng)基和/或在無胰蛋白酶條件下進行細胞傳代[即，將它們制成單細胞懸液并過濾(70μm)]。
為產(chǎn)生slgM-B細胞，在第15天收獲淋巴-造血細胞，并重新鋪于新鮮的OP9單層細胞上，在第28天用10μg/ml的脂多糖(LPS)刺激細胞4天。然后收集細胞和培養(yǎng)物上清液分別進行流式細胞術(shù)和ELISA分析。在獨立的實驗中用LPS(100μg/ml)刺激細胞48小時，然后分析CD80(B7-1)的上調(diào)。
為生成轉(zhuǎn)化細胞系，在第8天向含F(xiàn)lt-3L的TS/OP9共培養(yǎng)物中添加IL-7(5ng/ml)(R&D Systems)以維持未成熟的前-B細胞。添加由生產(chǎn)細胞系4天鋪滿的平板中獲得的未稀釋病毒原液感染共培養(yǎng)物。用含4μg/ml聚凝胺(Sigma)和IL-7的3ml病毒原液替換培養(yǎng)基以感染10-cm培養(yǎng)皿中的共培養(yǎng)物。所述培養(yǎng)皿在37℃下周期性地搖動2-4小時。然后向所述培養(yǎng)皿中添加含IL-7的5ml新鮮OP9培養(yǎng)基。5天后更換成含IL-7但不含F(xiàn)lt-3L的培養(yǎng)基。其后更換的培養(yǎng)基不含IL-7。流式細胞術(shù)分析顯示，所有的轉(zhuǎn)化細胞系均表現(xiàn)出相同的表型。每次實驗中都有顯著的CD45R+CD24+IgMe未成熟前-B細胞群存在。感染細胞大量生長，然后通過有限稀釋克隆。通過Southern印跡分析確定了病毒基因組的整合拷貝。
在開始HS/OP9共培養(yǎng)后的不同時間進行流式細胞術(shù)分析，結(jié)果顯示在共培養(yǎng)的第5天首先觀察到CD45+細胞。到第8天在CD45+細胞表面還表達CD117和Sca-1，由此呈現(xiàn)出類似早期造血干細胞的表型。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中出現(xiàn)的早期造血中相當一部分典型地產(chǎn)生出紅細胞系的細胞，這是由大部分CD24+細胞為TER-119染色陽性所證明的(第8和12天)。盡管共培養(yǎng)第12天的大多數(shù)細胞屬于紅細胞系(CD24hiCD45-TER-119-)，CD45+細胞表達低到高水平的CD45R。這一表型暗示B細胞系在第8到12天出現(xiàn)在共培養(yǎng)物中。盡管這種B細胞系表型在第12天已經(jīng)表現(xiàn)得非常明顯，但長期培養(yǎng)(＞20天)也很少獲得CD19+IgMB細胞生成。
首次觀察到造血細胞后，在TS/OP9共培養(yǎng)的第5天添加Flt-3L。分析第19天的共培養(yǎng)物顯示，添加Flt-3L急劇增加了HS/OP9共培養(yǎng)物中B淋巴細胞的生成(60～/o vs.6％CD45R+細胞，分別為含有和Flt-3L不含有Flt-3L)。因此，在第5天向HS/OP9共培養(yǎng)物中添加Flt-3L使其后回收的B細胞系細胞提高了約10倍。顯然，在Flt-3L處理的培養(yǎng)物中，髓細胞，CD11b+(Mac-1)和紅細胞，TER-119細胞的頻率減少了。在這些培養(yǎng)物中沒有觀察到T淋巴細胞分化的證據(jù)。在第19天HS/OP9共培養(yǎng)細胞的表型清楚地表明，添加Flt-3L導致CD19.CD45R-AA4.1-CD24+IgM-細胞世代中的特異增長，盡管細胞總數(shù)僅觀察到少量增長(約30％)。在第5天添加Flt-3L，在HS/OP9共培養(yǎng)系統(tǒng)中高效地呈現(xiàn)B淋巴生成細胞。
分析其后收獲的帶有Flt-3L的HS/OP9共培養(yǎng)物表明，B細胞系標記陽性的細胞百分比大幅增長。培養(yǎng)4周后，共培養(yǎng)物中幾乎所有的(＞90％)細胞都是B細胞系CD45R+CD19+淋巴細胞。這些HS-衍生的B淋巴細胞表現(xiàn)出CD11b+表型和CD5+B細胞小(2-3％)亞組，這表明在HS/OP9共培養(yǎng)物中不易生成CD5+B細胞。
為進一步證明體外產(chǎn)生的B細胞的功能，用LPS處理第28天的共培養(yǎng)物，其后成熟的表面IgM～CD19+B細胞變大并大量增殖。促細胞分裂素激活后，一個顯示出表達CD80(B7-1)，即激活后在成熟B細胞上正常上調(diào)的共刺激分子。而且，表明來自LPS-刺激細胞的培養(yǎng)物上清液119～檢測為陽性(ELISA分析)，表明這些細胞能加強Ig分泌的水平。這些發(fā)現(xiàn)為HS細胞在體外分化為成熟的促細胞分裂素反應性Ig-分泌B細胞提供了證據(jù)。
發(fā)現(xiàn)向HS/OP9共培養(yǎng)系統(tǒng)添加外源Flt-3L是用于在體外由HS細胞生成成熟的、功能性B淋巴細胞的有效實用模型系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因素。許多發(fā)現(xiàn)支持Flt-3L是體外早期B淋巴細胞生成的重要因子的觀點。而且，多種結(jié)果說明向HS/OP9共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Flt-3L的方式使B淋巴細胞易于產(chǎn)生。對體內(nèi)B細胞分化過程中出現(xiàn)的情況進行流式細胞分析。HS-衍生的B細胞遵循正常的發(fā)育途徑，其功能類似與在體內(nèi)的祖細胞和成熟B細胞，由此得出結(jié)論這一系統(tǒng)可有效地應用于B細胞分化。
完全在體外由經(jīng)遺傳修飾的HS細胞獲得轉(zhuǎn)化的、分化的穩(wěn)定細胞系的能力可產(chǎn)生附加的用途。因為可簡單地產(chǎn)生并維持轉(zhuǎn)化體并具有迅速加倍的時間，所述的細胞系衍生可添加到研究細胞系特異基因靶定突變的方法庫中。例如可評估V(D)J重組中涉及的特定基因中的無效突變。
本發(fā)明包括在體外直接由HS細胞產(chǎn)生人B細胞祖細胞和/或B淋巴細胞的系統(tǒng)。這一系統(tǒng)為遺傳定義的HS細胞-衍生的B細胞提供無限的來源，所述的B細胞對患有無丙種球蛋白血癥和特定B細胞功能障礙的患者具有治療性用途。
分化成肌肉組織肌肉組織由具有特化的收縮或推進功能的伸長細胞(如，纖毛細胞)。
收縮細胞的例子包括但不限于骨骼肌細胞(紅、白、中間、紡錘和衛(wèi)星細胞)、心肌(普通的，結(jié)節(jié)和浦肯野纖維)；及平滑肌。
衛(wèi)星細胞是參與骨骼肌再生的肌干細胞。這些細胞是單核紡錘形細胞，位于基板內(nèi)圍繞每一成熟的肌纖維。它們被認為是在肌肉分化后保留下來的無活性的成肌細胞。但經(jīng)適當刺激后這些正常狀況下靜止的細胞被激活，增殖形成新的骨骼肌纖維。
成肌細胞是能融合在一起產(chǎn)生肌管的有絲分裂后細胞，所述的肌管最終發(fā)育成骨骼肌纖維。因此，成肌細胞被認為是骨骼肌纖維的直接前體細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成收縮肌細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞如衛(wèi)星細胞或成肌細胞，利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。這些技術(shù)包括如McKarney等，Int J.Dev.Biol.41(3)385-90(1997)，和Gussoni等，Nature 401(6751)390-4(1999)中所述的方案，上述文獻引入作為參考。McKarney等描述了生肌調(diào)節(jié)因子(myf5，肌細胞生成素，MyoDl和myf6)對胚胎干細胞分化的影響。Gussoni等描述了將正常的造血干細胞遞送到輻射過的動物體內(nèi)，導致移植受體造血腔室重構(gòu)。
具有推進功能的纖毛細胞的例子包括但不限于呼吸導管纖毛細胞；輸卵管和子宮內(nèi)膜纖毛細胞；睪丸網(wǎng)和輸精小管纖毛細胞；中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖毛細胞。
而且認為脂肪細胞和骨骼肌細胞衍生自相同的間質(zhì)干細胞前體，并提示在體外骨骼肌和脂肪的發(fā)育程序相互排斥。在體外，經(jīng)常存在骨骼肌和脂肪之間的逆關(guān)聯(lián)。與脂肪細胞系相反，骨骼肌細胞系系出現(xiàn)。單個的用低濃度的RA(10-8M)處理的EB在HS細胞分化過程中自發(fā)發(fā)育，其后產(chǎn)生脂肪細胞和骨骼肌細胞(分別由a-FABP和肌細胞生成素基因的表達確定)。但隨著RA濃度的提高，分化程序發(fā)生偏移。高于10-8M的RA濃度下肌細胞生成素的表達受到抑制，而a-F ABP的表達得以提高。
顯微鏡檢結(jié)果表明，a-F ABP和肌細胞生成素基因的表達與脂肪細胞和肌細胞的發(fā)育相平行。主要由間質(zhì)細胞表達的A2COL6基因的表達未被修飾，這表明用RA預處理早期的EB并不引起HS細胞發(fā)育程序的全面改變。RA以濃度依賴的方式誘導生肌和生脂肪之間的轉(zhuǎn)換。盡管需要對骨骼肌生成早期基因標記，如Myf5或MyoD的表達進行研究以便了解在成肌細胞前體發(fā)育的哪個階段被阻斷，由這些結(jié)果得出結(jié)論，即HS細胞定型為脂肪細胞系的許可期對肌細胞而言同樣關(guān)鍵。HS細胞的體外分化能允許對決定干細胞沿生脂肪途徑發(fā)育還是沿生肌發(fā)育途徑發(fā)育所涉及的因子進行表征。
也可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)誘導本發(fā)明中分離的HS細胞和祖細胞分化成心肌，參見Kehat等，J.Clin.Invest.，108407-414(2001)和Muller等，The FASEB Journal，142540-2548(2000)，所述文獻在此引入作為參考。
分化成神經(jīng)組織神經(jīng)和感覺組織由具有延長的突觸的細胞組成，該突觸從由具有特化的接收，產(chǎn)生和發(fā)射神經(jīng)沖動的細胞體伸出。神經(jīng)和感覺組織的細胞可分為四類自主神經(jīng)元；神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞；感覺器官和周圍神經(jīng)元的支持細胞；和感覺傳導器。下面舉例說明各類神經(jīng)和感覺細胞。
利用本領(lǐng)域的已知技術(shù)可將本發(fā)明的分離的HS細胞和祖細胞誘導分化成各種類型的神經(jīng)組織，參見Guan等，Cell Tissue Res，305171-176(2001)，Przyborski等，Eur.J.of Neuroscience，123521-28(2000)，Brustle等，Science，285754-6(1999)，Hancock等，Biochem.& Biophys.Res.Comm.，271418-421(2000)，Liu等，PNAS，97(11)6126-31(2000)，and Fairchild等，Curr.Bio.，10(23)1515-18(2000)上述文獻的內(nèi)容在此引入作為參考。
(a)利用視黃酸差示激活同源框基因同源框基因指定在果蠅和脊椎動物胚胎發(fā)生中的位置信息，它反應于RA，是一種天然形態(tài)發(fā)生基因。在人HS細胞中，RA可用于特異性地激活全部四簇人觸角足樣同源框基因，已知為HOX1，2，3，和4。參見，例如Bottero等，Rec.Res.Cancer Res.123133-143(1991)，在此引入作為參考，說明在EC細胞中RA以濃度依賴的方式，以與其在所述簇中3′到5′的排列共線性的順序差示激活人HOX2基因。
所述的基因正常地是沿發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前后軸表達，其中，3′基因表達在myencephalon中更向嘴側(cè)，而5′基因在脊髓中更近尾部表達。同源框基因的濃度依賴性說明HS細胞可暴露于特定濃度的RA中，以引起特定的同源框簇或某一簇中各個基因的表達，從而定型分化成與某種精確定位相應的組織類型，如相應于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的亞區(qū)。
(b)自主神經(jīng)元自主神經(jīng)元的例子包括但不限于1)膽堿能神經(jīng)元；2)腎上腺素能神經(jīng)元；和3)肽能神經(jīng)元。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成自主神經(jīng)元細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞，利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(c)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的例子包括但不限于；神經(jīng)元，2)星形膠質(zhì)細胞，和3)少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，或直接分化或是通過合適的中間體細胞，如神經(jīng)前體細胞利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。所述的技術(shù)包括下述的方法，所述內(nèi)容均在此引入作為參考。
Woodbury等，J.Neurosci.Res.61364-370(2000)，(在此引入作為參考)描述了利用含1-10mM BME(SFM/BME)的無血清培養(yǎng)基在重組的骨髓基質(zhì)細胞(rMSCs)中誘導神經(jīng)元表型。
Lee等，(Nature Biotech.18675-678(2000)，在此引入作為參考)描述了利用促細胞分裂劑及特殊的信號分子及因子如sonichedgehog(SHH)，F(xiàn)GF-8，抗壞血酸cAMP及其類似物，由小鼠胚胎干細胞有效地產(chǎn)生中腦和后腦神經(jīng)元，特別是多巴胺能和5-羥色胺能神經(jīng)元。
