專利名稱：：源于人單性生殖胚泡的患者特異性干細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性地涉及胚胎干細(xì)胞，以及更具體地涉及獲得HLA純合單性生殖人干細(xì)胞系進(jìn)行基于細(xì)胞的治療的方法。
背景技術(shù)：
：最初的人胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESC)源于獲自受精卵母細(xì)胞的胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass,ICM)，其能夠無限分裂并分化成所有組織類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是多能細(xì)胞的潛在的無限來源，所述多能細(xì)胞用于基于移植的細(xì)胞治療。人胚胎干細(xì)胞(ES)細(xì)胞是多能細(xì)胞，其可分化成大量細(xì)胞類型。當(dāng)注射到免疫缺陷鼠中時(shí)，胚胎干細(xì)胞形成分化的腫瘤(畸胎瘤)。但是，被體外誘導(dǎo)以形成胚狀體(embryoidbodies,EBs)的胚胎干細(xì)胞提供了胚胎干細(xì)胞系的來源，其在某些生長(zhǎng)條件下被控制分化成表征幾種組織的多種細(xì)胞類型。例如，在神經(jīng)生長(zhǎng)因子和視黃酸存在的情況下，ES細(xì)胞分化成神經(jīng)元。如果免疫排斥的問題可以解決，則人胚胎干細(xì)胞具有給予患者顯著治療益處的潛能。與受體(recipient)遺傳相關(guān)的胚胎干細(xì)胞可克服這些排斥問題。目前，人胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells,hES)源于三種來源不育治療后剩余的并捐贈(zèng)用于研究的胚泡，從捐贈(zèng)的配子(卵母細(xì)胞和精子)產(chǎn)生的胚泡，以及核移植(nucleartransfer,NT)的產(chǎn)物。死胎組織是人胚胎生殖細(xì)胞(humanembryonicgermcells,hEG)的唯一來源。hES和hEG細(xì)胞提供顯著的科學(xué)和治療可能性，其涉及產(chǎn)生更專一化的細(xì)胞或組織的潛能。但是，有關(guān)hES和hEG細(xì)胞的來源的倫理關(guān)注，以及用NT進(jìn)行研究會(huì)導(dǎo)致用NT產(chǎn)生人類的擔(dān)心，已引發(fā)了大量的公眾討論和辯論。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的單性生殖活化(parthenogeneicactivation)可作為對(duì)通過精子受精/NT的替代而應(yīng)用，以便制備用于胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的卵母細(xì)胞。單性生殖活化是在缺乏來自雄性配子的任何貢獻(xiàn)的情況下，從雌性配子產(chǎn)生胚胎細(xì)胞，其最終發(fā)育為成體或不最終發(fā)育為成體。與SCNT相比，卵母細(xì)胞的單性生殖活化是產(chǎn)生組織相容性干細(xì)胞的相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，原因在于它不需要顯微操作卵母細(xì)胞所需的復(fù)雜設(shè)備。單性生殖干細(xì)胞從未受精的卵母細(xì)胞產(chǎn)生并且含有卵母細(xì)胞供體(潛在患者)專有的遺傳物質(zhì)。進(jìn)一步，在定向細(xì)胞分化后，自體細(xì)胞可被移植而沒有免疫排斥的威脅。單性生殖小鼠MHC-純合干細(xì)胞系和一種單性生殖靈長(zhǎng)類動(dòng)物雜合胚胎干細(xì)胞系(Cyno-1)已被得到并且在這些細(xì)胞系中已表明細(xì)胞多能性。如上所述，同種異體組織和器官移植造成的最大風(fēng)險(xiǎn)是免疫排斥。風(fēng)險(xiǎn)的程度與供體和受體細(xì)胞表面抗原遞呈蛋白之間的差異程度成比例。在理想的移植中，在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)方面，供體組織與受體是組織相容的。人白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)是命名人MHC的術(shù)語，并且代表對(duì)移植重要的抗原。HLA抗原匹配的供體和受體組織降低在受體中細(xì)胞毒性T-細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)會(huì)，以及因此大大增加移植物存活的可能性。MHCI類和II類HLA單元型是共同遺傳自親本的特定組的HLA_A、-B、_DR基因座等位基因。盡管存在高度HLA多態(tài)性，但是在美國(guó)高加索人群中僅存在200個(gè)共有HLA單元型。這種HLA多樣性與雜合選擇系數(shù)組合，意味著發(fā)現(xiàn)供體_受體匹配的機(jī)率范圍是一千分之一至幾百萬分之一，其原因在于在雜合個(gè)體中由這些等位基因變體的組合提供的獨(dú)特的組織類型?；谝浦驳母杉?xì)胞治療面臨相同的HLA匹配問題，所述問題由于免疫排斥而限制了實(shí)體器官同種異體移植。HLA-匹配干細(xì)胞系可克服免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于單性生殖來源的細(xì)胞，HLA雜合細(xì)胞系通過使用A23187和6-DMAP的組合激活卵母細(xì)胞而得自HLA雜合供體。由于這些細(xì)胞與卵母細(xì)胞供體是HLA-匹配的，它們提供組織_匹配衍生物的能力受到限制。如果供體細(xì)胞是HLA純合的，S卩，含有相同的每種抗原遞呈蛋白的等位基因，則供體和受體之間的MHC相容性顯著增加。而且，如果純合供體細(xì)胞具有在群體中被高頻率發(fā)現(xiàn)的單元型，則這些細(xì)胞在大量個(gè)體的基于移植的干細(xì)胞治療中可具有用途。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開從HLA純合和HLA雜合供體產(chǎn)生HLA純合單性生殖人干細(xì)胞(hpSC-Hhom)系的方法。這些hpSC-Hhom系顯示人胚胎干細(xì)胞形態(tài)學(xué)，表達(dá)典型的干細(xì)胞標(biāo)記物(即，SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81以及OCT-4)并具有高水平的堿性磷酸酶和端粒酶活性。另外，將這些細(xì)胞系注射到免疫缺陷動(dòng)物中導(dǎo)致畸胎瘤形成。SNP數(shù)據(jù)分析表明，源于HLA雜合卵母細(xì)胞供體的hpSC-Hhom系的整個(gè)基因組是純合的。所公開的方案將源自動(dòng)物組分的應(yīng)用減到最少，其使這些干細(xì)胞理想地適合于臨床用途。