專利名稱：：Nanog抑制型突變體及其在Nanog功能研究中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及Nanog抑制型突變體的構(gòu)建、表達(dá)以及其在Nanog的功能研究中的用途，所述Nanog是一個(gè)Homeobox家族基因，可以不依賴于LIF而維持胚胎干細(xì)胞的多能性，是在干細(xì)胞的多能性、自我更新及重編程過程屮起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。
背景技術(shù)：
：胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells,ES細(xì)胞)來自于哺乳動物的胚泡(Blastocyst)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(InnerCellMass,ICM)，是最為原始的干細(xì)胞，具有發(fā)育的多能性。ES細(xì)胞區(qū)別丁-其他的細(xì)胞最基本的生物學(xué)特性，主要有三個(gè)第一，ES具有多能性(pluripotency),所謂多能性即ES細(xì)胞具有多向的分化潛力，首先它可以分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層二個(gè)胚層的細(xì)胞，進(jìn)而分化成各種各樣的細(xì)胞類型；第二，具有自我更新的能力或者無限增殖能力(self-renewal);第三，具有整合的能力，即將ES細(xì)胞注射到早期發(fā)育的胚胎中，ES細(xì)胞可以整合到胚胎中并可隨胚胎一起發(fā)育，能分化成為任何的組織并形成嵌合體(MintzB，等人，(1975)ProcNatlAcadSciUSA,72:3585-3589;川menseeK,等人，(1976)ProcNatlAcadSciUSA,73:549-553;EvansMJ，等人，(1981)，Nature,292:154-156)。研究ES細(xì)胞維持自我更新能力和分化潛能的分子機(jī)制非常重要，也是胚胎干細(xì)胞能應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)。因此，基于干細(xì)胞這種全能性或多能性特性的療法是現(xiàn)在許多待解決疾病(例如帕金森氏病)的一種很有前景的解決方案。但是，在將人的ES細(xì)胞安全和有效地應(yīng)用到治療人類疾病之前，我們必須克服人ES帶來的很多難以克服的障礙。目前，ES細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)研究還不是很清楚，需要進(jìn)一步深入地了解干細(xì)胞具有這種全能性或者多能性的分子機(jī)制。干細(xì)胞的多能性以及自我更新能力的維持，需要多條信號通路以及各種轉(zhuǎn)錄因子來協(xié)調(diào)。其中，維持小鼠ES細(xì)胞的多能性的轉(zhuǎn)錄因子包括Oct4、Sox2、FoxD3和Nanog(Pan,G.,等人，(2006)FasebJ20(10)，1730-1732;Boyer,L.A"等人，(2005)Cell122(6)，947-956;Mitsui,K.，等人，(2003)Cell113(5)，631-642;Chambers,I.,等人(2003)Cell113(5),643-655),但是關(guān)于干細(xì)胞維持多能性及自我更新的分子機(jī)制還不是很清楚。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，小鼠Nanog,是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)的情況下可以在不需要LIF通路的情況下維持小鼠干細(xì)胞的多能性(Mitsui,K.，等人，(2003)Cell113(5)，631-642;Chambers,l.,等人(2003)Cell113(5),643-655)。小鼠Nanog蛋白是由305個(gè)氨基酸組成，并且包含有一個(gè)Homeobox保守結(jié)構(gòu)域。Nanog的表達(dá)模式和Oct3/4很相似，也只是在多能性干細(xì)胞中表達(dá)，而在分化的成熟細(xì)胞中完全消失(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。在小鼠胚胎發(fā)育的過程中，Nanog的表達(dá)會隨著這些多能性細(xì)胞的分化而逐漸下降(Chambers,I.,等人(2003)Cell113(5),643-655)。Nanog被認(rèn)為在維持ICM和ES多能性發(fā)面發(fā)揮著決定性的作用。Oct3/4是通過阻止ICM和ES細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層方向分化來維持其多能性。與Oct3/4的作用模式略有不同，Nanog不僅可以獨(dú)立阻止ES細(xì)胞向內(nèi)胚層方向分化，而且還可以主動的維持多能性(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。Nanog敲除的小鼠胚胎由于缺少epiblasts而不能發(fā)育到囊胚階段(Mitsd,K.，等人，(2003)Cell113(5))。Nanog敲除的ES對于小鼠的ES細(xì)胞而言，Nanog最重要的角色就是高表達(dá)的Nanog可以不依賴于外源性信號因子Lif而維持多能性，表明Nanog可能是外源性信號因子的主要的下游作用基因。作為一個(gè)維持ES細(xì)胞多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，小鼠Nanog只有進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用，但是至于Nanog的進(jìn)核機(jī)制至今還沒有人報(bào)道。在此我們證明了核定位信號突變的Nanog發(fā)揮著抑制型突變體的功能，影響野生型Nanog的核定位和轉(zhuǎn)錄激活能力，這可以為一個(gè)非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及通過將位于Nanog保守結(jié)構(gòu)域Homeobox(序列見SEQIDNO:2)中的核定位信號1和/或2突變成無關(guān)序列，破壞其功能，來得到抑制型Nanog突變體，其中所述突變體仍然具有與野生型Nanog形成異源二聚體的能力，并且抑制了野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活功能，作為抑制型突變體而發(fā)揮功能，因此可能作為一個(gè)非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。