Okabe等，(Mech.Dev.5989-102(1996)，在此引入作為參考)描述了允許由胚胎干(ES)細胞分化為神經(jīng)上皮前體細胞的培養(yǎng)條件。特定地，由ES細胞衍生的高度富集的神經(jīng)上皮前體細胞在堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)存在下進行增殖。去除bFGF后這些細胞在分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。
McDonald等，(Nature Medicine51410-1412(1999)，在此引入作為參考)描述了作為定向分化方式的原位移植方法。特定地，在創(chuàng)傷9天后將神經(jīng)分化的小鼠胚胎干細胞移植到大鼠脊髓。2-5周后進行組織學分析表明移植物衍生的細胞存活并分化成星形膠質(zhì)細胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，且由受損邊緣移動了8mm遠。
Borlongan等，(NeuroReport 93703-3709(1998)，引入作為參考)描述了利用視黃酸刺激由永生化人胚胎癌細胞(Ntera 2或NT2細胞)發(fā)育成有絲分裂后神經(jīng)元樣(hNT)細胞。
Oliver Brstle等，″Protocol for producing Glial precursorsfrom pES CellsA Source of Myelinating Transplants″，TheAmericatt Association for the Advancement of Science 285754-756(1999)，進一步描述了ES細胞分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞的技術(shù)。這一技術(shù)可用于分化HS細胞，在此引入作為參考。
為表征神經(jīng)元前體細胞的電生理特性，可將其在含有B27和5％FCS的神經(jīng)基礎(chǔ)(neurobasal)培養(yǎng)基中維持12天以上，并記錄這三個培養(yǎng)皿中的15個細胞的活性。這種細胞的靜息膜電勢應為約-60mV，并且當去極化時，它們應當表現(xiàn)出距離靜息電位20mv的內(nèi)向動作電位。
內(nèi)向電流接下來是快速的滅活輸出電流(IA)和持續(xù)的外向電流。這些電流應不存在于填充Cs的細胞中，這表明它們很可能是由外向的K-調(diào)節(jié)通道介導的。
大多數(shù)的神經(jīng)元細胞表達不同持續(xù)時間和強度的自發(fā)突觸電流。向所記錄的神經(jīng)元前體細胞臨近的細胞，即向假定的神經(jīng)元施用谷氨酸可引發(fā)所記錄的神經(jīng)元中的突觸電流的產(chǎn)生，具有短暫的延遲。所記錄的突觸電流有兩種類型快速興奮突觸后電流，在約0mV時反向，和慢衰減抑制性突觸電流，用含醋酸鹽的移液管記錄時在約-50mV反向。而且，所記錄的細胞還應當對局部應用谷氨酸產(chǎn)生反應，在靜息電位時記錄到顯著的內(nèi)向電流。自發(fā)的和激發(fā)的突出應答及細胞對谷氨酸的應答表明所記錄的培養(yǎng)物中的細胞，保持了與那些產(chǎn)前的，經(jīng)培養(yǎng)的CNS神經(jīng)元類似的一系列性質(zhì)。
用NMDA刺激記錄的細胞誘導環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白(CREB蛋白)磷酸化和c-fos基因轉(zhuǎn)錄。分析這兩種誘導作用確定功能性NMDA受體是否表達。未刺激的細胞不應被磷酸-CREB染色。相反，所記錄的神經(jīng)元細胞在受谷氨酸或NMDA刺激10min后應當表現(xiàn)出強烈的核免疫反應，且可被磷酸-CREB染色。與此相反，神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞的大核不表現(xiàn)為可被磷酸-CREB染色。
另外，對經(jīng)谷氨酸鹽或NMDA處理的細胞進行RT-PCR顯示c-fos誘導，提示在這一制劑中的一些神經(jīng)元具有功能性的MDNA受體，突觸連接的存在還可通過電子顯微鏡觀察或形態(tài)學特征確定，例如應當觀察到含有大量突觸小泡的突觸前結(jié)構(gòu)，或作為活性區(qū)特征的膜增厚。這種結(jié)果表明由HS細胞衍生的神經(jīng)元前體細胞可分化成有絲分裂后神經(jīng)元，其形成功能性的突觸連接。
先前的研究已表明bFGF對神經(jīng)上皮前體細胞是強烈的促細胞分裂劑。為研究HS細胞對bFGF的應答，將在ITS/FN培養(yǎng)基中保持了6-7天的HS細胞分離并鋪于幾個不同的基于DMEM/F12-的培養(yǎng)中。3天后測定細胞密度。添加了經(jīng)修飾的N3(mN3)培養(yǎng)基的DMEM/F12，bFGF和纖連蛋白的組合應當具有最高的增殖效果。在5-50ng/ml的濃度下，bFGF應表現(xiàn)出相同的增殖效果。在低于1ng/ml的濃度下，bFGF不表現(xiàn)明顯的增殖效果。由于預期層粘連蛋白比纖連蛋白表現(xiàn)出稍高的細胞增殖刺激，所以將N3培養(yǎng)基，bFGF和層粘連蛋白的組合(″N3FL″培養(yǎng)基)用作神經(jīng)元前體樣細胞的增殖條件。
在N3FL培養(yǎng)基中占優(yōu)勢的增殖細胞應當類似于ITS/FN培養(yǎng)基誘導的nestin-陽性細胞。在N3FL培養(yǎng)基中生長時，HS細胞如多種ES細胞系(D3，CJ7和J1)應該呈現(xiàn)出相同的形態(tài)，并且其增殖嚴格依賴于bFGF。在鋪板后第1，4和7天對細胞密度計數(shù)，由此對細胞增殖進行定量。細胞計數(shù)表明在培養(yǎng)7天后細胞的數(shù)量增長了6倍。
也可以用特異于下述細胞的抗體對所述制備物進行染色，所述細胞為神經(jīng)元前體(nestin)，有絲分裂后神經(jīng)元(微管相關(guān)蛋白2；MAP2)，星形膠質(zhì)細胞(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白；GFAP)和少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞系細胞(O4，Gal-C)。在每一時間點，Nestin-陽性細胞均應占到總細胞數(shù)的80％以上；MAP2-陽性細胞數(shù)約為總細胞數(shù)的10-15％；GFAP-陽性細胞應少于總細胞數(shù)的2％。在這一制備物中不應存在O4或Gal-C陽性細胞。
而且由成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的祖細胞移植到腦中后分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞；移植到脊髓中后分化成少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。類似地，干細胞可移植到脊髓中并在那里進行分化和遷移，并促進受損脊髓的恢復。McDonald等，1999，Nature Medicine 51410-1412，移植了暴露于RA(視黃酸)的ES細胞以誘導神經(jīng)分化(4天暴露于500nM全反式-RA)，觀察到分化成星形膠質(zhì)細胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，以及在脊髓內(nèi)的遷移，行為(運動)結(jié)果表明受損脊髓的恢復。
在一個實施方案中，HS細胞可替代ES細胞移植到脊髓中進行分化和遷移，促進需要所述治療的患者得以恢復。HS細胞衍生的胚狀體(4天無，而后4天有視黃酸)用于移植，其中，應用RA誘導神經(jīng)分化。將部分胰蛋白酶化的胚狀體作為細胞聚集體移植到脊髓挫傷后9天形成的管中。假手術(shù)的對照進行同樣的操作，但它們僅接受管內(nèi)注射培養(yǎng)基代替細胞移植。用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動分級評分評估運動功能。
在進行移植的前一天(損傷后第8天)獲得BBB平方，對照組和實驗組相配對，將受試對象隨機分配至各組中，保證各組的起始運動評分相等。在撞擊損傷后的第9天，將神經(jīng)分化的HS細胞(約1×106)或載體培養(yǎng)基通過脊椎立體定位框的方式移植給受試者，將具有100μm直徑吸頭的玻璃移液管配合5μl Hamilton注射器，或Kopf微立體定位注射系統(tǒng)(Kopf Model 5000 & 900；Kopf，Tujunga，California)。在5min內(nèi)在T9水平將HS細胞或載體培養(yǎng)基(5μl)注射到管的中央?？偣餐瓿闪司哂袝r間匹配對照的三次獨立的實驗。第一組在移植后5周完成了行為分析和其后的組織學分析(n＝每組11)，HS細胞移植物與對照進行了比較。第二組用于比較早期(移植后2周)和晚期(移植后5周)組織學結(jié)果(n＝每組11)，HS細胞移植物(ROSA lacZ轉(zhuǎn)基因系)與對照進行了比較。
經(jīng)遺傳標記并在體外用10μM BrdU的24小時脈沖進行預標記的HS細胞-衍生的細胞，在移植后的14-33天進行原位鑒定。也可以用特異的抗體進行鑒定。移植2-5周后，應當發(fā)現(xiàn)HS細胞衍生的細胞聚集或單個分散地遍布受損位點。而且，在距管嘴側(cè)或尾側(cè)邊緣8mm處均可發(fā)現(xiàn)單個的細胞。在大多數(shù)受移植的受試者中，移植兩周后，HS細胞衍生的細胞填充了一定的空間，所述的空間在用培養(yǎng)基處理的受試者中是由管占據(jù)的。到第5周，在這一區(qū)域HS細胞-衍生的細胞的密度應下降，并由含纖維的胞外基質(zhì)替代。
存活的HS細胞-衍生的細胞也可通過針對下述標記的抗體進行鑒定，所述標記特異于少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞(腺瘤性息肉coli基因產(chǎn)物)，星形膠質(zhì)細胞(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白)和神經(jīng)元(神經(jīng)元特異的核蛋白)。核可通過Hoechst 33342染色進行清楚地鑒定。大多數(shù)存活的HS細胞-衍生的細胞應當是少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，但某些HS細胞-衍生的神經(jīng)元應當出現(xiàn)于脊髓的中間。許多HS細胞-衍生的少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞應當對髓磷脂堿性蛋白，即髓磷脂的整體成分，具有免疫反應性。
通過HS細胞移植增強了在“露天運動”(open field locomotion)中的能力。不同于假手術(shù)移植組對支持體重的無能，接受HS細胞移植的受試者可表現(xiàn)出部分的承重移動。在移植后2周達到BBB評分統(tǒng)計學上的差異。1個月后在假手術(shù)和HS細胞移植組間BBB評分將產(chǎn)生2分的差異。由前者獲得的評分表明不能支持體重也不能進行協(xié)調(diào)運動，而后者得到的評分表現(xiàn)出以部分肢體承重為特征的步態(tài)和部分肢體協(xié)調(diào)性。
總體來說，在負重損傷9天后將HS細胞衍生的細胞移植到脊髓可至少存活5周；由移植位點向外至少遷移8mm；分化成星形膠質(zhì)細胞，少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元而不形成腫瘤；并產(chǎn)生改善的運動功能。
先前通過去除bFGF而誘導分化的神經(jīng)元細胞可在添加了B2 7添加物和5％胎牛血清的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持至少2周，而沒有明顯的細胞死亡。這一長期培養(yǎng)可成功地應用于J1，CJ7和D3細胞系。長期培養(yǎng)是困難的，但是在N3為基礎(chǔ)的無血清培養(yǎng)基中進行。
在培養(yǎng)物中用MAP2和神經(jīng)絲-M(NF-M)雙標記的細胞應顯示出存在兩類神經(jīng)突?？?MAP2抗體對短粗的突觸和細胞體染色而抗-NF-M對細長的突觸染色。雙標記的HS細胞-衍生神經(jīng)元應具有MAP2陽性的樹突和NF-M陽性的軸突。
抗-突觸素I染色揭示出與樹突的質(zhì)膜緊密連接的突出結(jié)構(gòu)。這種染色模式顯示出沿軸突的不同位點的突觸小泡的分離。
為研究神經(jīng)遞質(zhì)表型，用幾種神經(jīng)遞質(zhì)的抗體對分化成神經(jīng)元細胞的HS細胞進行染色。結(jié)果表明大量的谷氨酸陽性細胞與完全陰性的細胞混合在一起。
而且，γ氨基丁酸(GABA)-陽性的細胞是常見的，GABA染色也是有效的。因此，可以鑒定GABA陽性但MAP2陰性的細突觸。由于GABA能神經(jīng)元的軸突應當是GABA陽性且MAP2陰性，所以這一發(fā)現(xiàn)表明樹突和軸突結(jié)構(gòu)的分化。
神經(jīng)元基因表達可進一步利用神經(jīng)元-特異的引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行分析。所述制備物包含表達谷氨酸脫羧酶(GAD6 5)′calbindin D28，NMDA受體1，2A.2B，20，(1-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸鹽(AMPA)受體，和GABAA受體的細胞。在每種情況下，由分化細胞總RNA中應檢測到更大量的轉(zhuǎn)錄物。
為研究這些神經(jīng)元細胞是否相應于位于任何特定CNS區(qū)域的細胞，檢測了沿前后軸的三個位置特異性標記的表達。Otx-1主要在前腦和中腦表達，En-1在中腦和后腦分界處表達，Hoxa-7在脊髓后部表達。未分化的HS細胞應表達Hoxa-7，但不表達Otx-1和En-1。因此后部標記Hoxa-7的表達應在bFGF存在下增殖的nestin-陽性細胞中下調(diào)10天以上。相反，Otx-1和En-1在這些增殖細胞中應上調(diào)。通過更換為含B27和血清的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行分化后，Hoxa-7的表達再次上調(diào)，Otx-1和En-1的表達應保持。不同轉(zhuǎn)錄因子的存在表明所述制備物產(chǎn)生了不同CNS區(qū)域的特征性神經(jīng)元。
