組成型活性uPAR變體及其在抑制性抗體的生成與分離中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)的變體，所述變體顯示顯著增加的玻連蛋白(VN)結(jié)合活性，這可能因VN結(jié)合位點的更有效暴露所致。本發(fā)明還涉及針對所述uPAR變體產(chǎn)生的抗體，其能夠結(jié)合uPAR的VN結(jié)合位點，然后作為uPAR功能抑制劑起作用，作為VN活化的uPAR功能的功能拮抗劑起作用。在本發(fā)明中，此類抗體是單克隆、多克隆抗體，其合成或重組衍生物，如來自噬菌體展示文庫的合成抗體(scFv)。本發(fā)明的抗體作為競爭性拮抗劑起作用。
【專利說明】組成型活性uPAR變體及其在抑制性抗體的生成與分離中的應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0001 ] 尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR，也稱為⑶87)是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨著子固定在質(zhì)膜上的膜糖蛋白。所述尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及其受體(uPAR)在生理學(xué)過程(例如傷口愈合、炎癥和干細胞動員)以及嚴重病理學(xué)病癥(例如HIV-1感染、腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。所述尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)是在炎癥過程中和幾乎所有人類癌癥中過表達的質(zhì)膜受體。uPAR在腫瘤細胞粘附、遷移、侵入和增殖中的重要作用使該受體成為癌癥治療中吸引人的藥物靶點。就抑制腫瘤生長而言，已經(jīng)或正在開發(fā)抑制uPA系統(tǒng)的若干治療方案。uPAR除在調(diào)節(jié)細胞外周蛋白水解中的明確的作用以外，其還通過與胞外基質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)(包括玻連蛋白(VN))相互作用來調(diào)節(jié)細胞的粘附、遷移和增殖。
[0002]盡管充分記錄了與VN相互作用的重要性(Madsen等，2007 ；Smith等，2008)，該相互作用對uPAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性至關(guān)重要，但該相互作用在體內(nèi)的重要性仍未經(jīng)闡明。
[0003]定向VN相互作用是必要的，并且足以引發(fā)uPAR誘導(dǎo)的細胞形態(tài)、遷移以及定向側(cè)接蛋白-蛋白相互作用的獨立信號傳導(dǎo)的變化。uPAR和VN之間的單獨相互作用可能是由uPAR引發(fā)的多種蛋白質(zhì)水解非依賴性生物作用的原因。開發(fā)所述uPAR/玻連蛋白相互作用的抑制劑是另一 個吸引人的靶標(biāo)，并且可從玻連蛋白的結(jié)合uPAR的生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域開始，其為天然且有力的uPAR/玻連蛋白相互作用拮抗劑。
[0004]有數(shù)個國際申請公開了尿激酶受體的肽配體，例如W001/17544。
[0005]W097/35969公開了能夠結(jié)合uPAR并抑制整聯(lián)蛋白與玻連蛋白結(jié)合的肽。該文獻并未提及uPA結(jié)合。所述文獻中沒有確定所述肽在uPAR中的結(jié)合位點，并且沒有關(guān)于所述肽的功能阻斷活性的數(shù)據(jù)。
[0006]W02008/073312涉及尿激酶型纖溶酶原激活物受體表位和由其衍生的單克隆抗體。該文獻公開了對尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)具有特異性的抗體及其抗原結(jié)合片段、以及它們在癌癥治療或預(yù)防中的用途。具體地，所述公開的抗體對uPAR上的特定表位具有特異性。W02008/073312中描述的抗體識別的表位與本發(fā)明所述那些不重疊。
[0007]Rabbani SA 等(Neoplasia(2010) 12，778-788)測試了給予單克隆抗 uPAR 抗體(ATN-658)對體外和體內(nèi)前列腺癌發(fā)展的影響。ATN-658(小鼠IgGl)能夠以高親和性結(jié)合uPAR的D2D3 (Kd約為InM)，不抑制uPA與uPAR的結(jié)合，并且甚至能夠與結(jié)合了 uPA的uPAR結(jié)合。本研究中使用的抗體(ATN-658)在W02008/073312中有所描述。由ATN-658抗體識別的表位與本發(fā)明描述的那些不重疊。所述ATN-658抗體不是uPAR/玻連蛋白相互作用的競爭性拮抗劑，因為它不與uPAR中的玻連蛋白結(jié)合位點結(jié)合。uPAR中與所述ATN-658抗體結(jié)合的表位和另一種透徹研究的單克隆抗體R2相似或相同(Sidenius等.JBC (2002) 27727982-90)。ATN-658與完整的uPAR和截短的D2D3受體的結(jié)合性一樣好。因此，其中所述的抗體不與完整uPAR優(yōu)先結(jié)合。
[0008]W02005/116077鑒定了對二元uPA_uPAR復(fù)合物、對含uPA_uPAR的三元復(fù)合物以及對uPAR與除uPA以外的蛋白質(zhì)(例如整聯(lián)蛋白)的復(fù)合物具有特異性的抗體或其它配體。這些抗體抑制uPA和uPAR的復(fù)合物與其它分子間的相互作用。此類抗體或其它配體被用在診斷和治療方法，特別是抗癌的診斷和治療方法中。所述文獻涉及不抑制玻連蛋白結(jié)合但抑制玻連蛋白成分組裝的配體；此外，它們識別的表位與本文所述那些不重疊。
[0009]W02006/094828公開了優(yōu)先識別uPAR受體的截短形式和可溶形式(D2D3)的抗體。其中所述的抗體不優(yōu)先結(jié)合完整uPAR。
[0010]CN101050237公開了能夠阻斷uPA和uPAR之間相互作用的化合物及其應(yīng)用。所述化合物包括uPA的ATF、ATF片段、uPAR片段、抗ATF抗體和抗uPAR抗體。所述化合物可阻斷uPA和uPAR之間的相互作用，并且可用于制備預(yù)防和治療動脈粥樣硬化所用的藥物。
[0011]Tressler RJ 等人(APMIS.1999 年 I 月；107 (I): 168-73)公開了基于人和鼠尿激酶的生長因子結(jié)構(gòu)域的尿激酶受體拮抗劑。此類拮抗劑顯示對它們的同源受體具有亞納摩爾級親和力。通過制備與人IgG恒定區(qū)的融合體來進一步修飾這些分子，導(dǎo)致具有高親和性和體內(nèi)長半衰期的分子。通過噬菌體展示和肽類似物合成的組合已獲得較小的肽抑制劑。所有這些分子抑制uPA的生長因子結(jié)構(gòu)域與uPA受體的結(jié)合并且增強uPA受體與玻連蛋白的結(jié)合。
[0012]Gardsvoll H 等，(J Biol Chem, 2011 年 9 月 23 日；286 (38): 33544-56)提出一種使uPA和玻連蛋白 協(xié)作以加強在玻連蛋白基質(zhì)上的uPAR依賴性板狀偽足引入的模型；這就暗示著靶向uPAR功能的藥物開發(fā)，即，表位定位的單克隆抗體。該研究中被研究的抗體都不阻斷玻連蛋白在uPA的存在下結(jié)合uPAR。