在一個(gè)實(shí)施方式中，公開了源于單性生殖胚泡的分離的人干細(xì)胞系，其中構(gòu)成該細(xì)胞系的至少一個(gè)細(xì)胞對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)而言是雜合的，對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)HLA等位基因而言是純合的，或包括純合和雜合SNPs的組合?！矫?，至少一個(gè)細(xì)胞對(duì)于HLA等位基因而言是純合的。另一方面，至少一個(gè)細(xì)胞在被移植到無免疫應(yīng)答小鼠中時(shí)形成畸胎瘤。在進(jìn)一步的方面，至少一個(gè)細(xì)胞與胚泡供體是MHC相容的。在一個(gè)相關(guān)方面，至少一個(gè)細(xì)胞與胚泡供體的一級(jí)血親是MHC相容的，其包括至少一個(gè)細(xì)胞按照供體來源被實(shí)質(zhì)上遺傳印記?！矫妫辽僖粋€(gè)細(xì)胞(i)將在體外培養(yǎng)中增殖一年以上，(ii)在整個(gè)培養(yǎng)中保持分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織衍生物的潛能，以及(iii)當(dāng)在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)時(shí)被抑制分化。另一方面，至少一個(gè)細(xì)胞分化成下列細(xì)胞，包括神經(jīng)元細(xì)胞、心臟細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、以及少突膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、角化細(xì)胞、胰島細(xì)胞、淋巴前體細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中胚層細(xì)胞以及內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)相關(guān)方面，至少一個(gè)細(xì)胞不具有形成存活生物體的能力。在另一個(gè)實(shí)施方式中，公開了治療需要該治療的對(duì)象的方法，其包括施用包括分化細(xì)胞的細(xì)胞組合物，其中所述分化的細(xì)胞得自源于單性生殖胚泡的干細(xì)胞系，其中構(gòu)成所述細(xì)胞系的至少一個(gè)細(xì)胞對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)而言是雜合的，對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)HLA等位基因而言是純合的，或包括純合和雜合SNPs的組合?！矫妫瑢?duì)象患有疾病，所述疾病包括帕金森氏癥、亨廷頓氏癥、阿爾茨海默氏癥、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮癥、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、黃斑變性、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管疾病、尿路疾病、AIDS以及癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，公開了干細(xì)胞庫，其包括自體或同種異體(allogenic)干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞源于來自一個(gè)或更多個(gè)人供體的單性生殖活化的卵母細(xì)胞，以及其中所述干細(xì)胞是HLA純合干細(xì)胞。一方面，根據(jù)單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記物，每個(gè)庫成員被鑒定為全同胞、半同胞或不相關(guān)。另一方面，每個(gè)庫成員根據(jù)HLA-型進(jìn)行表征，并且所述庫成員與用于治療用途的潛在受體是HLA-匹配的。另一方面，卵母細(xì)胞供體與庫成員是組織相容的。在一個(gè)相關(guān)方面，庫成員根據(jù)卵母細(xì)胞供體來源被基因組印記，其包括庫的干細(xì)胞可源于HLA雜合卵母細(xì)胞供體。在進(jìn)一步的方面，庫中的每個(gè)成員對(duì)于不同于其它庫成員的MHC/HLA等位基因組合而言是純合的?！矫?，庫中的每個(gè)成員是至少一個(gè)或更多個(gè)HLAI類基因和HLAII類基因純合的。在一個(gè)相關(guān)方面，HLAI類基因包括HLAA*、HLAB*、HLA以及Cw*單元型組合。在另一個(gè)相關(guān)方面，HLAII類基因包括HLADRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQAl*以及DQBl*單元型組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，公開了產(chǎn)生HLA純合干細(xì)胞的方法，其包括篩選卵母細(xì)胞供體，尋找在給定群體中常見的HLA-單元型；在體外受精(IVF)培養(yǎng)基中溫育人中期II卵母細(xì)胞；在包括離子載體的IVF培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞；在包括嘌呤霉素的IVF培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞；以及在新鮮的IVF培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞，其中一個(gè)或更多個(gè)溫育在不同02張力下進(jìn)行，并且其中獲自細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)產(chǎn)生可培養(yǎng)的干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的示例性方法和組合物在下文更詳細(xì)地描述。圖1顯示phESC系的特征性特異性標(biāo)記物。在人飼養(yǎng)層細(xì)胞上phESC的未分化集落(A-F)，SSEA-1陰性染色(G-L)，細(xì)胞表面標(biāo)記物SSEA-3(M-R)、SSEA-4(S-X)的表達(dá)。放大倍數(shù)(A)至(E)100倍，(F)200倍，(G)至(X)400倍。在飼養(yǎng)細(xì)胞上phESC集落的堿性磷酸酶陽性染色(A-F)、OCT-4(G-L)、TRA-1-60(K-R)和TRA-1-81(S_X)。放大倍數(shù):(A、B、0、R)100倍，(C-F、M、S、X)200倍，(G_L、N、P、Q、T_W)400倍。圖2顯示，phESC表明與陽性對(duì)照細(xì)胞相比高水平的端粒酶活性"+"-來自500個(gè)細(xì)胞的提取物；"-"-熱處理的細(xì)胞提取物，端粒酶失活；"對(duì)照+"_端粒酶陽性細(xì)胞提取物(應(yīng)用TRAPEZE試劑盒)；"B"-CHAPS裂解緩沖液，引物-二聚體/PCR污染對(duì)照；TSR8-端粒酶定量對(duì)照模板(0.1和0.2amole/y1);"M"-標(biāo)記，DNA梯形條帶。