圖1:顯示了小鼠Nanog野生型和核定位信號突變體的具體信息。野生型的小鼠Nanog構(gòu)建到pCR3.1載體中，然后利用點(diǎn)突變將所指示的目的氨基酸進(jìn)行突變。圖2:顯示了將小鼠Nanog和核定位信號突變體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，利用蛋白雜交檢測到的蛋白表達(dá)情況。圖3:顯示了將小鼠Nanog和核定位信號突變體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，利用特定的抗體進(jìn)行免疫熒光檢測，利用激光共聚焦顯微鏡觀察其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。圖4:顯示了非多能性細(xì)胞HEK293T及多能性細(xì)胞P19和F9中，核定位信號突變的小鼠Nanog喪失了激活p5N報(bào)告基因的能力。在24孔板培養(yǎng)的HEK293T，P19，F(xiàn)9細(xì)胞中，分別共轉(zhuǎn)染p5N報(bào)告基因載體(0.2微克)和對照載體(0.4微克,lane1)、野生mNanog(0.4微克，lane2)、1突變mNanog(0.4微克，lane3)、2突變mNanog(0.4微克，lane4)以及雙突變mNanog(0.4微克，lane5)后24小時(shí)測量分析的結(jié)果。圖5:顯示了核定位信號突變的小鼠Nanog仍然具有與野生型Nanog形成二聚體的能力。在6厘米培4養(yǎng)皿中培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中，分別共轉(zhuǎn)染野生Nanog-myc(4微克)、1突變Nanog-myc(4微克,)、2突變Nanog-myc(4微克)以及雙突變Nanog-myc(4微克)同帶有Flag標(biāo)簽的野生Nanog-F，或者是載體。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用TNE裂解液裂解細(xì)胞，并且用抗FLAG的樹脂柱子進(jìn)行蛋白質(zhì)的富集，然后進(jìn)行蛋白檢測。圖6:顯示了將核定位信號突變體與野生型Nanog共同轉(zhuǎn)染后，利用特定的抗體進(jìn)行免疫熒光染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察突變體對野生型小鼠Nanog細(xì)胞定位的改變情況。圖7:顯示了非多能性細(xì)胞HEK293T及多能性細(xì)胞P19和F9中，核定位信號突變的小鼠Nanog對于野生小鼠Nanog激活p5N報(bào)告基因的能力的抑制作用。在24孔板培養(yǎng)的HEK293T、P19、F9細(xì)胞中，分別共轉(zhuǎn)染p5N報(bào)告基因載體(每個(gè)孔0.2微克)、野生mNanog(每個(gè)孔0.4微克)和對照載體(每個(gè)孔0微克、0.2微克、0.4微克或者0.8微克)、1突變mNanog(每個(gè)孔0.2微克或者0.4微克)、2突變mNanog(每個(gè)孔0.2微克或者0.4微克)以及雙突變mNanog(每個(gè)孔0.2微克或者0.4微克)后24小時(shí)測量分析的結(jié)果。具體實(shí)施例方式如上文所述，本文中使用的Nanog蛋白質(zhì)是Homeobox家族的一員，在Nanog敲除的小鼠胚胎由于缺少epiblasts而不能發(fā)育到囊胚階段(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。小鼠Nanog過表達(dá)的情況下可以不依賴于LIF而維持胚胎干細(xì)胞的多能性，因此在維持胚胎干細(xì)胞中所起的重要作用(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5),631-642;Chambers,T.,等人(20(B)Cell113(5),643-655)。本文中使用的Nanog基因可以來自包含其的任何動物，優(yōu)選來自哺乳動物，最優(yōu)選來自小鼠。在Nanog中具有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，被稱為"同源異型框(Homeobox)"，其在大多數(shù)來源的動物中都是保守的，在這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的兩端各有一個(gè)核定位信號(NuclearLocalizationSignal,NLS)。例如，在小鼠中，這兩個(gè)核定位信號分別為RKQKMR(SEQIDNO:6)和RMKCKR(SEQIDNO:7)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，核定位信號是負(fù)責(zé)將蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)定位到細(xì)胞核內(nèi)的信號肽序列。在本申請中，通過將核定位信號序列進(jìn)行失功能突變，即將其符合讀框地突變成為無功能的信號序列，可以使得突變的Nanog蛋白質(zhì)喪失完全定位在細(xì)胞核中的能力，即會有部分滯留在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。所述失功能突變例如可以是將Nanog的NLS序列通過取代突變成無關(guān)序列，或者通過缺失和/或添加。優(yōu)選地，將所述NLS序列進(jìn)行定點(diǎn)突變成為無關(guān)序列。最優(yōu)選地，無關(guān)序列為GIQNMQ(由NLS1突變得來)，或者GMNVDG(由NLS2突變得來)。可以將兩個(gè)NLS序列的仟一突變(例如突變的核酸如SEQIDNO:8或SEQIDNO:9所示)，也可以將二者都突變(例如突變的核酸如SEQIDNO:10所示)，這都將影響Nanog的核定位能力，同時(shí)影響Nanog的轉(zhuǎn)錄激活功能。