(d)感覺器官和周圍神經(jīng)元的支持細胞感覺器官和周圍神經(jīng)元的支持細胞的例子包括但不限于柯蒂氏器的支持細胞(如，內(nèi)部和外部的柱細胞，內(nèi)部和外部的指細胞，邊緣細胞，Hensen細胞)；前庭器官的支持細胞；味蕾的支持細胞；嗅覺上皮的支持細胞；施旺氏細胞；腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞；和衛(wèi)星細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成支持細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞，利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
(e)感覺傳導器感覺傳感器的例子包括但不限于1)光受體；聽覺感受器(如，柯蒂氏器的內(nèi)部和外部毛細胞)；2)加速度和重力感受器；2)味覺感受器(1I型味蕾細胞)；3)嗅覺感受器(如，嗅覺神經(jīng)元)；血液pH感受器(I型和II型頸動脈體細胞)；4)觸覺感受器(如，表皮Merkel細胞，初級感覺神經(jīng)元)；5)溫度和痛覺感受器(如，初級感覺神經(jīng)元)；和6)肌肉骨骼系統(tǒng)中的構(gòu)型和力感受器(本體感受初級感覺神經(jīng)元)。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成感覺傳導器，特別是初級感覺神經(jīng)元，或直接分化或是通過合適的前體細胞，如肌細胞，利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
分化成生殖細胞涉及生殖的細胞包括生殖細胞(germcell)，如卵母細胞和精母細胞，撫育細胞，如卵巢濾泡，胸腺上皮細胞和支持細胞。
本發(fā)明的分離的HS細胞可分化成生殖細胞，或直接分化或是通過合適的前體細胞，如卵原細胞，精原細胞或原生殖細胞(起源于卵黃囊內(nèi)胚層的)，利用本領(lǐng)域已知的分化ES細胞、EC細胞、其他多能或干細胞和/或畸胎癌細胞的技術(shù)進行。
E.實施例實施例1.純合干細胞的形成，及其分化成祖細胞及在畸胎瘤內(nèi)三個胚層中的各種組織實施例1(a)通過激活作用，其后通過阻止第二極體擠出由小鼠減數(shù)分裂I后的卵母細胞衍生HS細胞利用下述方法通過超數(shù)排卵由雜交的(BDA2 F1C57 black xDBA2，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)、8周齡雌性小鼠獲得73個卵母細胞。通過注射方式向三只雜交小鼠施用5IU/100ul孕馬血清促性腺素(PMS；PCCA，Houston，TX(29-10001BX))和5IU/100μl人絨毛膜促性腺素(HCG；Sigma，St.Louis，MO，(C8554))，兩次注射間隔約48小時。
注射HCG約17小時后收獲卵母細胞，在一滴(約300μl)以終濃度為0.3mg/ml溶于M2培養(yǎng)基(M7167，Sigma)的透明質(zhì)酸酶(H4272，Sigma)中溫育新獲得的卵母細胞，排除卵丘團。然后在進行進一步處理前用HEPES緩沖的M2培養(yǎng)基將所述卵母細胞洗滌三次。
用5μM鈣離子載體(C7522，SigmaCa2+1mg/764.8μl；DMSO2.5mM＝500x(儲液)；終濃度2μl Ca2+(500X)/1ml M2＝5μM)溶液在室溫下處理卵母細胞5min使之激活。然后用HEPES緩沖的M2培養(yǎng)基將卵母細胞洗滌兩次。
Ca++激活的卵母細胞在含有6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP(D2629，Sigma)；250mM＝50x(儲液)；終濃度20μl/1ml M16＝5mM)的M16碳酸氫鹽緩沖的培養(yǎng)基(M7292，Sigma)，5％CO2，37℃條件下溫育3小時。然后用M16培養(yǎng)基將卵母細胞洗滌三次，然后在礦物油下的M16培養(yǎng)基中溫育至少4天。
在M16培養(yǎng)基中溫育4-5天后從Ca++激活的卵母細胞中收獲類似胚泡的細胞團。將包圍這些胚泡樣團的殼剝離(″孵化″)后，將它們轉(zhuǎn)移到ES培養(yǎng)基(DMEMGibco，Life Technologies，Rockville，MD(11995-065)；20％FBSGibco(16141-079))中經(jīng)絲裂霉素-C處理的小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞層上至少15天以形成干細胞。
或者通過免疫外科方法從孵化的胚泡樣團衍生干細胞。孵化的胚泡樣團與抗-小鼠Thy-1兔血清(1∶10，ACL2001，Accurate Chemical，Westbury，NY)和抗-人淋巴細胞兔血清(1∶10，CL8010，AccurateChemical)在37℃下一起溫育1小時。用M2培養(yǎng)基洗滌細胞團三次，再用豚鼠補體(1∶10，ACL4051，Accurate Chemical)在37℃下溫育30min以裂解滋養(yǎng)層細胞。然后將用補體處理的細胞團在M2培養(yǎng)基中洗滌3次，然后轉(zhuǎn)移到經(jīng)絲裂霉素-C處理的小鼠胚胎飼養(yǎng)細胞層中以形成干細胞至少15天。
小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)細胞購自Stemcell，Inc.(00308)，傳代2-3次。將一個鋪滿擴增飼養(yǎng)細胞的60mm培養(yǎng)皿用含絲裂霉素-C(終濃度10μg/ml，Sigma M4287)的5ml DMEM/10％FBS于37℃下處理3小時。將處理后的飼養(yǎng)細胞用5ml DMEM/10％FBS洗滌3次，通過1ml胰蛋白酶在37℃下處理5min，用5ml DMEM/10％FBS培養(yǎng)基中和，然后1000rpm離心5min而收集。經(jīng)絲裂霉素處理的細胞顆粒狀沉淀重懸于15ml DMEM/10％FBS培養(yǎng)基中，鋪于三個60mm培養(yǎng)皿(5ml細胞懸液/培養(yǎng)皿)，在使用前于37℃下溫育過夜。
實施例1(b)通過激活，其后通過阻止第二極體擠出使人二倍體卵母細胞發(fā)育為胚泡樣細胞團用leurplide acetate(Lupron TAP Pharmaceuticals，Deerfield，IL)下調(diào)雌性卵子供體，然后以300IU/天的劑量接受促濾泡激素(FSH)(Seromo Pharmaceutical)的處理開始COH(控制的卵巢超刺激)，從而誘導合適的多濾泡反應。當滿足濾泡成熟超聲波檢查標準時，施用單一劑量10,000IU的hCG，然后在施用hCG約36小時后，經(jīng)陰道將卵泡吸出。將其暴露于80IU/ml透明質(zhì)酸酶約30秒，而后暴露于添加了10％人血清白蛋白(InVitroCare，Inc.，SanDiego，CA)的HEPES-緩沖的人輸卵管液，從而去除卵母細胞中的卵丘。
為實現(xiàn)有絲分裂激活，用5μM鈣離子載體(A23187，Sigma)在33℃下處理無卵丘的成熟M-II卵母細胞5min，而后在1-5mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP，Sigma)中于37℃下溫育3-5小時。被激活的卵母細胞在IVC-1培養(yǎng)基(InVitroCare，Inc.)中溫育3天，然后在IVC-3(InVitroCare，Inc.)中進一步溫育2天以進行細胞分裂并使胚泡形成。另外，第二天的胚胎樣細胞團可在STO飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)。在第6天，通過下述操作進行輔助孵化，即在顯微操作器下，用顯微操作器的一個臂施加酸化的臺氏液使之達透明帶總外表面面積的1/8，同時用顯微操作器的另一個臂固定透明帶。其后胚泡從弱化的帶中釋放出來，再用抗-Thyl和補體處理所得胚泡，以免疫外科的方式消除滋養(yǎng)外胚層的細胞。然后在經(jīng)絲裂霉素處理的STO飼養(yǎng)細胞(ATCC)上，在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)處理的胚泡，所述培養(yǎng)基在添加了非必需氨基酸，青霉素-鏈霉素(Life Technologies)，β-巰基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培養(yǎng)基中含20％胎牛血清(Lifetechnologies)。參見圖8D。
實施例1(c)通過激活，其后通過允許第二極體擠出和基因組自我復制作用使人減數(shù)分裂I后的二倍體卵母細胞發(fā)育為胚泡樣細胞團用leurplide acetate(Lupron TAP Pharmaceuticals，Deerfield，IL)下調(diào)雌性卵子供體，然后以300IU/天的劑量接受促濾泡激素(FSH)(Seromo Pharmaceutical)的處理開始COH(控制的卵巢超刺激)，從而誘導合適的多濾泡反應。當滿足濾泡成熟超聲波檢查標準時，施用單一劑量10,000IU的hCG，然后在施用hCG約36小時后，經(jīng)陰道將卵泡吸出。將其暴露于80IU/ml透明質(zhì)酸酶約30秒，而后暴露于添加了10％人血清白蛋白(InVitroCare，Inc.，SanDiego，CA)的HEPES-緩沖的人輸卵管液，從而去除卵母細胞中的卵丘。
為實現(xiàn)有絲分裂激活，使無卵丘的成熟M-II卵母細胞經(jīng)假ICSI(胞漿內(nèi)精子注射)處理，模擬由精子誘導的激活作用而后與25μM鈣離子載體(A23187，Sigma)在33℃下溫育5min。經(jīng)此種方式激活的卵母細胞擠出第二極體成為單倍體。將所述單倍體卵母細胞在IVC-1培養(yǎng)基(InVitroCare，Inc.)中溫育3天，然后在IVC-3(InVitroCare，Inc.)中進一步溫育2天以進行細胞分裂并使胚泡形成。另外，第二天的胚胎樣細胞團可在STO飼養(yǎng)細胞上共培養(yǎng)。在第6天，通過下述操作進行輔助孵化，即在顯微操作器下向胚泡帶外部施加酸化的臺氏液。胚泡然后從弱化的帶中釋放出來，在經(jīng)絲裂霉素處理的STO飼養(yǎng)細胞(ATCC)上，在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基在添加了非必需氨基酸，青霉素-鏈霉素(Life Technologies)，β-巰基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培養(yǎng)基中含20％胎牛血清(Lifetechnologies)。
由激活作用所得的單倍體卵母細胞在無胞質(zhì)分裂的情況下能自我復制其基因組形成二倍體細胞(Taylor，A.S.，等，″The earlydevelopment and DNA content of activated human oocytes andparthenogenetic human embryos，″Hum.Reprod.9(12)2389-97(1994)；Kaufman，M.H.等，″Establishment of pluripotentialcell lines fiom haploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol.73249-61(1983)。在第6天，通過下述操作進行輔助孵化，即在顯微操作器下向胚泡帶外部施加酸化的臺氏液。胚泡然后從弱化的帶中釋放出來，在經(jīng)絲裂霉素處理的STO飼養(yǎng)細胞(ATCC)上，在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基在添加了非必需氨基酸，青霉素-鏈霉素(Life Technologies)，β-巰基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培養(yǎng)基中含20％胎牛血清(Life technologies)。參見圖8A-C。
實施例1(d)小鼠HS細胞的生長，這些HS細胞在小鼠腎囊中的分化，及由這些細胞形成胚狀體將由實施例1(a)中所述的胚泡樣團中獲得的HS細胞接種到0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿(10cm)中的ES細胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含1,400U ml-1的白血病抑制因子(LIF)(ESGROTM)，Chemicon ESG1106106單位/ml[ES培養(yǎng)基500mlknock-DMEM(Gibco 10829-018)425ml；FCS(合格的ES細胞，Gibco 16141-061)75ml；MEM非必需AA溶液(Gibco 11140-050)5ml；青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(Gibco10378-016)5ml；2-巰基乙醇(Gibco 21985-023)0.5ml至最終100μM，于實施例1(b)所述的小鼠飼養(yǎng)細胞層生長集落]。
HS細胞集落分成幾部分，植入26個雜交小鼠兩個腎囊之一以誘導干質(zhì)形成。在植入后的第1，3，6，9.5，10.5，11，12，和14周處死小鼠收獲干質(zhì)。將每個干質(zhì)的一半用福爾馬林固定用于形態(tài)學研究，另一半于-80℃下冷凍用于分子表征。干質(zhì)在三周左右開始形成可見大小。交錯收集干質(zhì)，研究在干質(zhì)中發(fā)育的各種組織類型。此處所鑒定的所有組織類型都是由所述的干質(zhì)產(chǎn)生的。通過如前所述的基于PCR的等位基因分析鑒定干質(zhì)基因型。