圖3顯示phESC系的G-帶核型分析。phESC-1(A)、phESC-3(B)、phESC-4(C)、phESC-5(D)和phESC-6(E)系具有正常的46，XX核型。phESC-7系具有47，XXX核型(F)。圖4顯示將phESC體外分化為所有三個(gè)胚層的衍生物。外胚層分化通過神經(jīng)元特異性標(biāo)記物神經(jīng)絲68(A)、NCAM(B)、PIII微管蛋白(C)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP(D，M)的陽性免疫細(xì)胞化學(xué)染色來顯示。分化的細(xì)胞對(duì)于下列中胚層標(biāo)記物是陽性的肌肉特異性a-輔肌動(dòng)蛋白(G)和結(jié)蛋白(J)、內(nèi)皮標(biāo)記物PECAM-1(E)和VE-鈣粘蛋白(F)。內(nèi)胚層分化通過a-胎蛋白(H，L)陽性染色來顯示。phESC產(chǎn)生色素上皮-樣細(xì)胞(I，K)。放大倍數(shù)(I)100倍，(A-H，J-M)400倍。圖5顯示在SCID小鼠中phESC的體內(nèi)分化和畸胎瘤形成。對(duì)三個(gè)胚層的標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光染色。中胚層細(xì)胞標(biāo)記物肌肉肌動(dòng)蛋白圍繞其它成分進(jìn)行組織并且可清晰鑒別(A)。纖維連接蛋白以較高量存在對(duì)于中胚層來源的結(jié)締組織具有特異性(B)。神經(jīng)分化細(xì)胞(外胚層來源)區(qū)域是廣泛的并用e微管蛋白抗體進(jìn)行強(qiáng)烈標(biāo)記(C)。不成熟的內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記物a-胎蛋白可在腺體外觀的區(qū)域找到(D)。用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色-(A)、(D)。放大倍數(shù)(A)、(C)、(D)，100倍；(B)200倍。圖6顯示印記基因表達(dá)的RT-PCR分析。來自丟棄IVF胚胎的兩個(gè)hESC系hESl和hES2用作在下列phESC系中父本表達(dá)的基因SNRPN和PEG12以及母本表達(dá)的基因TSSC5和H19的表達(dá)分析的陽性對(duì)照phESC-l;phESC-3;phESC-4;phESC-5;phESC-6和phESC-7(分別為1、3、4、5、6以及7)。PEG11基因是雙等位基因表達(dá)的并用作另外的對(duì)照。包括GAPDH作為mRNA定量對(duì)照。RT-數(shù)據(jù)表明RT樣本沒有基因組污染。圖7顯示hpSC-Hhom系的特異性標(biāo)記物特征。來自所有四種hpSC-Hhom系的細(xì)胞表明SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA_1_81、0CT-4(用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色)、堿性磷酸酶陽性染色，以及SSEA-1陰性染色。小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)用作SSAE-1染色的陽性對(duì)照。圖8顯示，hpSC-Hhom系表明與陽性對(duì)照細(xì)胞相比高水平的端粒酶活性"Kl+"-端粒酶陽性細(xì)胞提取物(應(yīng)用TRAPEZE試劑盒)；"K2+"-來自500個(gè)細(xì)胞的提取物；"K-"或"-"-熱處理的細(xì)胞提取物，端粒酶失活；Buf-CHAPS裂解緩沖液，引物_二聚體/PCR污染對(duì)照；TSR-端粒酶定量對(duì)照模板(0.1和0.2翻le/y1);"M"-標(biāo)記物，DNA梯形條帶。圖9顯示人HLA純合單性生殖干細(xì)胞系的G-帶核型分析hpSC-Hhom-l(A)和hpSC-Hhom-4(B)系具有正常的46，XX核型；hpSC-Hhom-2(C)系的15%細(xì)胞具有47，XX，+8核型_染色體8的非整倍性；hpSC-Hhom-3(D)系的4.2%細(xì)胞具有47，XX，+1核型-染色體1的非整倍性。圖10顯示hpSC-Hhom-4體外分化成來自所有三個(gè)胚層的衍生物外胚層分化是明顯的，因?yàn)樯窠?jīng)元特異性標(biāo)記物神經(jīng)絲68(A)禾PNCAM(B)是免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性的；內(nèi)胚層分化是明顯的，因?yàn)閍-胎蛋白(C)的染色是陽性的；分化的細(xì)胞是中胚層標(biāo)記物肌肉特異性結(jié)蛋白(D)和a-輔肌動(dòng)蛋白(E)陽性的；放大倍數(shù)200倍(A-E)。圖11顯示hpSC-Hhom-4的體內(nèi)分化。SCID小鼠中的畸胎瘤形成。來自所有三個(gè)胚層(外胚層、內(nèi)胚層和中胚層)的衍生物由間充質(zhì)細(xì)胞包繞的充分形成的呼吸型腺體，蘇木精/伊紅(h/e)染色，放大倍數(shù)140倍(A);可能的具有單層細(xì)胞的神經(jīng)管，右側(cè)為內(nèi)胚層腺體和底部為軟骨-分化，h/e染色，放大倍數(shù)70倍(B);由間充質(zhì)細(xì)胞包繞的骨骼，中心是具有立方上皮的管狀腺，picrofucsin染色，放大倍數(shù)140倍(C);充分形成的由間充質(zhì)細(xì)胞包繞的骨骼和脂肪組織，h/e染色，放大倍數(shù)140倍(D);左側(cè)是內(nèi)胚層腺體、中胚層和脂肪組織、膠原，骨骼見于右側(cè)和底部，Kraberg染色，放大倍數(shù)70倍(E);由間充質(zhì)細(xì)胞包圍繞的內(nèi)胚層腺體結(jié)構(gòu)，膠原纖維大量產(chǎn)生，VanGieson染色，放大倍數(shù)280倍(F);復(fù)層上皮，中心為角化過度的珠狀物(pearl)，左側(cè)為另一個(gè)腺體，h/e染色，放大倍數(shù)140倍(G);7腺體集落，h/e染色，放大倍數(shù)70倍(H);含有產(chǎn)生褐色色素——可能為膽汁色素——的細(xì)胞的腺體，由脂肪組織和間充質(zhì)細(xì)胞包繞，h/e染色，放大倍數(shù)140倍(I)。具體實(shí)施例方式在描述本發(fā)明的組合物、方法以及培養(yǎng)方法學(xué)之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體組合物、方法以及實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些組合物、方法以及條件可變化。