本發(fā)明還涉及制備包含能夠表達(dá)上述突變蛋白質(zhì)3的核酸的表達(dá)質(zhì)粒的方法，所述方法包括(a)使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體構(gòu)建野生型Nanog基因的真核表達(dá)質(zhì)粒；(b)將(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行目的氨基酸的點(diǎn)突變得到突變休；(c)轉(zhuǎn)染(a)和(b)得到的質(zhì)粒到細(xì)胞中，并檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)；(d)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細(xì)胞內(nèi)定位上進(jìn)行比較；(e)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活能力上進(jìn)行比較；(f)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因共同轉(zhuǎn)染，檢測(b)中得到的突變體對(a)中得到的野生型基因的細(xì)胞內(nèi)定位的影響；(g)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野牛型基因共同轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞中檢測(b)中得到的突變體存在時(shí)，對于(a)屮得到的野生型基因的轉(zhuǎn)錄激活能力的影響；(h)選擇對于野生型Nanog的細(xì)胞內(nèi)定位以及轉(zhuǎn)錄激活能力具有影響的突變體。本文中使用的術(shù)語"適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體"包括可以表達(dá)蛋白質(zhì)的任何可商購的載體，優(yōu)選本領(lǐng)域熟知的修飾過的真核表達(dá)載體pCR3.1(JiangA等人，(2003)J.Biol.Chem278,38765-71)。本文中所述的"細(xì)胞"可以是能夠獲得的任何細(xì)胞，包括具有多能性的和非多能性的細(xì)胞，其中所述多能性細(xì)胞優(yōu)選是小鼠畸胎瘤細(xì)胞，特別是pl9細(xì)胞(pl9細(xì)胞來源自小鼠畸胎瘤細(xì)胞，McBumeyMW等人，(1982)Dev.Biol89:503-508)和F19細(xì)胞(F9細(xì)胞來源自小鼠畸胎瘤細(xì)胞，StricklandS等人，(1978)Cell15:393-403),所述非多能性細(xì)胞優(yōu)選是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的HEK293T細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何手段轉(zhuǎn)染,多能性細(xì)胞和多能性細(xì)胞，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒(例如腺病毒)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔等。優(yōu)選地使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。可以使用本領(lǐng)域熟知的各種方法檢測蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)以及核定位情況，例如通過Western印跡檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。通過使用我們以前研究中設(shè)計(jì)的p5N報(bào)告基因(其是一段人造重復(fù)序列連接在熒光素酶基閑前)(Pan,G.J.和Pei,D.Q.(2005)JBiolChem280:1401-1407),利用報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，可以檢測Nanog以及其突變體對于p5N報(bào)告基因的激活情況，從而驗(yàn)證它們的轉(zhuǎn)錄激活能力，以下的實(shí)施例中表明，核定位信號突變后的Nanog蛋白質(zhì)幾乎完全喪失了激活p5N報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活能力。除了熒光素酶基因外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知也可以使用其它報(bào)告基因用于指示Nanog的活性，例如胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖苷酶基因。另外，近來的研究表明，一系列可能被Nanog調(diào)控的基因，例如Rexl，Oct4等，也可以代替上述人造重復(fù)序列用于檢測Naong的轉(zhuǎn)錄激活活性(ShiW丄等人，(2006)JBiolChem281:23319-23325;ZhangX.F.等人，(2008)JBiolChem283:35825-35833)。本文所使用的遺傳工程的方法包括本領(lǐng)域已知的任何方法，如分子克隆技術(shù)、蛋白雜交技術(shù)、雙熒光報(bào)告系統(tǒng)活性檢測、免疫熒光反應(yīng)檢測等，這些方法4在Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F,M.Ausubel等人編著(1987))等多種參考文獻(xiàn)中均有詳細(xì)的描述。另外，由于上文中已經(jīng)描述了，本文中制備的核定位信號突變體(NLS1突變體，NLS2突變體以及NLS1/NLS2突變體)能夠影響Nanog的正常核定位，并且一定程度上抑制的野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活能力。因此，該突變體的構(gòu)建，可以作為一個(gè)很好的抑制型工具，為我們研究Nanog是如何行使作為轉(zhuǎn)錄因子的功能，以及它如何不需要LIF的情況下維持小鼠胚胎干細(xì)胞的多能性提供了借鑒意義。因此，本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的突變體作為抑制型工具研究Nanog功能的方法，以及其用于研究Nanog功能的用途。