為構(gòu)建胚狀體(EB)，在60mm的培養(yǎng)皿中先將HS細胞用PBS洗兩次。然后加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液，再使所述細胞在37℃下保持5min。再加入5ml ES培養(yǎng)基，將細胞用刮刀刮出，1000rpm離心5min。將所得的細胞顆粒狀沉淀重懸于5ml無LIF的ES培養(yǎng)基中，對細胞計數(shù)。再將細胞以2×106/10cm培養(yǎng)皿接種于細菌培養(yǎng)皿中。使細胞在ES培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，每兩天按下述方式更換一次培養(yǎng)基，即將所述細胞轉(zhuǎn)移到15ml的管中，等待約5min使細胞完全沉降到管底，然后更換培養(yǎng)基。將細胞聚集在一起以形成EB，然后轉(zhuǎn)移到最初的培養(yǎng)皿中進一步分化。
實施例1(e)人HS細胞在畸胎瘤內(nèi)的分化，以及所述分化組織的遺傳純合性由病理學軍事學院研究所(the Armed Forces Institute ofPathology)Washington，DC，和紐約大學病理學系.New York，NY(Dr.J.Liu)的保存檔案中索取了31個畸胎瘤。從女性患者的20個卵巢腫瘤中獲得多種不同類型的專門分化的組織。如在代表性的病例中用本領(lǐng)域已知的方法通過FISH分析和針對染色體3和8的α-衛(wèi)星探針所確證的，發(fā)現(xiàn)分化的組織是二倍體。鑒定了3到12個來自女性患者的7個卵巢腫瘤和來自男性患者的4個睪丸腫瘤的分化組織區(qū)域及分化的組織，并對每一病例進行選擇性地顯微解剖以進行遺傳分析。發(fā)現(xiàn)在每一病例中，分化的組織是遺傳上純合的，未分化的組織是遺傳上雜合的。
顯微解剖.將玻片上未染色的6微米切片用二甲苯脫蠟，用100％到80％的乙醇漂洗，用蘇木精和曙紅漂染，然后用含10％甘油的TE緩沖液漂洗。在直接的光顯微顯現(xiàn)下進行顯微解剖。每一病例中將6到12個不同的組織分化區(qū)域分別通過顯微解剖進行遺傳分析。此外還采集了幾個正常的區(qū)域和非腫瘤組織區(qū)域。
DNA提取.將收集的細胞立即重新懸浮于25μl含Tris-HCl，pH8.0；1.0mM乙二胺四乙酸，pH8.0；1％Tween20，和0.5mg/ml蛋白酶K的緩沖液中于37℃下溫育過夜。將上述混合物煮沸5min以滅活蛋白酶K，用其中的1.5μl溶液進行DNA的PCR擴增。
遺傳分析.為可靠地鑒定顯微解剖后獲得的有限量的DNA中的純合性，用多達14個不同的高度多態(tài)的微衛(wèi)星標記對多個不同的顯微解剖的組織樣品進行了分析，所述的微衛(wèi)星標記包括DIS1646和D1S243(Ip)，D3S2452(3p)，D5S346(5q)，D7S1822(7q)，Ank-1(8p)，D9S171(9q)，D9S303(9q)，Int-2和PYGM(11q)，IFNA(9p)，D17S250(17q)，CYP2D(22q)，和AR(Xq)。每一PCR樣品含上述的模板DNA1.5μl，每種引物各10pmol，dATP，dCTP，DGTP，和DTTP各20nmol，15mM MgCl2，0.1U Taq DNA聚合酶，0.05ml[32P]dCTP(6000Ci/mmol)，和1μl 10X緩沖液，總體積10μl。進行35個PCR循環(huán)95℃下變性1min，退火1min(退火溫度根據(jù)標記物的不同在55到60℃之間)，及72℃下延伸60sec。最后一次延伸持續(xù)10min。將標記的擴增DNA產(chǎn)物與等體積的甲酰胺上樣染料(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍，和0.05％二甲苯靛)混合。
將樣品在95℃下變性5min，上樣于6％丙烯酰胺(丙烯酰胺雙丙烯酰胺49∶1)的凝膠上1800V下電泳90min。電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到3mm Whatman濾紙上干燥。用Kodak X-OMAT膜(Eastman Kodak，Rochester，NY)放射自顯影。
結(jié)果表現(xiàn)出一致的相同等位基因純合性的已分化畸胎瘤組織包括鱗狀上皮，神經(jīng)膠質(zhì)，和軟骨(利用標記Ankl(頂部)和D1S1646(底部)分析)顯微解剖樣品。正常的卵巢組織作為對照。
在畸胎瘤亞型中，發(fā)現(xiàn)分化的畸胎瘤組織具有不協(xié)調(diào)的純合等位基因(通過對下述標記進行分析Int-2，D9S303，D1S1646，D3S2452，和Ankl)包括表皮，皮脂腺，呼吸道上皮，和神經(jīng)膠質(zhì)樣品。正常的卵巢組織作為對照。在這些腫瘤中，等位基因的雜合性是由生殖細胞中減數(shù)分裂前的腫瘤發(fā)生引發(fā)的。致畸形腫瘤細胞引發(fā)后，通過隨機和獨立的事件導致帶有減數(shù)分裂后基因型的祖細胞形成。
分析了一系列包含分化的和未分化組織的卵巢畸胎瘤和睪丸生殖細胞腫瘤。在每一腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了分化的和未分化的組織元件。使用標記D3S2452，D3S303，CYP2D，和D17S250檢測了純合和雜合的組分。正常的卵巢和睪丸組織作為對照。在未分化的組織元件中檢測到雜合的等位基因，所述組織包括未成熟的鱗狀上皮，神經(jīng)組織(有的是在同一腫瘤神經(jīng)組織的不同區(qū)域中)，軟骨，腺體結(jié)構(gòu)，和間質(zhì)。發(fā)現(xiàn)從同一腫瘤中通過顯微解剖分離出的分化組織元件對于同一標記是純合的。檢測的成熟元件包括皮脂腺組織，毛囊，和成熟的鱗狀上皮(有的是在同一腫瘤鱗狀上皮的不同區(qū)域中)。在一些腫瘤中，分化的元件表現(xiàn)出相反的純合等位基因，表明有重組事件發(fā)生或表明有來自不同減數(shù)分裂后細胞的不同元件。
實施例1(f).由人HS細胞衍生祖細胞初級分化將與原代胚胎成纖維細胞層一起生長在60mm培養(yǎng)皿(Falcon，#353802)和/或0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿中的HS細胞經(jīng)1.5ml胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，#25300-050)胰蛋白酶化，然后轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中的1.5ml ES-LIF培養(yǎng)基中。1200rpm將細胞離心下來，然后棄上清。將所得細胞顆粒狀沉淀重懸于2ml ES-LIF培養(yǎng)基中制成單細胞懸液，作為懸浮細胞以1-3X106細胞的密度于懸浮培養(yǎng)-35*10mm培養(yǎng)皿(NalgeNunc，#171099)中培養(yǎng)4-6天，使干細胞長成圓球形的簇，稱作胚狀體(EBs)。每兩天將形成中的Ebs轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中進行洗滌，然后使細胞沉到管底。棄上清加入新的ES-LIF。然后將EBs轉(zhuǎn)回到懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)皿中。HS細胞長成的胚狀體包含全部三個生殖細胞層，外胚層，內(nèi)胚層，和中胚層。
外胚層祖細胞.4-6天后，將EB用1ml胰蛋白酶/EDTA進行胰蛋白酶消化，在4ml ES-LIF培養(yǎng)基中洗滌，然后在添加了10％血清替代物(Invitrogen，#10828)，和G5(Invitrogen，#17503)，N2(Invitrogen，#17502-048)或βNGF(100ng/ml)(R&D Systems，#256-GF)的DMEM/敲除培養(yǎng)基(Invitrogen，#10829-018)中重懸成單細胞懸浮液。將這些細胞在3-5X105/3ml纖連蛋白包被的35mm培養(yǎng)皿中(50μg/ml)(Sigma，#F-0895)培養(yǎng)10天，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。
另外，EB在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿中的ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后將所述培養(yǎng)基換成添加了胰島素(5ug/ml)，氯化硒(.015nM)轉(zhuǎn)鐵蛋白(50μg/ml)，和纖連蛋白(5μg/ml)(Sigma)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6天。將所述細胞用胰蛋白酶消化，然后將單細胞懸液在N2培養(yǎng)基(添加了N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGP(10ng/mL)(Invitrogen，#13256 029)的無血清-DMEM/F12)中培養(yǎng)。進行細胞計數(shù)，然后以2-5X104細胞/孔/400μlN2培養(yǎng)基的密度接種到用聚-L-鳥氨酸(15μg/ml)(Sigma，#P36550)預包被的24孔板，擴增6天。
添加G5，RA，F(xiàn)GF，NGF，GNDF，或BNDF使這些祖細胞進一步分化成不同的神經(jīng)元細胞類型。它們也維持在它們存在的條件培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
中胚層祖細胞.為形成中胚層祖細胞，將所述的單細胞懸液在上述添加了10％血清替代物和β-NGF的DMEM/敲除培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，每2/3天更換一次培養(yǎng)基。此后，將所述細胞進一步在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的條件培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10天以形成心臟祖細胞。為形成腎臟和副中腎管祖細胞可使上述細胞在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天，然后向其中添加2ng/ml TGF-β(R&D Systems，#)，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)4-6天。
內(nèi)胚層祖細胞.為形成內(nèi)胚層祖細胞，將所述單細胞懸液與G5或β-NGF一起在添加了10％血清替代物及層粘連蛋白包被的(10μg/ml)(Sigma，#L2020)，或膠原I包被的(10μg/ml) (Sigma，#C-7661)DMEM/敲除培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。向培養(yǎng)基中添加HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)以替代G5或β-NGF，繼續(xù)培養(yǎng)細胞6-8天。
另外，將Ebs鋪于膠原I包被的培養(yǎng)皿中并且在ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。加入FGF(20ng/ml)使細胞繼續(xù)培養(yǎng)3天。此后，加入HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)6天。
Ebs也轉(zhuǎn)移到層粘連蛋白包被的粘附培養(yǎng)皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)或0.1％明膠包被的35*10mm粘附培養(yǎng)皿中，并且在ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天。棄去該培養(yǎng)基，換成添加了胰島素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纖連蛋白(5μg/ml)(Sigma)的無血清DMEM/F12(Invitrogen，#11330 0321)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基命名為ITSFn培養(yǎng)基。將所述細胞在ITSFn中培養(yǎng)6天，每兩天更換一次培養(yǎng)基。
實施例1(g)由移植的HS細胞發(fā)育和分離純合祖細胞為獲得純合祖細胞，將由上述說明書和實施例的方法所得到的多能HS細胞移植到無免疫應答的小鼠腎囊下，使其在N2培養(yǎng)基(添加了N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256029))的無血清-DMEM/F12培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。進行細胞計數(shù)，然后以2-5X104細胞/孔/400μl N2培養(yǎng)基的密度接種到用聚-L-鳥氨酸(15μg/ml)(Sigma，#P36550)預包被的24孔板，擴增6天。
添加G5，RA，F(xiàn)GF，NGF，GNDF，或BNDF使這些祖細胞進一步分化成不同的神經(jīng)元細胞類型。它們也維持在它們存在的條件培養(yǎng)基中進行細胞擴增。