還應(yīng)理解的是，本文所使用的術(shù)語目的僅在于描述具體實(shí)施方式，而不意圖進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書來限制。如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用，除非上下文另外明確指出，單數(shù)形式"一(a)"，"一(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如，提及"該方法"包括一種或更多種方法，和/或本文描述類型的步驟，其在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容等時(shí)將成為顯而易見的。本發(fā)明公開用于獲得人HLA純合單性生殖干細(xì)胞系的至少兩種不同方法，所述細(xì)胞系用于基于移植的干細(xì)胞治療。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)細(xì)胞系源于HLA純合供體，其包括在卵母細(xì)胞活化過程中使用A23187和6-DMAP，阻止第二極體的擠出，從而保留Mil卵母細(xì)胞的所有遺傳物質(zhì)。源于這些卵母細(xì)胞的干細(xì)胞的HLA基因型與供體的HLA基因型匹配(Revazova等，CloningStemCells(2007)9(3):432-449)。在一個(gè)相關(guān)方面，也可獲得來自HLA純合供體的二倍體hpSC-Hhom-l系。在另一個(gè)實(shí)施方式中，HLA純合胚胎干細(xì)胞可源于HLA雜合卵母細(xì)胞供體，其包括使用A23187和嘌呤霉素的組合將卵母細(xì)胞單性生殖活化，其允許第二極體擠出。因此，活化的卵母細(xì)胞只含有一套中期II染色體的一半，其允許形成純合基因型。例如，由鈣離子載體和嘌呤霉素的組合活化的人卵母細(xì)胞的80%顯示前核，第二極體擠出。進(jìn)一步，細(xì)胞遺傳分析表明，78%含有一套正常單倍染色體(YamanoS.等，JMedInvestigation(2000)47(1-2):1-8)。此外，用A23187和嘌呤霉素活化的人卵母細(xì)胞顯示一個(gè)前核和兩個(gè)極體，具有一套單倍染色體(NakagawaK.等，Zygote(2001)9:83-88)。這種具有一套正常單倍染色體的前核單性生殖體已在小鼠模型中發(fā)育(NakasakaH.等，Zygote(2000)8:203-208)。使用這種方法從分離自HLA雜合供體的卵母細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)二倍體細(xì)胞系(例如但不限于hpSC-Hhom-2、hpSC-Hhom-3、hpSC-Hhom-4)。盡管不被理論所束縛，但HLA基因型分型數(shù)據(jù)表明，HLA單元型排他性地從供體親本之一遺傳。SNP分析數(shù)據(jù)表明，這三種細(xì)胞系是整個(gè)基因組純合的，如SNP分析所評(píng)估。例如，本發(fā)明中公開的示例性細(xì)胞系(參見實(shí)施例1)具有二倍體核型，這對(duì)應(yīng)于其中二倍體干細(xì)胞系源于單倍體小鼠胚胎的早期工作(Kaufman等，JEmbryolExpMorphol(1983)73:249-261)。卵母細(xì)胞活化后單倍體遺傳物質(zhì)復(fù)制的準(zhǔn)確機(jī)制和時(shí)間是不清楚的，但是，盡管不被理論所束縛，DNA復(fù)制看起來在不存在細(xì)胞卵裂或分裂的情況下發(fā)生。在先研究表明，80%的單性生殖活化的小鼠卵母細(xì)胞保持它們的單倍體狀態(tài)直到桑椹胚期，隨后的源于這些胚胎的干細(xì)胞系成為二倍體(KaufmanM.H.等，1983，上文)。除了替代療法之外，源于hpSC-Hhom系的細(xì)胞和組織的儲(chǔ)存在遺傳疾病治療中可具有無法衡量的價(jià)值。根據(jù)約翰霍普金斯大學(xué)(JohnHopkinsUniversity)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(theOnlineMendelianInheritanceinMan,0MM)和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)，存在多于100禾中遺傳疾病，這一目錄持續(xù)擴(kuò)展。實(shí)例包括阿爾茨海默氏癥、糖尿病、Graves癥(突眼性甲狀腺腫)、血友病、亨廷頓氏癥、肌肉萎縮癥、帕金森氏癥、鐮狀細(xì)胞貧血癥、苯丙酮尿癥-PKU和重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)。在這些情況中，使用獲自不攜帶相同遺傳缺陷的供體的細(xì)胞系會(huì)是重要的。"分化"是指發(fā)生在細(xì)胞中的變化，所述變化使那些細(xì)胞呈現(xiàn)某些特化的功能以及失去變化成某些其它特化的功能單元的能力。能夠分化的細(xì)胞可以是全能細(xì)胞、多能(pluripotent)細(xì)胞或多能性(multipotent)細(xì)胞中的任意。分化相對(duì)于成熟的成體細(xì)胞可以是部分的或完全的。"單雌生殖(Gynogenesis)"是指在細(xì)胞活化后導(dǎo)致產(chǎn)生包含可辨別的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎，所述細(xì)胞例如卵母細(xì)胞或其它胚胎細(xì)胞類型，包括全部雌性來源的哺乳動(dòng)物DNA，優(yōu)選人類雌性來源，例如人類或非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物卵母細(xì)胞DNA。這種雌性哺乳動(dòng)物DNA可以通過例如至少一個(gè)DNA序列的插入、缺失或取代被遺傳修飾，或可以未被修飾。例如，DNA可以通過插入或缺失期望的編碼序列，或促進(jìn)或抑制胚胎發(fā)生的序列被修飾。一般地，這樣的胚胎將通過體外激活包含全部雌性來源DNA的卵母細(xì)胞而獲得。單雌生殖包含在下面所定義的單性生殖中。它還包括其中精子的DNA沒有貢獻(xiàn)于被激活卵母細(xì)胞中的DNA的激活方法。在一個(gè)相關(guān)的方面，卵母細(xì)胞從制備用于IVF的超排卵(superovulating)對(duì)象獲得。用于IVF中的"超排卵"技術(shù)，如用激素處理雌性對(duì)象，被設(shè)計(jì)成剌激卵巢產(chǎn)生幾個(gè)卵(卵母細(xì)胞)，而不是如在自然周期中通常的一個(gè)卵。促進(jìn)卵產(chǎn)生所需要的藥物治療可包括但不限于下列醋酸亮丙瑞林(Lupron)(促性腺素釋放激素激動(dòng)劑)、Orgalutran、Antagon或西曲肽(Cetrotide)(促性腺素釋放激素拮抗劑)、Follistim、Bravelle或果納芬(Gonal-F)(FSH，促卵泡激素)、R印ronex(FSH和LH的組合，促黃體激素)、和波熱尼樂(Pregnyl)或Novarel(hCG，人絨毛膜促性腺素)。