實(shí)施例下列實(shí)施例例舉了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，用于示例本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。這些實(shí)施例。根據(jù)本文公開和本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍水平，技術(shù)人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術(shù)，除非特別說明，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。實(shí)施例l:多能性細(xì)胞系的培養(yǎng)小鼠多能性細(xì)胞系(P19及F9細(xì)胞)培養(yǎng)在0.1。/。明膠包被基質(zhì)上，用添加了15。/。胎牛血清FBS(GIBCO)的培養(yǎng)基在37'C培養(yǎng)箱屮培養(yǎng)(參見Pan,G等人，(2005)JBiolChem280(2)，1401-1407)。實(shí)施例2:Nanog載體(SEQIDNO:l)的構(gòu)建用終體積為20ul的反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄2ug的總RNA(參見Pan，G等人，(2006)FasebJ20(10),1730-1732)，得到cDNA文庫。利用表l的引物擴(kuò)增小鼠N肌og片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收。表1:克隆Nanog片段的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過在pCR3.1載體的多克隆位點(diǎn)EcoRV插入PCR片段構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，即在37'C下通過EcoRV酶切pCR3.1載體(以下簡稱載體)4小時(shí)，然后將從多能性細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增的小鼠Nanog片段，在連接酶的存在下16'C連接4小時(shí)，得到野生型小鼠Nanog的真核表達(dá)載體。實(shí)施例3:核定位信號序列突變的小鼠Nanog真核表達(dá)載體的構(gòu)建通過PSORTlI軟件預(yù)測整個(gè)小鼠Nanog的氨基酸序列(SEQIDNO:5)后，我們發(fā)現(xiàn)在其保守Homeobox結(jié)構(gòu)域的氨基端和羧基端分別具有一個(gè)核定位信號(NuclearLocalizationSignal,NLS)，即核定位信號l(NLS1，RKQKMR，SEQIDNO:6)和核定位信號2(NLS2，RMKCKR，SEQIDNO:7)。我們利用分子生物學(xué)手段(點(diǎn)突變PCR技術(shù))，利用表2的特定的突變引物進(jìn)行定點(diǎn)突變，將核定位信號l和核定位信號2分別突變?yōu)闊o關(guān)的序列一GIQNMQ和GMNVDG，如圖1所示，得到目的突變體，S卩l(xiāng)突變mNanog(SEQIDNO:8)，2突變mNanog(SEQIDNO:9)和雙突變mNanog(SEQIDNO:10)。表l:小鼠Nanog抑制型突變體所用PCR引物:SEQIDNO引物名稱序列(5'3')SEQIDNO:11NLS1RK/GI突變-正義鏈ggagaacaaggtccttgccgggatccagaagatgcggactgtgttctcSEQIDNO:12NLSlRK/GI突變-反義鏈gagaacacagtccgcatcttctggatcccggca3ggaccttgttctccSEQIDNO:13NLS1KMR/NMQ突變-正義鏈ggtccttgccaggaagca肌catgcagactgtgttctctc3ggcccSEQUDNO:14NLS1KMR/NMQ突變-反義鏈gggcctgagagaacacagtctgcatgtttgcttcctggcaaggaccSEQIDNO:15NLS2RMK/GMN突變-正義鏈cctggtttcaaaaccaagggatgaactgcaagcggtggcagSEQIDNO:16NLS2RMK/GMN突變-反義鏈ctgccaccgcttgcagttcatcccttggttttgaaaccaggSEQIDNO:17NLS2CKR/VDG突變-正義鏈ggtttcaaaaccaaaggatgaaggtcgacgggtggcagaaaaaccagtggSEQIDNO:18NLS2CKR/VDG突變-反義鏈ccactgg腦ctgccacccgtcgaccttcatcctttggttttgaaacc實(shí)施例4:Westem印跡反應(yīng)檢測野生型Nanog及其突變體的表達(dá)將構(gòu)建正確的野生小鼠Nanog和核定位信號的突變體對于蛋白質(zhì)印跡分析(參見PanGuangjing等人,(2005)JBiolChem280(2)，1401-1407)將上述裂解的細(xì)胞系用PBS洗滌，用RIPA緩沖液(50mMTris-HCL,pH7.5，150mMNaCl，0.25°/。脫氧膽酸鈉，0.1%NP40，0.1%TritonX-100)在冰上裂解10分鐘后超聲，并15000rpm4'C離心15分鐘去掉細(xì)胞殘骸。加入等體積2xSDS上樣緩沖液煮沸5分鐘后，細(xì)胞裂解液用10%SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，MA)。上述膜用5%脫脂牛奶封閉并用小鼠抗Nanog抗體(l:1000,ABCAM，批號237819)孵育3小時(shí)，再用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠二抗(1:5000,Sigma，St丄ouis，MO)孵育1小時(shí)。然后用TBS和TBST交替洗滌上述膜各三次，每次5分鐘。最后用化學(xué)發(fā)光顯色法進(jìn)行顯影。