中胚層祖細胞.為形成中胚層祖細胞，將所述的單細胞懸液在上述添加了10％血清替代物和β-NGF的DMEM/敲除培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，每2/3天更換一次培養(yǎng)基。此后，將所述細胞進一步在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的條件培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10天以形成心臟祖細胞。為形成腎臟和副中腎管祖細胞可使上述細胞在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的條件培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4-6天，然后向其中添加2ng/ml TGF-β(R&D Systems，#)，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)4-6天。
內(nèi)胚層祖細胞.為形成內(nèi)胚層祖細胞，將所述單細胞懸液與G5或β-NGF一起在添加了10％血清替代物及層粘連蛋白包被的(10μg/ml)(Sigma，#L2020)，或膠原I包被的(10μg/ml)(Sigma，#C-7661)DMEM/敲除培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。向培養(yǎng)基中添加HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)以替代G5或β-NGF，繼續(xù)培養(yǎng)細胞6-8天。
另外，將Ebs鋪于膠原I包被的培養(yǎng)皿中并且在ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。加入FGF(20ng/ml)使細胞繼續(xù)培養(yǎng)3天。此后，加入HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)6天。
Ebs也轉(zhuǎn)移到層粘連蛋白包被的粘附培養(yǎng)皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)或0.1％明膠包被的35*10mm粘附培養(yǎng)皿中，并且在ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天。棄去該培養(yǎng)基，換成添加了胰島素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纖連蛋白(5μg/ml)(Sigma)的無血清DMEM/F12(Invitrogen，#11330 0321)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基命名為ITSFn培養(yǎng)基。將所述細胞在ITSFn中培養(yǎng)6天，每兩天更換一次培養(yǎng)基。
實施例1(g)由移植的HS細胞發(fā)育和分離純合祖細胞為獲得純合祖細胞，將由上述說明書和實施例的方法所得到的多能HS細胞移植到無免疫應答的小鼠腎囊下，使其在體內(nèi)生長4-6周。所得的細胞團粉碎成單細胞，在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)以進一步增殖并發(fā)育成細胞系。
對已知的細胞系特異的標記，例如，針對外胚層的NF-H，角蛋白，D-β-H，針對中胚層的烯醇酶，CMP，凝乳酶，激肽釋放酶，WT1，δ-珠蛋白，β-珠蛋白，及針對內(nèi)胚層祖細胞系的白蛋白，α-1-AT，淀粉酶，PDX-1，胰島素，α-FP進行基因表達測定，如RT-PCR，northern印跡，免疫組織化學等，從而評估細胞系定型(祖細胞的類型)。
實施例2.小鼠HS細胞分化成來自中胚層的細胞實施例2(a)分化成造血細胞小鼠HS細胞在ES培養(yǎng)基(DMEM Gibco 1195-065；FBS Gibco16141-079，100μM非必需氨基酸Gibco 11140-050；50單位/ml青霉素-鏈霉素Gibco 15070-063；100μM-巰基乙醇Gibco 21985023)中與LIF(1000IU/ml)共同培養(yǎng)3-5天。利用胰蛋白酶/EDTA(Gibco25300-054，1ml/60mm；培養(yǎng)皿)在37℃下處理5min對所述細胞進行胰蛋白酶處理，然后添加5ml ES培養(yǎng)基。用細胞刮刀將小鼠干細胞從培養(yǎng)皿中取出，將細胞懸液1000rpm離心5min。將所得的細胞顆粒以2×106/10cm的細胞濃度重懸于無LIF但含4.5×10-4MMTG(單硫代甘油Sigma M6145)ES培養(yǎng)基中37℃、5％CO2下，維持4天。懸液中的小鼠HS細胞聚集形成胚狀體(EBs)。
將所形成的30-40個EB轉(zhuǎn)移到35mm培養(yǎng)皿中的3ml基于甲基纖維素的造血細胞分化培養(yǎng)基M3434(Stemcell 03434)中，該培養(yǎng)基包含胎牛血清，牛血清白蛋白，牛胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(鐵飽和的)，β-巰基乙醇，L-谷氨酰胺，rm IL-3，rh IL-6，rmSCF和rh-促紅細胞生成素，在37℃、5％CO2條件下溫育。溫育10天后，用移液頭挑出幾個集落和不同類型的細胞，將其重懸于500μl IMDM培養(yǎng)基(Sigma13390)。將所述混合物轉(zhuǎn)移到4孔腔玻片，將所述玻片在37℃下溫育至少3小時，使所述細胞和集落粘附于玻片上。當細胞粘附于玻片上以后，棄去IMDM培養(yǎng)基，將細胞在甲醇中固定7分鐘。甲醇固定后將所述玻片在空氣中干燥，在室溫下用1∶20稀釋的Giemsa(SigmaGS-500)染色30min，然后用水漂洗三次。培養(yǎng)10天后可觀察到集落和不同類型的造血細胞。用上述方法獲得的CFU(集落形成單位)參見圖5A，紅細胞參見圖5B，單核細胞參見圖5C，淋巴細胞參見圖5D。
在M3434中生長了10-15天的EBs也轉(zhuǎn)移到含有IMDM，10％FBS和單獨的IL-3(Stemcell 02733)或IL-3及GM-CSF(Stemcell 02732)的組合的35mm培養(yǎng)皿中。如上所述對細胞進行固定和染色并觀察在帶有細胞因子的液體IMDM中5天內(nèi)由EBs開始的細胞分化。由含IL-3的IMDM分化的細胞包含粒細胞但無單核細胞，由含IL-3和GM-CSF的IMDM分化的細胞含粒細胞和一些單核細胞(參見圖SE和5F)。
實施例2(b)分化成自發(fā)性收縮肌細胞小鼠HS細胞在ES培養(yǎng)基(DMEM Gibco 1195-065；FBS Gibco16141-079，100μM非必需氨基酸Gibco 11140-050；50單位/ml青霉素-鏈霉素Gibco 15070-063；100μM-巰基乙醇Gibco 21985023)中與LIF(1000 IU/ml)共同培養(yǎng)3-5天。利用胰蛋白酶/EDTA(Gibco25300-054，1ml/60mm；培養(yǎng)皿)在37℃下處理5min對所述細胞進行胰蛋白酶處理，然后添加5ml ES培養(yǎng)基。用細胞刮刀將小鼠干細胞從培養(yǎng)皿中取出，將細胞懸液1000rpm離心5min。將所得的細胞顆粒以2×106/10cm的細胞濃度重懸于無LIF的ES培養(yǎng)基中37℃、5％CO2下，維持4天。懸液中的小鼠HS細胞聚集形成胚狀體(EBs)。
10-15個形成的EBs轉(zhuǎn)移到用明膠包被的24孔板(每孔加入1ml0.1％明膠在通風櫥中放置2小時以上。去除明膠使所述板干燥30min)在無LIF的ES培養(yǎng)基中溫育，每兩天更換一次培養(yǎng)基。在第4天前后，自發(fā)收縮細胞或搏動Ebs出現(xiàn)并持續(xù)搏動達3-4天(參見圖6)。
此外，搏動EBs可在37℃和5％CO2條件下于稱作M3434(Stemcell03434)的包含下列組分的半固體培養(yǎng)基(含1％甲基纖維素)中溫育而誘導產(chǎn)生，所述組分為胎牛血清，牛血清白蛋白，牛胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白(鐵飽和的)，β-巰基乙醇，L-谷氨酰胺，rm IL-3，rh IL-6，rm SCF和rh-紅細胞生成素。溫育3-4天后可觀察到搏動EBs。
搏動EBs也可通過使EB在37℃和5％CO2的條件下在無血清ITSFn培養(yǎng)基中溫育4天而形成，該培養(yǎng)基包含含有胰島素(5μg/ml，Sigma11882)，氯化硒(30nM，Sigma S5261)和纖連蛋白(5μg/ml，SigmaF1141)的DMEM/F12(Gibco 11320-033)。
實施例3.小鼠HS細胞分化成來源于內(nèi)胚層的細胞實施例3(a)分化成胰腺細胞將與原代胚胎成纖維細胞層一起生長在60mm培養(yǎng)皿(Falcon，#353802)和/或0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿中的HS細胞經(jīng)1.5ml胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，#25300-050)胰蛋白酶化，然后轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中的1.5ml ES-LIF培養(yǎng)基中。1000rpm將細胞離心下來，然后棄上清。
將所得細胞顆粒狀沉淀重懸于2ml ES-LIF培養(yǎng)基中制成單細胞懸液，作為懸浮細胞以1-3×106細胞的密度于懸浮培養(yǎng)-35*10mm培養(yǎng)皿(NalgeNunc，#171099)中培養(yǎng)4-6天，使干細胞長成圓球形的簇，稱作胚狀體(EBs)。每兩天將形成中的Ebs轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中進行洗滌，然后使細胞沉到管底。棄上清加入新的ES-LIF。然后將EBs轉(zhuǎn)回到懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)皿中。HS細胞長成的胚狀體包含全部三個生殖細胞層，外胚層，內(nèi)胚層，和中胚層。
胰腺前體細胞的篩選.作為胚狀體培養(yǎng)4-6天后，將所述細胞轉(zhuǎn)移到15ml錐形管使其沉降。去除一半培養(yǎng)基向管中添加1.5ml新鮮的ES-LIF培養(yǎng)基，然后將管中的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到0.1％明膠包被的35*10mm粘附培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)。第二天，去除ES-LIF培養(yǎng)基，換成添加了胰島素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纖連蛋白(5μg/ml)(Sigma)的無血清DMEM/F12(Invitrogen，#113300321)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基命名為ITSFn培養(yǎng)基。將所述細胞在ITSFn中培養(yǎng)6天，每兩天更換一次培養(yǎng)基培養(yǎng)基。
EBs也在層粘連蛋白包被的粘附培養(yǎng)皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)中的ES-LIF培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天使內(nèi)胚層細胞從胚狀體中遷移出來，在添加了下述成分的8.7mM葡萄糖DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中擴增4天，所添加的成分為N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen目錄#I750444)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256-029)。內(nèi)胚層擴增后，將所述培養(yǎng)基換為ITSFn培養(yǎng)基，使所述細胞在ITSFn中培養(yǎng)6天，每兩天更換一次培養(yǎng)基以篩選胰腺前體細胞。
或者，4-6天后，將EB用1ml胰蛋白酶/EDTA進行胰蛋白酶消化，在ES-LIF培養(yǎng)基中洗滌，然后在添加了10％血清替代物(Invitrogen，#10828)，和G5(Invitrogen，#17503)，N2(Invitrogen，#17502-048)或βNGF(100ng/ml)(R&D Systems，#256-GF)的DMEM/敲除培養(yǎng)基(Invitrogen，#10829-018)中重懸成單細胞。將這些細胞以3-5×105/3ml在纖連蛋白包被的35mm培養(yǎng)皿(50μg/ml)(Sigma，#F-0895)中培養(yǎng)4-6天，每2天更換一次培養(yǎng)基。4-6天后，加入ITSFn培養(yǎng)基替換DMEM/敲除培養(yǎng)基，將所述細胞繼續(xù)培養(yǎng)6天以篩選胰腺前體細胞。
胰腺前體細胞對于早期標記Nestin，neurogenin 3，和酪氨酸羥化酶是陽性的。
由bFGF擴增胰腺前體細胞.去除培養(yǎng)基后，用PBS將ITSFn培養(yǎng)基中的細胞洗兩次。加入1mL胰蛋白酶/EDTA，使細胞在37℃下溫育5min以引起解離。利用細胞刮刀使細胞進一步解離。然后向培養(yǎng)皿中加入3ml ES-LIF培養(yǎng)基，再將全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中。使由胰腺前體篩選剩余的EBs沉降約2-5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的15ml錐形管，1200rpm離心。棄上清，將所得細胞顆粒狀沉淀重懸于5.8mM或更低濃度葡萄糖，添加了N2(Invitrogen，#17502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256-029)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基稱作N2培養(yǎng)基。