在一個(gè)相關(guān)方面，在經(jīng)陰道超聲指引下可以進(jìn)行卵的收集。為完成這一過程，應(yīng)用超聲將針通過陰道壁插入(例如，在IV鎮(zhèn)靜下)到卵巢中以定位每一個(gè)卵泡。卵泡液被抽到試管中以取得卵。通過"單性生殖(Parthenogenesis)，，("單性生殖激活(parthenogenicallyactivated)"和"單性生殖激活(parthenogeneticallyactivated)"被交換使用)過程，卵母細(xì)胞的激活在缺少精子穿入下發(fā)生，并且其是指包含滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的早期階段胚胎的發(fā)育，所述胚胎通過激活包含全部雌性來源DNA的卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞例如卵裂球而獲得。在一個(gè)相關(guān)方面，"單性生殖體"是指通過這種激活得到的所得細(xì)胞。在另一相關(guān)方面，"胚泡"是指分裂階段的受精或激活的卵母細(xì)胞，其包含由外滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)組成的中空細(xì)胞球。在又一相關(guān)方面，"胚泡形成"是指在卵母細(xì)胞受精或激活之后的過程，其中隨后卵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中被培養(yǎng)一段時(shí)間，所述時(shí)間能夠使其發(fā)育成由外滋養(yǎng)層細(xì)胞和ICM組成的中空細(xì)胞球(例如，5到6天)。9在一個(gè)實(shí)施方式中，公開了通過單性生殖激活的卵母細(xì)胞產(chǎn)生克隆人類胚胎干細(xì)胞系的方法。雖然單性生殖在自然界中不是罕見的繁殖形式，但不知道哺乳動(dòng)物能夠進(jìn)行這種繁殖形式。然而，在雌性近交系小鼠LT/Sv的卵母細(xì)胞中，可以發(fā)現(xiàn)比例為10%的自發(fā)單性生殖(Hoppe和Illmensee，ProcNatlAcadSciUSA(1982)79:1912-1916)，并且自發(fā)單性生殖也解釋了人類葡萄胎的形成(Berkowitz和Goldstein,NewEngJMed(1990)335(23):1740-1748)。有胎盤哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)進(jìn)行體外單性生殖；但是，胚胎發(fā)育是不成功的。單性生殖激活哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和將激活的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入代理母親之后，具有有限的胚胎存活小鼠為10天；羊?yàn)?1天溜為29天；兔為11.5天(Kure-bayashi等，Theriogenology(2000)53:1105-1119;Hagema皿等，MolR印orddev(1998)50:154-162;0zil禾口Huneru，Development(2001)128:917—928;Surani禾口Barton,Science(1983)222:1034-1036)。這種發(fā)育停滯的原因可能是由于遺傳印記(geneticimprinting)。已經(jīng)顯示，母親與父親的基因組是表觀遺傳上不同的(印igenticallydifferent)并且這兩組對(duì)于成功的胚胎發(fā)育都是必需的(Surani，Cell(1998)93:309-312;Sasaki等，(1992)6:1843-1856)。雖然不限于理論，但在單性生殖體中，所有的遺傳物質(zhì)應(yīng)該是母系來源，因此應(yīng)當(dāng)缺少父系印記。父系印記被認(rèn)為負(fù)責(zé)胚外(extra-embryo)組織發(fā)育，因此負(fù)責(zé)去核卵母細(xì)胞受精之后滋養(yǎng)層組織發(fā)育(Surani和Barton,(1983)，見上文)。因此，在動(dòng)物中，去核的受精卵對(duì)于核轉(zhuǎn)移和隨后的單性生殖激活可以是有用的。哺乳動(dòng)物單性生殖體僅僅經(jīng)歷有限的發(fā)育，胚胎最終死亡。在食蟹猴(Macacfascicularis)中，體外單性生殖激活之后的中期II階段卵母細(xì)胞中的僅僅14%在培養(yǎng)8天之后發(fā)育到胚泡階段(Vrana等，ProcNatlAcadSciUSA(2003)100(Suppl1):11911-11916)。在LT/Sv近交系小鼠的未交配雌性中，以自發(fā)激活單性生殖體形成的胚胎在幾天內(nèi)死亡。當(dāng)從包含這些胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)移到受精的去核C57BL/6j小鼠卵母細(xì)胞中時(shí)，得到具有LT/Sv基因組的克隆小鼠(Hoppe和Illmensee，ProcNatlAcadSciUSA(1982)79:1912-1916)。因此，受精卵母細(xì)胞的使用允許單性生殖體的足月發(fā)育。在一方面，受精的去核人卵母細(xì)胞能夠被用于支持包含供體細(xì)胞核的單性生殖胚胎的發(fā)育，直到胚泡階段。"多能細(xì)胞"是指來自通過激活包含全部雌性或雄性來源DNA的細(xì)胞而產(chǎn)生的胚胎的細(xì)胞，其可以在未分化狀態(tài)下在體外保持長(zhǎng)期時(shí)期、理論上為無限的時(shí)期，其可以產(chǎn)生不同的分化組織類型，即外胚層、中胚層、和內(nèi)胚層。細(xì)胞的多能狀態(tài)優(yōu)選地通過在合適條件下培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或來自胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞而保持，所述胚胎由雄核發(fā)育或雌核發(fā)育方法產(chǎn)生，所述條件例如，通過在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層或其它飼養(yǎng)層或包含白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)物上培養(yǎng)。這種培養(yǎng)細(xì)胞的多能狀態(tài)可以通過多種方法確認(rèn)，例如，(i)確認(rèn)表征多能細(xì)胞的標(biāo)志物的表達(dá)；(ii)包含表達(dá)多能細(xì)胞基因型的細(xì)胞的嵌合動(dòng)物的產(chǎn)生；(iii)將細(xì)胞注入到動(dòng)物例如SCID小鼠中，在體內(nèi)產(chǎn)生不同的分化細(xì)胞類型；以及(iv)在體外，觀察到細(xì)胞分化(例如，當(dāng)在缺少飼養(yǎng)層或LIF下培養(yǎng)時(shí))為胚狀體和其它分化細(xì)胞類型。"