從圖2中可以看出，野生mNanog及l(fā)突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog都可以很好的表達(dá)，足以進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)施例5:野生Nanog及突變體在細(xì)胞內(nèi)的定位在分析Nanog及其突變體在細(xì)胞內(nèi)定位的實(shí)驗(yàn)中，我們首先利用Lipofectamine2000(InvitrogenCA，USA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型Nanog及l(fā)突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog。24小時(shí)后，我們將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，用PBS清洗1次；然后加入適量含有4%多聚甲醛的固定液，室溫固定30分鐘；用8含有2毫克/毫升甘氨酸的PBS溶液，室溫放置5niin淬滅醛基吸掉固定液，加入還有0.2^TritonX-100的PBS;室溫放置10分鐘來透化細(xì)胞，用PBS洗2次；用含有10%正常羊血清(NormalGoatSerum，NGS)的PBS，室溫封閉60分鐘；用稀釋到含有2XNGS的PBS中的一抗室溫孵育60分鐘或者4'C過夜；然后ffl洗液搖蕩清洗玻片5次，每次5分鐘；將TRITC標(biāo)記的二抗稀釋到含有2XNGS的PBS中，室溫孵育60分鐘；用洗液清洗玻片5次，每次5分鐘用含有0.1-1毫克/毫升DAPI的PBS染細(xì)胞核1分鐘后，放置十PBS中，用封片液或者90%的甘油封片后，放置片盒中備用。雖然野生型和突變體在細(xì)胞內(nèi)都產(chǎn)生能用蛋白質(zhì)雜交檢測到到的完整的蛋白質(zhì)(圖2),但二者在細(xì)胞水平上的定位卻有很大差異。如圖3所示，野生型Nanog蛋白(a)完全定位在細(xì)胞核中，而將核定位信號序列突變后的三個(gè)突變體蛋白(l突變mNa加g,b;2突變r(jià)nNanog，c;雙突變mNanog,d)卻有部分蛋白滯留在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。這些初步結(jié)果表明，Nanog蛋白中的兩個(gè)NLS序列對于Nanog的正確核定位至關(guān)重要。實(shí)施例6:野生Nanog及突變體對報(bào)告基因p5N的激活我們以甜的研究已經(jīng)表明，Nanog對我們所構(gòu)建的p5N報(bào)告基因(以下簡稱報(bào)告基因)有十幾倍的激活作用(和空載體相比)，該p5N報(bào)告基因可以用以檢測Nanog的活性(Pan，GJ.和Pei，D.Q.(2005)JBiolChem280:1401-1407)。在本實(shí)施例的圖4巾，我們首先驗(yàn)證了我們所構(gòu)建的小鼠野生mNanog可以很好的激活自身的p5N報(bào)告基因，即在非多能性細(xì)胞HEK293T細(xì)胞中可以激活p5N報(bào)告基因10倍左右，在多能性細(xì)胞P19中可以激活p5N報(bào)告基因16倍左右，而在多能性細(xì)胞F9中可以激活p5N報(bào)告基因40倍左右。其次，我們驗(yàn)證了在所用到的非多能性細(xì)胞系和多能性細(xì)胞系中，所構(gòu)建的突變體(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變inNanog)兒乎完全喪失了激活p5N報(bào)告基因的能力。在報(bào)告基因分析中，種植在24孔板中的HEK293T非多能性細(xì)胞系和P19、F9多能性細(xì)胞系用Lipofectamine2000anvitrogenCA,USA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p5N報(bào)告基因(每孔0.2微克)和效應(yīng)質(zhì)粒(effectorplasmid)(每孔0.4微克)，參見生產(chǎn)商的說明書。同時(shí)共轉(zhuǎn)染pCMV-Renilla質(zhì)粒(每24孔板共轉(zhuǎn)染2納克，Promega，WI)作為內(nèi)參，并且所有孔轉(zhuǎn)染的DNA總量用載體補(bǔ)齊。36小時(shí)后，細(xì)胞用PBS洗滌，并用50微升的lxPLB緩沖液(Promega，WI)裂解。用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析系統(tǒng)(Promega，CA)和TD2020光度計(jì)(TurnerDesign,CA)測量熒光素酶活性。每個(gè)轉(zhuǎn)染都成對進(jìn)行，并至少重復(fù)五次。由圖4可以看出，將小鼠Nanog的核定位信號序列突變后，無論是一個(gè)突變還是兩個(gè)都突變，突變體對于p5N報(bào)告基因都完全喪失了激活能力，這在研究Nanog的功能研究中有深遠(yuǎn)的意義，說明了保守Homeobox結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛∈驨anog作為轉(zhuǎn)錄因子是很重要的。實(shí)施例7:核定位信號序列的突變不影響Nanog形成二聚體的能力文獻(xiàn)報(bào)道顯示Nanog可以通過羧基端形成同源二聚體(WangJ等人，(2008)PNAS105:8801-8802)。9為闡明兩個(gè)NLS序列是否會影響Nanog形成二聚體的能力，我們進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。我們將帶有Flag標(biāo)簽的Nanog與帶有Myc標(biāo)簽的野生型Nanog(野生Nanog-F)及NLS突變體Nanog的表達(dá)質(zhì)粒(l突變Nanog-myc、2突變Nanog-myc以及雙突變Nanog-myc)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染后，利用抗Flag的樹脂柱子進(jìn)行免疫沉淀。我們知道帶有Flag標(biāo)簽的Nanog蛋白會與抗Flag的樹脂柱子結(jié)合而被沉淀下來，而帶有myc標(biāo)簽的蛋白如果不是和帶有Flag標(biāo)簽的Nanog蛋白相互作用的話就不會被沉淀下來，若帶有myc標(biāo)簽的NLS突變體Nanog能夠與帶Flag標(biāo)簽的Nanog形成二聚體則也會同時(shí)被沉淀出來。然后用抗myc的抗體進(jìn)行免疫印跡來檢測沉淀產(chǎn)物，我們就會發(fā)現(xiàn)如果一.