細胞計數(shù)并以2-5×105細胞/孔/400uL N2培養(yǎng)基的密度接種于用聚-L-鳥氨酸(15ug/ml)(Sigma，#P36550)預包被的24孔板，擴增6-8天?；蛘?，以2-5×104細胞/孔/400ul N2培養(yǎng)基的密度接種，擴增8-10天。
預包被方法如下在24-孔板的每個孔中加入400μl 15ug/ml聚-L-鳥氨酸在室溫下放置過夜；然后用PBS洗兩次，加入新鮮的PBS在37℃下溫育30min；用PBS洗板，加入400μl纖連蛋白(10μg/ml)，使用前在室溫下至少溫育2小時。
胰腺前體細胞分化成分泌胰島素的β-胰島細胞通過從N2培養(yǎng)基中去除bFGF，并在100ng/ml EGF(Invitrogen，#53003-018)，20ng/ml HGF(Sigma，#H1404)，和20ng/ml活化素A(Sigma，#A4941)或20ng/ml VEGF(R&D Systems，#298-VS)存在下誘導胰腺前體細胞分化成分泌胰島素的β胰島細胞。使細胞分化6天，每兩天更換一次培養(yǎng)基。一旦開始分化，所述的上皮胰腺細胞形成小的圓形細胞，其可迅速增殖形成組織化的細胞簇，表現(xiàn)為平滑的球體，參見圖7A。
分泌胰島素的β胰島細胞的檢測.為檢測胰島素的產(chǎn)生和分泌，去除分化培養(yǎng)基，替換為添加了10mM尼克酰胺，.015nM氯化硒，50ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，.1mM腐胺(Sigma，#P5780)，和20nM孕酮(Sigma，#P8783)的高葡萄糖的DMEM/F12。然后將這些細胞在37℃下溫育3h。3小時后，收集每孔中的培養(yǎng)基于-70℃保存以進行胰島素釋放測定，將每孔中的細胞在4％低聚甲醛(EMS，#15712)中室溫下固定30min以進行免疫細胞化學測定，或通過RNAzol(Tel-Test，Inc.，F(xiàn)riendswood，TX，#CS-105)從每孔中收集RNA以進行基因表達的RT-PCR分析。在一些實驗中，通過4℃下酸-乙醇提取過夜測定上述胰腺球體簇中的胰島素含量，替代免疫組織化學或RT-PCR。收集無細胞提取物用0.4MTris-堿中和，貯存于-70℃以備進行胰島素含量測定。
免疫組織化學室溫下在4％低聚甲醛中固定30min后將細胞在PBS(Biofluids，#P312-500)中洗3次。室溫下將這些細胞在100％甲醇(Fischer Scientific，#HC400 1gal)中進一步固定并透化5min。然后將所述細胞再在PBS中洗3次并用封閉溶液(DAKO Envision雙染色系統(tǒng)，#K1395)封閉5min。排除過量的封閉緩沖液，加入第一抗體使細胞在室溫下溫育2小時。對于胰島素，所用的第一抗體是多克隆豚鼠抗-胰島素(DAKO，#A0564)1∶50的稀釋液。所用的稀釋液是用培養(yǎng)基B(Caltag，#GAS002)配制的。
將所述細胞用PBS漂洗3次，加入HRP-偶聯(lián)的第二抗體(第2瓶)(DAKO，#K1395)，使細胞溫育30min。用PBS將細胞漂洗3次，吸去過量的液體，加入液體的DAB+發(fā)色團底物(第3瓶)5-10min。最后再用PBS將細胞漂洗一次，在顯微鏡下鏡檢，參見圖7B。
依照DAKO Envision雙染色方案，(參見圖7B)雙染色胰高血糖素，1∶300(DAKO，#A0565)。也利用Pa×6，1∶300(Covance，#PRB-278P)，和抗體標記其他的細胞類型。供選擇地，所有的免疫染色都是用熒光染料偶聯(lián)的第二抗體(Sigma，Molecular Probes，或JacksonLabs)并在Leica倒置熒光顯微鏡下目測檢查。
胰島素的釋放和細胞含量檢測試驗為測定胰島素蛋白或胰腺球狀簇中的胰島素含量，對培養(yǎng)基或由每孔中收集的乙醇提取物進行酶聯(lián)免疫分析，ELISA，(Crystalchem，Chicago，Illinois)。
實施例3(b)HS細胞分化成肝細胞下述的由HS細胞分化成肝細胞的方案是依照Hamazaki等″Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cell invitro″，F(xiàn)EBS Lett.497(1)15-9(2001)。
純合干細胞鋪于組織培養(yǎng)皿(FALCON 35-3802，60×15mm規(guī)格，聚苯乙烯，無致熱源的，Becton Dickinson Labware)上干細胞培養(yǎng)基中的經(jīng)絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細胞(STO細胞)上，所述培養(yǎng)基在添加了非必需氨基酸，青霉素-鏈霉素(Life Technologies)，β-巰基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培養(yǎng)基中含20％胎牛血清(Life technologies)。所述細胞在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)過夜。然后將HS細胞用胰蛋白酶-EDTA(0.05％-0.5％)(Life Technologies)進行胰蛋白酶消化，在懸浮培養(yǎng)皿(有蓋和通風孔的懸浮培養(yǎng)皿，NalgeNunc International，171099，35×10mm)中培養(yǎng)，以形成胚狀體，在不含LIF的同種培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。形成的胚狀體轉(zhuǎn)移到0.1％I型膠原(Sigma，C7661)包被的24孔板(Corning Incocrporated/Costar3524，24孔細胞培養(yǎng)板/平底，有蓋/非無致熱源的聚苯乙烯)中的含100ng/ml酸性成纖維細胞生長因子(Sigma，F(xiàn)-3133)的無LIF的干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。
3天后用含20ng/ml肝生長因子(Sigma，H-1404)的無LIF干細胞培養(yǎng)基替換上述的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天，然后轉(zhuǎn)入含有10ng/ml OSM(Sigma，0-9635)，10μM地塞米松(Sigma，D-6645)，5μg/ml亞硒酸(Aldrich，22985-7)，50μg/ml胰島素(Invitrogen，I-1882)，和50μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma，T-2036)的無LIF干細胞培養(yǎng)基中。然后分析分化細胞的肝特異基因表達。所分析的基因，PCR退火溫度，預期產(chǎn)物大小，和RTPCR引物序列如下運甲狀腺素蛋白(TTR)55℃，225bp，5-CTC ACC ACA GAT GAGAAG，5-GGC TGA GTC TCT CAA TTC；α-胎蛋白(AFP)55℃，173bp，5-TCGTAT TCC AAC AGG AGG，5-AGG CTT TTG CTT CAC CAG；α-1抗-胰蛋白酶(AAT)，55℃484bp，5-AAT GGA AGA AGC CAT TCG AT，5-AAG ACT GTAGCT GCT GCA GC；白蛋白(ALB)，55℃260bp，5-GCT ACG GCA CAG TGCTTG，5-CAG GAT TGC AGA CAG ATA GTC；葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)55℃210bp，5-CAG GAC TGG TTC ATC CTT，5-GTT GCT GTA GTA GTC GGT；酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)，50℃206bp，5-ACC TTC AAT CCC ATCCGA，5-TCC CGA CTG GAT AGG GTA G；β-肌動蛋白55℃，200bp，5-TTCCTT CTT GGG TAT GGA AT，5-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC；和SEK150℃，300bp，5-TGT ATG GAG CTC ATG TCT ACC；5-GTC TAT TCT TTC AGGTGC CA。
實施例4.小鼠HS細胞分化成外胚層細胞實施例4(a)分化成神經(jīng)元前體細胞和功能性有絲分裂后神經(jīng)細胞在一個實施方案中，誘導HS細胞形成神經(jīng)元前體細胞。由HS細胞衍生的神經(jīng)上皮前體細胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，并且進一步的分化導致多種類型的神經(jīng)元-特異基因的表達，及產(chǎn)生興奮和抑制性突觸連接。在ES細胞中可見的位置特異的神經(jīng)標記的表達方式表明存在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元細胞類型。通過類推的方法，可知HS細胞也可產(chǎn)生可有效地分化成多種CNS結(jié)構(gòu)的功能性有絲分裂后神經(jīng)元的神經(jīng)元前體細胞。
用Okabe等的方法引發(fā)HS細胞分化成多種神經(jīng)元細胞和神經(jīng)元(Okabe等，Mech.Dev.5989-102(1996))。
材料所用材料購自下述來源纖連蛋白，層粘連蛋白，神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B27添加物，和superscrip tII RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶購自Gibco/BRL(Grand Island，NY)；bFGF購自R&D Systems(Minneapolis，MN)；胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，氯化硒，聚鳥氨酸，孕酮，腐胺，T3，阿糖胞甙，抗-MAP2抗體，抗-NF-M抗體，抗-GABA抗體，和抗-谷氨鹽抗體購自Sigma(St.Louis，MO)；Taq聚合酶購自Bushranger-Mannheim(Mannheim，Germany)；抗-GFAP抗體購自ICNBiomedicals(Costa Mesa，CA)；抗角蛋白8抗體購自ATCC(Rockville，MD)；Vectastain ABC試劑盒購自Vectorlaboratories(Burlingame，CA)；雙染色試劑盒和氨基-乙基咔唑購自Zymed Laboratories Inc.(Carlton Court，CA)抗磷酸化CREB抗體購自Upstate Biotechnology Inc.(Lake Plac id，NY)；BrdU染色試劑盒購自Amersham(Arlington Heights；IL)；熒光第二抗體購自Cappel(Durham，NC)。
Nestin-陽性細胞的篩選將在ES培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)物中(參見前述實施例中的培養(yǎng)基成分)保存4天的HS細胞簇(或EBs)轉(zhuǎn)移到15ml管中。待EBs沉降后，去除一半ES培養(yǎng)基，向起始的培養(yǎng)皿中加入2.5ml新鮮的ES培養(yǎng)基。用ES培養(yǎng)基漂洗培養(yǎng)皿，然后加入到同一個15ml管中。EBs轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)皿中。24小時后更換ES培養(yǎng)基，加入含纖連蛋白(FN)，(按下述方式小心制備25μl儲液/5ml培養(yǎng)基，即將ES細胞-合格的水加入5mg FN(1mg/ml)并4℃下靜置于30min)的ITS培養(yǎng)基。(500ml ITS培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)(Gibco12500-039)6g；胰島素(Intergen 4501-01)2.5mg溶解于0.5ml無菌H2O和5mcl 10N NaOH；30mcl氯化硒(0.5mM)；0.775g葡萄糖；0.0365g谷氨酰胺；1.2g NaHCO3；和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma T-2036)25mg；pH7.5；5ml 100X P/S.)。
將細胞在含F(xiàn)N的ITS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天，每兩天更換一次培養(yǎng)基；圖9A表示培養(yǎng)6天后的nestin-陽性細胞。
通過bFGF擴增Nestin-陽性細胞保持在ITS/FN培養(yǎng)基中的細胞用PBS洗兩次。1ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.04％EDTA)加入培養(yǎng)基中，使所述細胞在37℃下保持5分鐘使細胞解離。加入5mlES培養(yǎng)基(如前述實施例所述)，將細胞轉(zhuǎn)移到15ml管中。
首先使EBs沉降，然后離心收集。將細胞顆粒狀沉淀重懸于5ml含B27培養(yǎng)基添加物(B27無血清添加物50X，液體，Gibco 17504-44)的N2培養(yǎng)基中(N2培養(yǎng)基500mlf12/DMEM 6g；葡萄糖0.775g；谷氨酰胺0.0365g；NaHCO30.845g；胰島素0.0125g；1M腐胺(儲液)50μl(終濃度100uM)；0.5mM亞硒酸鹽(儲液)30mcl(終濃度30nM；0.1mM孕酮(儲液)100mcl(終濃度20nM)；調(diào)整到PH7.2；5ml100XP/S.)。