[0013]因此，需要 優(yōu)先結(jié)合完整uPAR的抗體以作為uPAR功能的有力抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明涉及所述尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)的獨特變體，其顯示顯著增加的玻連蛋白(VN)結(jié)合活性(表觀Kd增加>10.000倍)，這可能是因更有效地暴露了VN結(jié)合位點所致。
[0015]作者表示，針對所述uPAR變體產(chǎn)生的單克隆抗體是uPAR功能的有力抑制劑?？贵w結(jié)合表位作圖顯示，這些抗體與uPAR的VN結(jié)合位點結(jié)合，這將它們分類為競爭性拮抗劑。
[0016]作者還顯示使用上述uPAR變體從曬菌體展示庫分離合成的抗體(scFv)是uPAR的功能抑制劑。所述受抑制的功能是:細胞粘附(圖11)和因而的細胞遷移和細胞增殖(其為與細胞粘附相關(guān)的下游事件)。這些功能是VN依賴性的。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]本發(fā)明的目的是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)變體分子，其相比野生型分子具有增強的VN結(jié)合活性。
[0019]本發(fā)明的uPAR變體分子優(yōu)選包含與以下部分連接的野生型uPAR氨基酸序列:
[0020]a)連接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生長因子樣結(jié)構(gòu)域(GFD)序列，和/或
[0021]b)連接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗體分子的Fe區(qū)域的鏈，
[0022]其中，如果Fe區(qū)域的所述鏈存在，則所述uPAR變體分子是二聚體。
[0023]就“野生型uPAR氨基酸序列”而言，其意在指保持VN結(jié)合活性的全長野生型蛋白質(zhì)或其片段的序列。
[0024]在一個優(yōu)選實施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID N0:1的成熟huPAR的氨基酸32-92組成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸32-93組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0025]更優(yōu)選地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271組成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸3-270組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0026]甚至更優(yōu)選地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277組成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸1-273組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。[0027]在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2組成的序列，或由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0028]在本發(fā)明中，uPA的GFD序列優(yōu)選包含基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD的氨基酸11-42組成的序列，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43組成的序列，或來自GDF直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0029]在本發(fā)明的uPAR變體分子中，uPA的GFD序列優(yōu)選基本以下物質(zhì)序列組成:SEQID NO: 3的人uPA的GFD序列，或SEQ ID NO: 4的小鼠uPA的GFD序列，或來自GFD直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0030]在本發(fā)明中，所述Fe區(qū)域的鏈優(yōu)選是人源性并且包含基本由SEQ ID N0:5組成的序列，或所述Fe區(qū)域的鏈優(yōu)選是小鼠源性并且包含基本由SEQ ID N0:6組成的序列或來自Fe區(qū)域的鏈直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0031]在本發(fā)明的uPAR變體分子中，所述Fe區(qū)域的人鏈(human chain)優(yōu)選基本由SEQID NO: 5組成，或者所述小鼠Fe區(qū)域優(yōu)選由SEQ ID NO: 6組成，或由來自Fe區(qū)域人鏈的直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽組成，或其功能突變體或衍生物或類似物。
[0032]在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的uPAR變體分子還包含:
[0033]a)在uPA的GFD序列和野生型uPAR序列的N末端之間的第一接頭區(qū)域,和/或
[0034]b)在抗體分子Fe區(qū)域的鏈和野生型uPAR序列的C末端之間的第二接頭區(qū)域。
[0035]優(yōu)選地，所述第一接頭區(qū)域基本由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列組成。
[0036]所述第二接頭區(qū)域優(yōu)選基本由SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:11的序列組成。
[0037]在一個優(yōu)選實施方式中，所述uPAR變體分子包含的序列基本具有SEQ ID NO: 12、
13、14、15、16 或 17 的序列。
[0038]本發(fā)明的另一個目的是本發(fā)明的uPAR變體分子作為抗原在獲得具有uPAR功能拮抗劑活性的特異性抗體中的應(yīng)用，或在選擇所述抗體的重組體或合成的抗原結(jié)合片段中的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明的另一個目的是能夠結(jié)合上述尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)變體的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段優(yōu)選具有uPAR功能拮抗劑活性。
[0040]所述抗體可用于人類治療應(yīng)用。所述抗體通常是完全人抗體，或嵌合或人源化的，以在給予患者時使針對所述抗體的免疫應(yīng)答的風(fēng)險最小化。如本文所述，可從此類抗體設(shè)計或衍生出其它抗原結(jié)合分子，例如，抗原結(jié)合抗體片段、抗體衍生物和多特異性分子。