者能發(fā)生相互作用就可以檢測到一條目的條帶，反之則沒有任何條帶。如圖5所示，野生型Nanog能夠與含有myc標(biāo)簽的野生型Nanog形成二聚體，在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測到一條帶(lane14),說明該系統(tǒng)能夠成功檢測Nanog是否如文章報(bào)道能形成同源二聚體。在同樣條件下，我們分別驗(yàn)證了l突變Nanog、2突變Nanog以及雙突變Nanog與帶FIag標(biāo)簽的野生型Nanog能形成二聚體。這些結(jié)果表明，這兩個(gè)NLS序列在突變后并不影響Nanog形成二聚體的能力實(shí)施例8:突變體Nanog影響野生型Nanog在細(xì)胞內(nèi)的定位既然核定位信號突變體Nanog本身影響了Nanog的核定位情況，并且使其本身喪失了轉(zhuǎn)錄激活功能，同時(shí)并不影響Nanog形成二聚體的能力。為了驗(yàn)證這些突變體是否通過與野生Nanog相互作用而干擾野生型Nanog的核定位，我們在將含有GFP標(biāo)簽的野生型Nanog分別和含有myc標(biāo)簽的核定位信號突變體Nanog(1突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)共同轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，進(jìn)行實(shí)施例5中的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，來觀察這些突變體是否會影響野生型小鼠Nanog的核定位情況。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)由于核定位信號突變體的原因，野生型Nanog的一部分蛋白被滯留在細(xì)胞質(zhì)中(比較，圖6中a，b，c，d)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核定位信號突變體一l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog影響了小鼠Nanog的正常核定位。實(shí)施例9:突變體Nanog影響野生型Nanog對p5N報(bào)告基因的激活能力同樣，核定位信號突變體Nanog本身影響了野生型Nanog的核定位情況，由于突變體Nanog本身喪失了轉(zhuǎn)錄激活功能，同時(shí)并不影響Nanog形成二聚體的能力。為了驗(yàn)證這些突變體是否通過與野生Nanog相互作用而影響野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活能力。在本實(shí)施例中，我們將突變型Nanog(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)與野生型Nanog在p5N報(bào)告基因的存在下共同轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行p5N報(bào)告基因激活能力的分析(如實(shí)施例6)，來驗(yàn)證NLS突變體Nanog是否能影響野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活功能。結(jié)果如圖7所示，不管是在非多能性細(xì)胞HEK293T細(xì)胞中還是在多能性細(xì)胞P19和F9細(xì)胞中，在野生型Nanog的量保持一致的基礎(chǔ)上，隨著突變體轉(zhuǎn)染劑量的增加，野生型小鼠Nanog激活p5N報(bào)告基因的能力受到一定程度的抑制(比較lane2-8)。這表明，突變體Nanog(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)能夠影響野生Nanog的轉(zhuǎn)錄激活能力。通過以上的實(shí)驗(yàn)，我們得出核定位信號突變體一1突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog,一方面喪失了各自的轉(zhuǎn)錄激活功能及正常的核定位；另一方面，通過和野生型Nanog的相互作用來干擾抑制野生型Nanog的正常核定位和激活p5N報(bào)告基因S的能力，因而發(fā)揮著抑制型突變體的功能。因此，可以作為很有力的小鼠Nanog的抑制型工具，方便Nanog的功能研究。序列表<110〉清華大學(xué)中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〈120〉Nanog抑制荊突變體及其在Nanog功能研究中的應(yīng)W<130>參考<160>33<170〉Patentln版本3.3<210〉1<211〉918<212>DNA<23>小鼠(Musmusculus)<220〉<221>Nanog基閃<400>1atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccaggaagcagaagatgcgg300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaaaggatgaagtgcaagcggtggcagaaaaaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgaatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga918<210〉2<211〉61<212〉PRT<213>小鼠<220><221>NanogHomeobox結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)〈400〉2ArgLysGinLysMetArgThrValPheSerGinAlaGinLeuCysAlaLeuLysAspArg15101520PheGinLysGinLysTyrLeuSerLeuGinGinMetGinGluLeuSerSerlieLeuAsn25303540LeuSerTyrLysGinValLysThrTrpPheGinAsnGinArgMetLysCysLysArgTrpGin45505560<210>3<211>28<212>薩<213>引物<400〉3accatgagtgtgggtcttcctggtcccc28<210>4<211>25<212>腿<213