二倍體細(xì)胞"是指細(xì)胞，例如，卵母細(xì)胞或卵裂球，其具有全部雄性或雌性來源的10二倍DNA內(nèi)容物。"單倍體細(xì)胞"是指細(xì)胞，例如，卵母細(xì)胞或卵裂球，其具有單倍DNA內(nèi)容物，其中單倍DNA是全部雄性或雌性來源。激活是指一種過程，其中例如——但不限于此，在減數(shù)分裂中期II中，受精或未受精卵母細(xì)胞進(jìn)行這樣的過程所述過程一般包括染色單體對(duì)的分離，第二極體擠出，產(chǎn)生具有單倍數(shù)目染色體的卵母細(xì)胞，每一染色體具有一條染色單體。激活包括這樣的方法，通過該方法，包含全部雄性或雌性來源DNA的細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)育成具有可辨別的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層的胚胎，這對(duì)于產(chǎn)生多能細(xì)胞是有用的，但其本身可能不能發(fā)育成存活的后代。例如，激活可以在下面的一種條件下進(jìn)行(i)不引起第二極體擠出的條件；(ii)引起極體擠出但其中極體擠出被抑制的條件；或(iii)抑制單倍體卵母細(xì)胞第一次細(xì)胞分裂的條件。"中期II'是指細(xì)胞發(fā)育的一個(gè)階段，其中細(xì)胞的DNA內(nèi)容物由單倍數(shù)目染色體組成，每一染色體由二條染色單體表示。對(duì)于本發(fā)明，人中期II卵母細(xì)胞單性生殖活化后的第二減數(shù)分裂的抑制和二倍體胚胎的產(chǎn)生導(dǎo)致MHC-雜合phESC的獲得。通常，哺乳動(dòng)物輸卵管和子宮中的氧張力遠(yuǎn)小于在正常大氣中發(fā)現(xiàn)的氧張力的一半(Fischer禾口Bavister，JR印rodFertil(1993)99:673-679;Kaufman等，Comp.BiochmePhysiolCompPhysiol(1994)107:673-678)。對(duì)于IVF后人胚胎的成功培養(yǎng)，已使用20%以及5%的氧濃度。但是，增加的氧可產(chǎn)生可誘導(dǎo)凋亡的活性氧種類(VanSoom等，Theriogeology(2002)57:1453-1465)。已報(bào)道，低氧濃度增加植入前胚胎的存活性，幫助它們的正常發(fā)育并給予健康胚泡形成的較高發(fā)生率，其通過更多細(xì)胞數(shù)量和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的良好形成顯示(Dumoulin等，HumR印rod(1999)14:465-469)。在以往的研究中，使用具有高(20%)氧含量的氣體混合物，人單性生殖胚胎在體外發(fā)育(Lin等，StemCell(2003)21:152-161;Cibelli等，JRegMed(2001)2:25-31)。在一個(gè)實(shí)施方式中，ICM分離和phESC培養(yǎng)的方法包括使用人皮膚成纖維細(xì)胞，以及細(xì)胞用人臍帶血清(HUCBS)而不是用動(dòng)物血清繁殖并將它們用做飼養(yǎng)細(xì)胞。phESC系的衍生和培養(yǎng)可在為hESC培養(yǎng)設(shè)計(jì)的VitroHES培養(yǎng)基(Vitrolife)中添加HUCBS進(jìn)行。例如，在hESCs產(chǎn)生中使用HUCBS具有對(duì)ICM生長(zhǎng)和phESC繁殖的正效應(yīng)(例如，添加HUCBS與缺乏HUCBS相比，在VitroHES培養(yǎng)基中的phESC生長(zhǎng)更好)。進(jìn)一步，與免疫外科和胰蛋白酶處理相比，通過從滋養(yǎng)外胚層生長(zhǎng)的機(jī)械剪切從全胚泡中分離ICMs顯示為更溫和與優(yōu)選的方法。此外，該方法允許與動(dòng)物衍生試劑之間相互作用的排除。雖然本發(fā)明的phESC系顯示hESC系表現(xiàn)出的一般特征，但是它們也顯示獨(dú)特的特征，其包括實(shí)際上與卵母細(xì)胞供體的基因型相同的基因型，如見于單性生殖衍生的猴ES細(xì)胞系Cyno-l(Vrana等，2003，ProcNatlAcadSciUSA(2003)100:11911-11916)。同樣地，與SCNT比較，從單性生殖胚胎產(chǎn)生hESC系可以是產(chǎn)生腿C-匹配的和可能組織相容的胚胎干細(xì)胞的較好方法。如小鼠和猴單性生殖干細(xì)胞的以往研究已顯示的，這些細(xì)胞可形成畸胎瘤，其具有來自所有三個(gè)胚層的衍生物(Lin等，2003，見上文；Vrana等，見上文)。在選擇性培養(yǎng)條件下，猴單性生殖胚胎干細(xì)胞已分化成神經(jīng)細(xì)胞和功能性的多巴胺能和5-羥色胺能神經(jīng)元(Vrana等，2003，見上文)。本發(fā)明的phESC也可體外和體內(nèi)分化成所有三個(gè)胚層的衍生物并且是多能性的。此外，來自PhESC的胚狀體能夠產(chǎn)生搏動(dòng)的心肌細(xì)胞樣細(xì)胞。本發(fā)明表明產(chǎn)生單性生殖人胚胎干細(xì)胞的方法，其中實(shí)驗(yàn)性數(shù)據(jù)顯示，phESC可分化成在治療人類變性疾病中可具有重大價(jià)值的功能性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，中期II卵母細(xì)胞在不同的02張力氣體環(huán)境下通過溫育卵母細(xì)胞而激活。在一個(gè)相關(guān)方面，低02張力氣體環(huán)境由包含大約2%、3%、4%、或5%的02濃度的氣體混合物產(chǎn)生。在進(jìn)一步相關(guān)的方面，氣體混合物包含大約5%0)2。進(jìn)一步地，氣體混合物包含大約90%N2、91%N2或93%N2。這種氣體混合物區(qū)別于含有5%C02的空氣，其大約有約5%C02、20%02和75%N2。"02張力"是指在流體(例如，液體或氣體)中的氧氣的分壓(氣體混合物的單一成分施加的壓力)。低張力是當(dāng)氧分壓(P02)低時(shí)的情況，高張力是當(dāng)p02高時(shí)的情況。"確定成分培養(yǎng)基條件"是指培養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境，其中詳細(xì)描述了最佳成長(zhǎng)所需要的其中成分的濃度。例如，取決于細(xì)胞的用途(例如，治療應(yīng)用)，從包含異種蛋白質(zhì)的條件中取出細(xì)胞是重要的；即，培養(yǎng)條件是無動(dòng)物條件或無非人動(dòng)物蛋白質(zhì)。在一個(gè)相關(guān)方面，"體外受精(IVF)培養(yǎng)基"是指包含受精卵母細(xì)胞能夠在其中或其上成長(zhǎng)的化學(xué)限定物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)。"胞外基質(zhì)(ECM)基底(Extracellularmatrixsubstrate)"是指支撐最佳生長(zhǎng)的細(xì)胞下的表面。