細胞計數(shù)，然后以5×105細胞/孔的密度將細胞接種于24孔板(400mcl N2培養(yǎng)基)或5-7×106細胞/皿接種于6cm培養(yǎng)皿中(3ml N2培養(yǎng)基)，用聚-L-鳥氨酸(15μgml-1)和層粘連蛋白(1μgml-1)預包被的培養(yǎng)皿，均購自Bector Dickinson Labware，Bedford，MA.(預包被方案每孔(24孔板)插入無菌的蓋片(assistent 1001/0012，12mm)；然后加入400μl聚-L-鳥氨酸(15μg/mT′)用PBS由1000X儲液稀釋，保持過夜；用PBS洗板，然后加入新鮮的PBS，將板置于37℃30min；再次用PBS洗板，然后加入400ul FN(1ug/ml)，再用PBS由1000X儲液稀釋；將板置于37℃至少2小時)。
添加含10-20ng/ml-1bFGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)和B27添加物的N2培養(yǎng)基至鋪板的細胞，使所述細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，每2天更換一次培養(yǎng)基。用含0.05％胰蛋白酶和0.04％EDTA的PBS解離細胞，離心收集重新涂布。
通過bFGF擴增的Nestin陽性細胞的分化.從細胞培養(yǎng)物中去除bFGF誘導細胞分化。使細胞簇在添加了層粘連蛋白(1mg ml-1)，存在或不存在購自Sigma，St.Louis，MO的cAMP(1mM)和AA(200uM)的N2培養(yǎng)基中鋪開3-4天。將細胞在分化條件下溫育6-15天。
免疫組織化學用含2％低聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(PBS；pH7.4)固定細胞20-30min，用0.2％Triton X-100PBS透化，用5％的正常山羊血清處理。然后將所述細胞與針對nestin(1∶1000；自Dr.M.Marvin，NIH)的第一抗體一起溫育30min至1h。細胞也可以與針對角蛋白8(1∶1000)，腦脂肪酸結(jié)合蛋白(1∶1000)，MAP2(1∶200)，NF-M(1∶100)，突觸素I(1∶1000)，GFAP(1∶50)，04，GalC(產(chǎn)生細胞的上清液)，GABA(1∶1000)，和谷氨酸鹽(1∶500)的第一抗體一起溫育。用PBS洗細胞，然后用Vectastain ABC試劑盒的方法加工細胞。
對于用MAP2和NF-M進行雙免疫熒光染色，先將細胞固定再用Triton X-100透化，再用NGS以類似的方式處理。然后用單克隆抗-MAP2抗體然后是熒光標記的抗-小鼠IgG溫育細胞，再次用2％低聚甲醛固定30min。再固定后用抗-NF-M抗體，然后是羅丹明標記的抗-小鼠IgG溫育細胞。第二次固定排除了羅丹明偶聯(lián)的抗-小鼠IgO與抗-MAP2單克隆抗體的交叉反應。
為利用酶聯(lián)第二抗體進行雙標記免疫細胞化學分析，依照雙染色試劑盒(Zymed Laboratories，Inc.)的說明進行。利用抗磷酸化CREB抗體(1∶1000)的染色技術(shù)如Ginty等(1993)所述。
增殖測定.用BrdU在37℃下將細胞溫育8h。溫育后立即將細胞固定，然后依照BrdU染色試劑盒的說明操作。顏色反應后，用0.8％過氧化氫和5％NGS PBS溫育細胞30min以滅活HARP活性。徹底清洗后，將細胞進行抗-nestin或抗-MAP2抗體染色，在細胞質(zhì)中產(chǎn)生利用氨乙基咔唑顯現(xiàn)的微紅反應物。
200X放大對每視野的細胞計數(shù)以確定細胞密度。每個樣品分析8個視野，校正并平均細胞密度。
RT-PCR.利用Chomczynski和Sacchi(Chomczynski andSacchi，Anal Biochem 162156-159(1987))所述的方法提取每一細胞制備物的總RNA。用無DNA酶的RNA酶處理總RNA。依照superscript II RNA酶H-逆轉(zhuǎn)錄酶的說明合成cDNA。在含0.2mMdNTP，正反向引物各0.3uM，及0.25UTaq聚合酶的PCR反應緩沖液(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，1.5mM MgCl2，0-001％(w/v)明膠)中進行PCR反應。循環(huán)參數(shù)為90℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸60s。每一引物對循環(huán)次數(shù)的確定是根據(jù)使擴增處于指數(shù)期內(nèi)。
基因組DNA的擴增可根據(jù)產(chǎn)物肌動蛋白-NMDARI，NMDAR2D，鈣結(jié)合蛋白D28，GAD65，GABAAa3，AMPA受體的大小區(qū)分。對于其他的引物，對照擴增在無逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下觀察是否有其他基因組DNA擴增。應當在對照試驗中觀察不到任何基因組DNA的擴增。
電生理學.在室溫下用含130mM醋酸鉀(或120 CsCl+10KCl)，10mM HEPES，2mM MgCl2，1mM ATP，0.1mM EGTA，10mM NaCl的3-6M歐姆膜片鉗移液管記錄細胞，然后用KOH調(diào)pH至7.2，再用蔗糖調(diào)克分滲透壓濃度至300mosM。記錄的鹽水含130mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES，和10mM葡萄糖。用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至320mosM，用NaOH調(diào)pH至7.4。利用壓力通過置于記錄細胞旁或在視野中的臨近細胞旁(范圍在記錄細胞的100μm之內(nèi))的微移液管施用谷氨酸(在記錄的鹽水中為1mM)。電流信號通過Axopatch放大器放大，儲存于IBM計算機中利用pClamp-6軟件分析。
電子顯微鏡.塑料培養(yǎng)皿中的細胞用含2％低聚甲醛和1％戊二醛的PBS固定1h。用水洗細胞，用1％OsO4固定，用醋酸鈾酰封閉染色，乙醇脫水，Araldite樹脂包埋。在JEOL 1200 EX電子顯微鏡下觀察薄切片樣品。
對分化的神經(jīng)元培養(yǎng)物的刺激在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分化的細胞及B27和5％FCS在含10μM谷氨酸或NMDA的相同培養(yǎng)基中溫育10min。經(jīng)磷酸-CREB染色后立即將細胞固定。刺激后溫育細胞50min，提取RNA用于c-fos誘導分析。
實施例4fb)分化成酪氨酸羥化酶陽性的神經(jīng)元細胞在下述的若干分化步驟后，在體外HS細胞能產(chǎn)生酪氨酸羥化酶。如實施例1(d)中所述，在4天中形成Ebs，然后鋪于ES細胞培養(yǎng)基中的粘附組織培養(yǎng)物表面。
培養(yǎng)24小時后，用無血清胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒/纖連蛋白(ITSFn)培養(yǎng)基替換ES細胞培養(yǎng)基從而開始篩選nestin-陽性的細胞，上述培養(yǎng)基含DMEM/F12(1∶1)，添加了胰島素(Sigma I1882)的Gibco11320-0335μg/ml，氯化硒(Sigma S5261)30nM和纖連蛋白(SigmaF 1141)5μg/ml。
nestin篩選6-10天后，細胞擴增開始。特異的，用0.05％胰蛋白酶/0.04％EDTA解離細胞，鋪于塑料或玻璃的組織培養(yǎng)蓋片上，所述的蓋片用15μg/ml聚鳥氨酸(Sigma，P3655)和1μg/ml層粘連蛋白(Sigma，L2020)預包被，于N2培養(yǎng)基中濃度為1.5-2×105細胞cm-2，該培養(yǎng)基含DMEM/F12(1∶1)，添加了N2添加物的Gibco 11320-033(100X，Gibco 17502-048)，20μg/ml胰島素，1μg/ml層粘連蛋白(Sigma，L2020)，10ng/ml bFGF(R&D Systems，233-FB)，500ng/ml鼠N-末端SHH片段(R&D Dsystems，461-SH)和100ng/ml鼠FGF8同工型b(R&D Systems，423-F8)，每兩天更換一次培養(yǎng)基。
從上述培養(yǎng)基中去除bFGF以誘導酪氨酸羥化酶陽性細胞分化，用層粘連蛋白(1mg/ml)，在存在或不存在1M cAMP(Sigma，A6885)，200M抗壞血酸(Sigma，A5960)的條件下進行細胞擴增。在分化條件下溫育細胞6-15天。
為檢測酪氨酸羥化酶陽性細胞，誘導的HS細胞培養(yǎng)物用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)漂洗一次，用4％低聚甲醛(Electron MicroscopySciences，15712)固定30min。然后將固定后的細胞用PBS漂洗3次，再用甲醇處理5min。
經(jīng)甲醇處理的細胞再用PBS漂洗3次，再用Envision+系統(tǒng)(Dako，K4010)的封閉溶液(第1瓶)封閉5min。
排除過量的封閉緩沖液，加入第一抗體兔抗酪氨酸羥化酶(PelFreez，P40101-0，1∶300，溶于PBS)施用于所述細胞，然后在室溫下溫育60min。
經(jīng)第一抗體染色的細胞用PBS漂洗3次，應用Envision+系統(tǒng)的第二抗體標記的聚合物(第2瓶)覆蓋細胞培養(yǎng)物并在室溫下溫育30min。
用PBS將用第二抗體染色的細胞漂洗3次，應用Envision+系統(tǒng)的液體DAB+底物(第3瓶)覆蓋細胞培養(yǎng)物并溫育5min。最后再用PBS漂洗3次。在顯微鏡下觀察酪氨酸羥化酶陽性細胞(參見圖9B，該圖表明篩選6天后的nestin-陽性細胞)。
權(quán)利要求
1.分離的純合干細胞(HS)。
2.來源于人的分離的純合干細胞(HS)。
3.來源于非人物種的分離的純合干細胞(HS)。
4.如權(quán)利要求3所述的分離的純合干細胞3，其中所述的非人物種選自小鼠，倉鼠、狗、貓、兔、雪貂、水貂、豚鼠、刺猬、牛、綿羊、山羊、美洲駝、馬、鹿、豬、猴，和猿。
5.由下述方法獲得的分離的純合干細胞，所述方法包括(a)通過下述步驟產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的自我復制；或?qū)蓚€精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中；(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成胚泡樣團；和(c)由所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞。
6.如權(quán)利要求5的方法獲得的分離的純合干細胞，該方法進一步包括在通過(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合，或(b)將兩個精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中產(chǎn)生有絲分裂激活的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞時，通過基因型分析篩選純合的干細胞。
7.產(chǎn)生純合干細胞的方法，該方法包括(a)通過下述步驟產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的自我復制；或?qū)蓚€精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中；(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成胚泡樣團；和(c)由所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，進一步包括在通過(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合，或(b)將兩個精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中產(chǎn)生有絲分裂激活的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞時，通過基因型分析篩選純合的干細胞。
9.制備所需祖細胞、分化細胞、分化細胞群、或組織類型的方法，該方法包括誘導分離的純合干細胞在適當?shù)臈l件下分化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的分化通過在培養(yǎng)基中加入調(diào)節(jié)因子、激素或細胞因子而實現(xiàn)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是角質(zhì)化上皮細胞。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的角質(zhì)化上皮細胞選自表皮角質(zhì)細胞，表皮基底細胞，指甲和/或趾甲角質(zhì)細胞，甲床基底細胞，毛干細胞，毛根鞘細胞，和毛基質(zhì)細胞。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是濕復層屏障上皮細胞。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是特化用于外分泌的上皮細胞。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是特化用于分泌激素的細胞。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是腸、外分泌腺或泌尿生殖道的上皮吸收性細胞。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是特化用于代謝和儲存的細胞。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是襯墊肺、腸、外分泌腺或泌尿生殖道或作為屏障的上皮細胞。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是襯墊封閉內(nèi)部體腔的上皮細胞。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是有推進功能的纖毛細胞。