>引物13<400>4ctctgtgactccaccaggtgaaata25<210><211〉<212>〈213>5305PRT小鼠<220〉<221〉Nanog蛋白質(zhì)<400>5MetSerValGlyLeuProGlyProHisSerLeuProSerSerGluGluAlaSerAsnSer15101520GlyAsnAlaSerSerMetProAalValPheHisProGluAsnTyrSerCysLeuGinGly25303540SerAlaThrGluMetLeuCysThrGluAalAlaSerProArgProSerSerGluAspLeu45505560ProLeuGinGlySerProAspSerSerThrSerProLysGinLysLeuSerSerProGlu65707580AlaAspLysGlyProGluGluGluGluAsnLysValLeuAlaArgLysGinLysMetArg859095100ThrValPheSerGinAalGinLeuCysAlaLeuLysGluArgPheGinLysGinLysTyr105110115120LeuSerLeuGinGinMetGinGluLeuSerSerlieLeuAsnLeuSerTyrLysGinVal125130135140LysThrT卬PheGinAsnGinArgMetLysCysLysArgTrpGinLysAsnGinTrpLeu14515015516014LysThrSerAsnGlyLeulieGinLysGlySerAlaProValGluTyrProSerlieHis165170175180CysSerTyrProGinGlyTyrLeuValAsnAalSerGlySerLeuSerMetTrpGlySer185190195200GinThrTrpThrAsnProThrTrpSerSerGinThrTrpThrAsnProThrTrpAsnAsn205210215220GinThrTrpThrAsnProThrTrpSerSerGinAlaTrpThrAlaGinSerTrpAsnGLy225230235240GinProTipAsnAlaAlaProLeuHisAsnPheGlyGluAspPheLeuGinProTyrVal245250255260GinLeuGinGinAsnPheSerAlaSerAspLeuGluValAsnLeuGluAlaThrArgGlu265270275280SerHisAlaHisPheSerThrProGinAlaLeuGluLeuPheLeuAsnTyrSerValThr285290295300ProProGlyGlulie*305<210>6<211>6<212>PRT<213>小鼠<220><221>Nanog核定位信號1蛋白質(zhì)<400>6ArgLysGinLysMetArg15〈210〉7<211>6<212>PRT〈213〉小鼠<220><221>Nanog核定位信號2蛋白質(zhì)<400>7ArgMetLysCysLysArg15<210>8<211>918〈212>DNA<213>小鼠(Musmusculus)<220><221>1突變mNanog基因<400>8atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaa/ttct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccgggatccagaacatgcag300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaaaggatgaagtgcaagcggtggcagaaaaaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttgga3tgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagc犯朋cttctctgcc3gtgstttgg3ggtgaatttgg犯gccactaggg朋840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaateitga918〈210>9<211〉918〈212〉■〈213>小鼠(Musmusculus)<220〉〈221〉2突變mNanog基因〈400〉9atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccaggaagcagaagatgcgg300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaagggatgaacgtcgacgggtggcagaaaaaccagtggttg棚aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgeiatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga918<210>10〈211>918〈212〉腿〈213〉小鼠(Musmusculus)<220><221〉雙突變mNanog基因〈400〉10atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctceitcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaeiggtccttgccgggatccagaacatgcag300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaagggatgaacgtcgacgggtggcaga犯aaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgaatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga918<210〉11<211>48<212>DNA<213>引物<400>11ggagaacaaggtccttgccgggatccagaagatgcggactgtgttctc48〈210>12〈211〉48<212>腿<213>引物<400>12gagaacacagtccgcatcttctggatcccggcaaggaccttgttctcc48〈210>13<211〉46<212>DNA<213>引物<400>13ggtccttgccaggaagcaaacatgcagactgtgttctctcaggccc46