例如，這種ECM基底包括但不限于Matrigel、層粘連蛋白、明膠和纖連蛋白基底。在一個(gè)相關(guān)方面，這樣的基底可以包括膠原蛋白IV、巢蛋白，肝素硫酸鹽蛋白聚糖，包括不同的生長(zhǎng)因子(例如，bFGF、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-l、血小板衍生生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和TGF-13-1)。"胚胎(Embryo)"是指細(xì)胞激活產(chǎn)生的胚胎，所述細(xì)胞例如，卵母細(xì)胞或包含所有雄性或雌性來源DNA的其它胚胎細(xì)胞，其可以任選地被修飾，其包括可辨別的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，其不能產(chǎn)生存活的后代并且其中DNA為全部雄性或雌性來源。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或其中包含的細(xì)胞對(duì)于如前面所定義的多能細(xì)胞的產(chǎn)生是有用的。"內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)"是指產(chǎn)生胎兒組織的胚胎內(nèi)部部分。在本文中，這些細(xì)胞被用于在體外提供多能細(xì)胞的持續(xù)來源。而且，ICM包括從雄核發(fā)育或雌核發(fā)育得到的胚胎的內(nèi)部部分，即，包含所有雄性或雌性來源DNA的細(xì)胞激活后得到的胚胎。例如，這種DNA將是人DNA，例如，人類卵母細(xì)胞或精子DNA，其可以被遺傳修飾或可以不被遺傳修飾。"滋養(yǎng)外胚層"是指產(chǎn)生胎盤組織的早期胚胎的另一部分，包括從雄核發(fā)育或雌核發(fā)育得到的胚胎的組織，即，包含所有雄性或雌性來源例如人類卵巢或精子的DNA的細(xì)胞激活得到的胚胎。"分化細(xì)胞"是指具有特定分化狀態(tài)即非胚胎狀態(tài)的非胚胎細(xì)胞。三種最早分化的細(xì)胞類型是內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。"實(shí)質(zhì)上相同的"指關(guān)于特定特征的性質(zhì)相同，其如此相近以至于在測(cè)量差異(例如，通過HLA分型、SNP分析和類似方法)能力內(nèi)基本上相同。"組織相容的"是指生物體耐受外來組織移植的程度。"基因組印記"是指這樣的機(jī)制，通過該機(jī)制，基因組中的許多基因根據(jù)它們的親本來源被單等位基因地表達(dá)。"同型異源性"，包括其語法上的變化，是指在細(xì)胞或個(gè)體中存在相同類型的線粒體DNA(mtDNA)。12"異質(zhì)性"，包括其語法的變化，是指在細(xì)胞或個(gè)體中存在一種以上類型的線粒體DNA(mtDNA)的混合物。"單親的"是指一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞或個(gè)體，另一細(xì)胞或個(gè)體從其中產(chǎn)生并且對(duì)其保持次生性(subsidiary)。"機(jī)械地分離"是指通過物理力分離細(xì)胞集合體的過程。例如，這種過程將排除可能含有非人物質(zhì)的酶(或其它細(xì)胞分裂產(chǎn)品)的應(yīng)用。在天然環(huán)境中，來自卵巢的未成熟卵母細(xì)胞(卵)經(jīng)歷成熟過程，其導(dǎo)致通過減數(shù)分裂進(jìn)展到減數(shù)分裂中期II。隨后卵母細(xì)胞停滯在中期II。在中期II中，細(xì)胞的DNA內(nèi)容物由單倍數(shù)目的染色體組成，每個(gè)染色體由二條染色單體表示。這樣的卵母細(xì)胞可以通過冷藏被無限保存，例如通過用糖顯微注射，但不限于此。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了從冷藏的卵母細(xì)胞或單性生殖體產(chǎn)生人類于細(xì)胞的方法，包括向卵母細(xì)胞或單性生殖體的細(xì)胞質(zhì)中顯微注射冷藏劑，冷凍卵母細(xì)胞或單性生殖體到低溫溫度使它進(jìn)入休眠狀態(tài)，在休眠狀態(tài)下儲(chǔ)存卵母細(xì)胞或單性生殖體，解凍卵母細(xì)胞或單性生殖體，在高02張力下在離子載體存在下單性生殖激活卵母細(xì)胞，隨后在低02張力下使卵母細(xì)胞與絲氨酸_蘇氨酸激酶抑制劑接觸，培養(yǎng)激活的卵母細(xì)胞或單性生殖體直到胚泡形成，從胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，和在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)ICM細(xì)胞，其中培養(yǎng)ICM細(xì)胞在高02張力下進(jìn)行。在一方面，如所述取得的卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到改良型、等張的IVF——其被胚胎測(cè)試礦物油(Sigma)覆蓋，或任何其它適合的培養(yǎng)基中。如果期望，卵母細(xì)胞可以用與計(jì)劃進(jìn)行顯微注射的量濃度相同的細(xì)胞外糖溫育。例如，為注入O.1M糖，卵母細(xì)胞可以在DMEM/F-12中用0.1M糖平衡。在一方面，冷藏劑包含比標(biāo)準(zhǔn)DMEM低的Na+濃度(即，低Na+介質(zhì)(media))。在一相關(guān)方面，冷藏劑包含比標(biāo)準(zhǔn)DMEM更高的K+濃度(即，高K+)。在另一相關(guān)方面，冷藏劑包含比標(biāo)準(zhǔn)DMEM更低的Na+和更高的K+濃度(即，低Na7高K+介質(zhì))。在一方面，冷藏劑包括有機(jī)緩沖劑，包括但不限于HEPES。在另一方面，冷藏劑包括抑制凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)的部分?？蛇x地，卵母細(xì)胞可以任選地用任何其它實(shí)質(zhì)上不可滲透的溶質(zhì)例如NaCl平衡，以在顯微注射之前降低它們的細(xì)胞體積。相對(duì)于在顯微注射之前沒有在高滲介質(zhì)中溫育的卵母細(xì)胞，細(xì)胞體積的這種最初的降低可以導(dǎo)致較小最終體積的顯微注射卵母細(xì)胞。這種較小最終體積可以最小化卵母細(xì)胞膨脹引起的任何可能的負(fù)面影響。用于制備顯微注射的細(xì)胞的這種一般程序也可以用于其它細(xì)胞類型(例如，激活的卵母細(xì)胞、hES細(xì)胞和類似細(xì)胞)。隨后卵母細(xì)胞用冷藏劑顯微注射。顯微注射設(shè)備和程序在本領(lǐng)域被充分表征，并且已知用于注射小分子到細(xì)胞中的顯微注射設(shè)備可以在本發(fā)明中使用。在示例性顯微注射步驟中，卵母細(xì)胞可以在10psi壓力下被顯微注射30毫秒。另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)顯微注射技術(shù)的實(shí)例為由Nakayama禾口Yanagimachi描述的方法(NatureBiotech.16:639-642，1998)。