21.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群特化用于分泌胞外基質(zhì)的細胞。
22.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是收縮細胞。
23.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是血液和免疫系統(tǒng)的細胞。
24.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是感覺傳導器。
25.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是自主神經(jīng)元。
26.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是感覺器官和周圍神經(jīng)元的支持細胞。
27.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
28.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是晶狀體細胞。
29.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是色素細胞。
30.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是生殖細胞。
31.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是撫育細胞。
32.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所需細胞或細胞群是來自包括外胚層，內(nèi)胚層或中胚層的胚生殖層之一。
33.產(chǎn)生祖細胞的方法，該方法包括(a)通過下述步驟產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的自我復制；或?qū)蓚€精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中；(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成胚泡樣團；(c)由所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞；和(d)誘導所述的純合干細胞分化以產(chǎn)生祖細胞。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，進一步包括在通過(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合，或(b)將兩個精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中產(chǎn)生有絲分裂激活的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞時，通過基因型分析篩選純合的干細胞。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，進一步包括分離所述祖細胞，并維持永久性的祖細胞系。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，在沒有未分化的干細胞存在下誘導來自所述胚泡樣團的細胞分化。
37.產(chǎn)生遺傳改變的祖細胞的方法，包括(a)在HS細胞中插入，去除或修飾所需基因以創(chuàng)建遺傳改變的HS細胞，和(b)誘導所述遺傳改變的HS細胞分化。
38.產(chǎn)生遺傳改變的祖細胞的方法，包括(a)在HS細胞中插入，去除或修飾所需基因以創(chuàng)建遺傳改變的HS細胞，和(b)誘導所述遺傳改變的祖細胞長成遺傳改變的祖細胞。
39.如權(quán)利要求9，33或37所述的方法，其中，在平面粘附環(huán)境下誘導所述的純合干細胞分化。
40.如權(quán)利要求9，33或37所述的方法，其中，在3D粘附環(huán)境下誘導所述的純合干細胞分化。
41.如權(quán)利要求9，33或37所述的方法，其中，在微重力環(huán)境下誘導所述的純合干細胞分化。
42.如權(quán)利要求9，33或37所述的方法，其中，通過在免疫缺陷的小鼠中產(chǎn)生干質(zhì)而誘導所述的純合干細胞分化。
43.如權(quán)利要求9，33或37所述的方法，其中，所述的祖細胞能分化成來自三個胚層，即外胚層，中胚層，和內(nèi)胚層之一的多種組織及細胞。
44.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者。
45.一種治療方法，該方法包括施用如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞以治療選自下組的疾病或狀況帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈病，阿爾茨海默病，ALS，脊髓缺陷或損傷，多發(fā)性硬化，肌肉萎縮，囊性纖維化，肝病，糖尿病，心臟病，軟骨缺陷或損傷，燒傷，足潰瘍，血管病，尿道疾病，AIDS和癌癥。
46.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者，其中，所述的患者是人，而所述細胞來自動物。
47.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者，其中，所述的患者是動物，所述細胞來自人。
48.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者，其中，所述的患者是人，所述細胞來自人。
49.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者，其中，所述的患者是動物，所述細胞來自動物。
50.一種治療方法，該方法包括將如權(quán)利要求9，33，37，或38所述的方法獲得的細胞施用于需進行治療的患者，其中，所述的患者是人，而所述細胞是人細胞。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述的來自人的細胞是異基因的。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述的來自人的細胞是同基因的。
53.來源于下述方法的祖細胞，該方法包括(a)產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞；(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成胚泡樣團；和(c)由所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞；和(d)誘導所述的純合干細胞分化以產(chǎn)生祖細胞。
54.來自權(quán)利要求53的方法的祖細胞，該方法進一步包括在通過(a)將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合，或(b)將兩個精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中產(chǎn)生有絲分裂激活的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞時，通過基因型分析篩選純合的干細胞。
55.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，進一步包括分離所述的祖細胞并將其維持為永久性細胞系。
56.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，在沒有未分化的干細胞存在下誘導來自所述胚泡樣團的細胞分化。
57.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，在平面粘附條件下誘導來自所述胚泡樣團的純合干細胞分化。
58.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，在3D粘附條件下誘導來自所述胚泡樣團的純合干細胞分化。
59.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，在微重力條件下誘導來自所述胚泡樣團的純合干細胞分化。
60.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，通過在免疫缺陷小鼠中產(chǎn)生干質(zhì)而誘導來自所述胚泡樣團的純合干細胞分化。
61.如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，所述的祖細胞能分化成三個胚層，即外胚層，內(nèi)胚層或中胚層之一。
62.一種治療方法，包括向需要進行治療的患者施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞。
63.一種治療方法，包括施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞，以治療選自下組的疾病或狀況帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈病，阿爾茨海默病，ALS，脊髓缺陷或損傷，多發(fā)性硬化，肌肉萎縮，囊性纖維化，肝病，糖尿病，心臟病，軟骨缺陷或損傷，燒傷，足潰瘍，血管病，尿道疾病，AIDS和癌癥。
64.一種治療方法，包括向需要進行治療的患者施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，所述的患者是人，所述的分化細胞來自于動物。
65.一種治療方法，包括向需要進行治療的患者施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，所述的患者是動物，所述的分化細胞來自于人。
66.一種治療方法，包括向需要進行治療的患者施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，所述的患者是動物，所述的分化細胞來自于動物。
67.一種治療方法，包括向需要進行治療的患者施用如權(quán)利要求53所述的祖細胞，其中，所述的患者是人，所述的分化細胞來自于人。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，來自于人的細胞是異基因的。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中，來自于人的細胞是同基因的。
70.一種來自下述方法的純合干細胞，該方法包括(a)通過下述步驟產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的自我復制；或?qū)蓚€精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成被透明帶環(huán)繞的胚泡樣團；(c)用輔助孵化的方法使所述胚泡樣團從所述透明帶中釋放出來；和(d)從所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞。
71.如權(quán)利要求70所述的分離的干細胞，其中的輔助孵化的方法包括將所述的胚泡樣團固定在顯微操作器上，所述顯微操作器有兩個臂，一個臂控制所述胚泡樣團于固定位置，另一個臂將酸化的臺氏液施用于相當于所述透明帶總面積約1/8的區(qū)域的透明帶表面，使所述透明帶弱化并將胚泡樣團釋放出來。
72.一種來自下述方法的純合干細胞，該方法包括(a)通過下述步驟產(chǎn)生有絲分裂激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞將兩個卵母細胞或兩個精子細胞融合；在卵子發(fā)生過程中阻止第二極體擠出；在適當?shù)臈l件下允許第二極體擠出和自發(fā)的自我復制；或?qū)蓚€精子或兩個單倍體卵核轉(zhuǎn)移至去核卵母細胞中(b)培養(yǎng)所述激活的純合的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞以形成被透明帶環(huán)繞的胚泡樣團；(c)在激活后第2天將所述激活的減數(shù)分裂I后的二倍體生殖細胞轉(zhuǎn)移到經(jīng)絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層細胞上直至胚泡樣團形成；(d)用輔助孵化的方法使所述胚泡樣團從所述透明帶中釋放出來；和(e)從所述胚泡樣團的內(nèi)細胞團分離純合干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開并描述了多能純合干(HS)細胞及制備所述細胞的材料和方法。本發(fā)明還提供用于使HS細胞分化成祖(多能)細胞或其他所需細胞、細胞群或組織的方法。此外，在此公開的HS細胞可用于，包括(但不限于)診斷和治療多種疾病(例如，遺傳疾病，神經(jīng)變性疾病，內(nèi)分泌相關(guān)的紊亂和癌癥)，創(chuàng)傷，并可用于美容和治療性移植，以及基因治療和細胞替代治療。
文檔編號A61K35/12GK1643135SQ01822395
公開日2005年7月20日 申請日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月30日
發(fā)明者W·L·顏, J·雷, H·林, R·坎納, S·C·-W·黃, M·-T·阮 申請人:斯坦姆榮公司