<210>14<211>46<212>DNA<213>引物<400>14gggcctgagagaacacagtctgcatgtttgcttcctggcaaggacc46<210>15<211>41〈400〉15cctggtttcaaaaccaagggatgaactgcaagcggtggcag41<210>16<211>41<212>DNA<213>引物<400>16ctgccaccgcttgcagttcatcccttggttttgaaaccagg41〈210>17<211>50〈212>DNA<213>引物<400>17ggtttcaaaaccaaaggatgaaggtcgacgggtggc卿aaaaccagtgg50<210>18<211>50<212>薩<213〉引物<400>18ccactggtttttctgccacccgtcgaccttcatcctttggttttgaaacc50權(quán)利要求1.Nanog的核定位信號被突變的核定位序列突變蛋白質(zhì)，其中核定位信號1和/或核定位信號2被失功能突變，從而影響Nanog蛋白質(zhì)的核內(nèi)定位的能力，但是其仍然能與野生型Nanog形成異源二聚體，并且抑制野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活功能。2.權(quán)利要求1中的突變蛋白質(zhì)，其中所述失功能突變是將核定位序列突變成無關(guān)序列。3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其中Nanog的核定位信號1如SEQIDNO:6所示，和/或核定位信號2如SEQIDNO:7所示。4.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)中核定位信號1的序列被突變?yōu)樾蛄蠫IONMQ，和/或核定位信號2的序列被突變?yōu)樾蛄蠫MNVDG。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的突變的蛋白質(zhì)，其中所述Nanog來源于小鼠。6.編碼權(quán)利要求1或2所述的突變蛋白質(zhì)的核酸。7.如權(quán)利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:8所示。8.如權(quán)利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:9所示。9.如權(quán)利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:10所示。10.如權(quán)利要求7-10所述的核酸所編碼的蛋白質(zhì)。11.獲得包含能夠表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的突變蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)質(zhì)粒的方法，其中，所述方法包括(a)使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體構(gòu)建野生型Nanog基因的真核表達(dá)質(zhì)粒；(b)將(a)中構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行目的氨基酸的點(diǎn)突變得到突變體；(c)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細(xì)胞內(nèi)定位上進(jìn)行比較；(d)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活能力上進(jìn)行比較；(e)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因共同轉(zhuǎn)染，檢測(b)中得到的突變體對(a)中得到的野生型基因的細(xì)胞內(nèi)定位的影響；(f)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基肉共同轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞中檢測(b)中得到的突變體存在時(shí)，對于(a)中得到的野生型基因的轉(zhuǎn)錄激活能力的影響；(g)選擇對于野生型Nanog的細(xì)胞內(nèi)定位以及轉(zhuǎn)錄激活能力具有影響的突變體。12.使用權(quán)利要求卜5中任一項(xiàng)的突變蛋白質(zhì)作為Nanog的抑制型突變體工具抑制Nanog轉(zhuǎn)錄激活能力，從而研究Nanog功能的方法。13.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的突變蛋白質(zhì)用于通過抑制N肌og的轉(zhuǎn)錄激活能力來研究Nanog在細(xì)胞中的功能的用途。14.使用權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的突變的核酸作為Nanog的抑制型突變體工具抑制Nanog轉(zhuǎn)錄激活能力，從而研究Nanog功能的方法。15.權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的突變的核酸用于通過抑制Nanog的轉(zhuǎn)錄激活能力來研究Nanog在細(xì)胞中的功能的用途。全文摘要本發(fā)明涉及通過將位于Nanog保守結(jié)構(gòu)域Homeobox(序列見SEQIDNO2)中的核定位信號1和/或2突變成無關(guān)序列，破壞其功能，來得到抑制型Nanog突變體，其中所述突變體仍然具有與野生型Nanog形成異源二聚體的能力，并且抑制了野生型Nanog的轉(zhuǎn)錄激活功能，作為抑制型突變體而發(fā)揮功能，因此可能作為一個(gè)非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。文檔編號C07K14/47GK101492502SQ20091003721公開日2009年7月29日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日發(fā)明者娟張,張小飛,裴端卿申請人:清華大學(xué);中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院