可用于該方法的冷藏劑包括具有低溫保護(hù)性質(zhì)和一般不可滲透的任何化學(xué)物質(zhì)。具體地，冷藏劑可以包括單獨(dú)的糖或糖與其它傳統(tǒng)冷藏劑混合在一起。碳水化合物糖例如海藻糖、蔗糖、果糖和蜜三糖可以被顯微注射為濃度少于或等于大約l.OM，更優(yōu)選地，少于或等于約O.4M。在一方面，濃度為0.05到0.20M之間，包括0.05和0.20M。此外，細(xì)胞外糖或傳統(tǒng)冷藏劑可以在儲(chǔ)存之前被加入。如果細(xì)胞在顯微注射之前在高滲溶液中被溫育，在顯微注射之后實(shí)質(zhì)上不可滲透的溶質(zhì)可以允許保持在介質(zhì)中，或可以通過用含有更低濃度的這種溶質(zhì)或不含這種溶質(zhì)的介質(zhì)洗滌細(xì)胞而從培養(yǎng)基中去除。—些糖或多糖——其通常不透過細(xì)胞膜，因?yàn)樗鼈兲笠灾劣诓荒艽┻^細(xì)胞膜——對(duì)于冷藏目的具有優(yōu)良的物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)。雖然這些糖通常自身不滲透細(xì)胞膜，但利用所描述的方法，這些通常非滲透性的糖可以被細(xì)胞內(nèi)顯微注射，產(chǎn)生有利效果。非滲透性糖——其對(duì)細(xì)胞具有穩(wěn)定或保存作用，在本方法中特別用作冷藏劑——包括蔗糖、海藻糖、果糖、葡聚糖和蜜三糖。在這些糖中，海藻糖——葡萄糖的非還原二糖——已經(jīng)顯示了在低濃度下在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)異效應(yīng)。細(xì)胞外糖脂或糖蛋白的加入也可以穩(wěn)定細(xì)胞膜。在冷藏劑顯微注射之后，細(xì)胞被制備用于儲(chǔ)存。多種冷凍和/或干燥方法可以被用于制備儲(chǔ)存用細(xì)胞。具體地，本文描述三種方法真空或風(fēng)干、冷凍干燥和凍融方法。干燥方法具有穩(wěn)定的生物材料可以在環(huán)境溫度下被運(yùn)輸和儲(chǔ)存的優(yōu)點(diǎn)。通常地，在投入液氮進(jìn)行儲(chǔ)存之前，加載有1到2M匿S0的卵母細(xì)胞以非常慢的冷卻速率(0.3到0.5°C/分鐘)被冷卻到中間溫度(-6(TC到-80°C)。然后樣品可以在此溫度下被保存。隨后懸浮材料可以在冷藏溫度下被保存所希望的時(shí)間，例如，通過使小瓶留在液氮(LN2)中。真空或風(fēng)干或冷凍干燥蛋白質(zhì)的方案在本領(lǐng)域中被充分表征(Frank等，"MaterialsScienceandtheProductionofShelf_StableBiologicals，，BioPharm，October1991，p.39;Shalaev等，"ChangesinthePhysicalStateofModelMixtureduringFreezingandDrying:ImpactonProductQuality,，，Cryobiol.33，14-26(1996))，并且這些方案可以被用于制備使用描述的方法儲(chǔ)存的細(xì)胞懸浮液。除風(fēng)干之外，可以用來從細(xì)胞懸浮液中去除水的其它對(duì)流干燥方法包括氮?dú)饣蚱渌鼩怏w的對(duì)流。對(duì)本發(fā)明方法有用的示例性蒸發(fā)真空干燥方法可以包括在12孔板上的孔中各放置20并且在環(huán)境溫度下真空干燥2小時(shí)。當(dāng)然，可以使用其它的干燥方法，包括干燥小瓶中的細(xì)胞。以這種方式制備的細(xì)胞可以被干燥保存，并且通過在DMEM中或任何其它適合培養(yǎng)基中稀釋而再水合。使用冷凍干燥制備用于儲(chǔ)存的細(xì)胞的本發(fā)明的方法由冷凍細(xì)胞懸浮液開始。雖然本領(lǐng)域已知的冷凍方法可以被使用，但本文針對(duì)凍融方法所描述的簡(jiǎn)單投入冷凍(plungefreezing)方法也可以被用于冷凍干燥方案中的冷凍步驟。冷凍之后，可以應(yīng)用二階段干燥過程。在第一階段，升華作用能被加入以便蒸發(fā)冷凍水。在樣品中的純晶體冰已經(jīng)被升華之后，進(jìn)行第二干燥。冷凍干燥的細(xì)胞能夠被保存并且以如上面針對(duì)真空干燥所述的相同方式被水合。隨后存活細(xì)胞可以被恢復(fù)。細(xì)胞從冷凍或干燥狀態(tài)恢復(fù)之后，任何外部的冷藏劑可以任選地從培養(yǎng)基中去除。例如，可以通過加入具有較低濃度冷藏劑的相應(yīng)培養(yǎng)基來稀釋培養(yǎng)基。例如，恢復(fù)細(xì)胞可以在含有比用于細(xì)胞儲(chǔ)存的糖濃度低的糖的培養(yǎng)基中溫育大約五分鐘。對(duì)于這一溫育，培養(yǎng)基可以包含與用作冷藏劑的糖相同的糖；不同冷藏劑，例如半乳糖；或任何其它實(shí)質(zhì)上不可滲透的溶質(zhì)。為了最小化由培養(yǎng)基滲透性降低而誘發(fā)的任何滲透震擾，細(xì)胞外冷14藏劑的濃度可以通過進(jìn)行多次這種稀釋步驟而緩慢地降低，每次稀釋使用更低濃度的冷藏劑。這些稀釋步驟可以重復(fù)，直到不存在細(xì)胞外冷藏劑或直到冷藏劑的濃度或培養(yǎng)基的滲透性降低到所期望的水平。單性生殖激活的卵母細(xì)胞、胚泡、ICM、自體干細(xì)胞和源自它們的分化細(xì)胞可以以允許細(xì)胞應(yīng)將來需要而復(fù)蘇的方式被儲(chǔ)存或"庫存(banked)"。單性生殖激活的卵母細(xì)胞和自體或同種異體干細(xì)胞的等分試樣可以在任何時(shí)間被移出，成長(zhǎng)為許多未分化細(xì)胞的培養(yǎng)物和隨后分化成特定的細(xì)胞類型或組織類型，并且隨后可以被用于治療疾病或替代對(duì)象中的功能異常組織。一方面，細(xì)胞從供體單性生殖得到，所述細(xì)胞能夠被保存，使得個(gè)體或近親能夠長(zhǎng)時(shí)期地得到細(xì)胞。另一方面，細(xì)胞從人群中常見的HLA-單元型純合供體單性生殖得到，所述細(xì)胞可被儲(chǔ)存以使具有相同或幾乎相同HLA-單元型的個(gè)體可在延長(zhǎng)的時(shí)間段得到細(xì)胞。一方面，細(xì)胞從人群中常見的具有HLA-單元型的供體單性生殖得到，以及細(xì)胞可被儲(chǔ)存以使具有相同或幾乎相同的HLA-單元型的個(gè)體可在延長(zhǎng)的時(shí)間段得到細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供用于儲(chǔ)存單性生殖激活的卵母細(xì)胞、胚泡、ICM和/或自體或同種異體干細(xì)胞樣品和其分化衍生物的細(xì)胞庫。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了施用這種細(xì)胞庫的方法。美國(guó)專利申請(qǐng)發(fā)明者E·S·列瓦澤瓦,J·D·賈納斯,L·N·庫茲米切夫,N·A·圖羅文茨申請(qǐng)人:國(guó)際干細(xì)胞公司