[0041]此類抗體的抗體結(jié)合片段，以及包含此類抗原結(jié)合片段的分子，包括工程改造的抗體片段、抗體衍生物、雙特異性抗體和其它多特異性分子等，也是本發(fā)明的目的。[0042]在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合uPAR分子的表位，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸殘基中的至少一種。
[0043]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含如下至少一個重鏈互補決定區(qū)(⑶RH3)氨基酸序列，所述重鏈互補決定區(qū)(⑶RH3)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21或25的氨基酸90-102、SEQID NO:24以及SEQ ID NO:22或23的氨基酸90-101 ;和/或如下至少一個重鏈互補決定區(qū)(CDRH2)氨基酸序列，所述重鏈互補決定區(qū)(CDRH2)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57 ;和/或如下至少一個重鏈互補決定區(qū)(CDRHl)氨基酸序列，所述重鏈互補決定區(qū)(CDRHl)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21或24的氨基酸22-26, SEQ ID NO: 25 的氨基酸 17-26。
[0044]優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含如下至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRL3)氨基酸序列，所述輕鏈互補決定區(qū)(CDRL3)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:65、66、67、68或69，和SEQ ID N0:74或85的氨基酸80-87 ;和/或如下至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRL2)氨基酸序列，所述至少一個輕鏈互補決定區(qū)(⑶RL2)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID N0:65、66、67、68和69的氨基酸41-47 ;和/或至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRLl)氨基酸序列，所述輕鏈互補決定區(qū)(⑶RLl)氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68 和 69 的氨基酸 15-23。
[0045]在一個優(yōu)選實施方式中，上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含與SEQID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、分別與SEQ ID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及分別與SEQ ID NO: 18、19、20或21的氨基酸90-102或SEQ ID NO: 24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的⑶RH3氨基酸序列。
[0046]在另一個優(yōu)選實施方式中，上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含與SEQID NO: 25的氨基酸17-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、與SEQ ID NO: 25的氨基酸41-57具有至少80%相同性的⑶RH2氨基酸序列，以及與SEQ ID NO: 25的氨基酸90-102具有至少80%相同性的⑶RH3氨基酸序列。
[0047]在又一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段還包含與SEQ ID N0:65、66、67、68或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、分別與SEQ ID N0:65、66、67、68或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分別與SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的⑶RL3氨基酸序列。
[0048]在又一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段還包含:與SEQ ID N0.18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、分別與SEQ ID N0.18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列、分別與SEQ ID N0:18、19、20或21的氨基酸90-102，或SEQ ID N0:24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列，分別與SEQ ID NO: 66、65、68、67或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、分別與SEQ ID NO:66、65、68、67或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分別與SEQ ID N0:66、65、68、67或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0049]在另一方面，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ.1D N0:18、19、20、21、24和25，所述輕鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:65、66、67、68或69。
[0050]在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO: 18、19、20、21和24，所述輕鏈可變區(qū)包含與分別選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:66、65、68、67和69。
[0051]在本發(fā)明中，“至少80%相同性”指所述相同性可以是與提及序列的至少80%或至少85%或90%或95% 或100%的序列相同性。
[0052]優(yōu)選地，上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段是單克隆抗體或嵌合或人源化的，或去免疫化的或完全人抗體。
[0053]本發(fā)明的又一個目的是作為藥物使用的上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，特別是用于癌癥治療，優(yōu)選是前列腺癌治療。
[0054]本發(fā)明的另一個目標(biāo)是編碼上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，或與上述核酸雜交，或由其簡并序列組成的核酸分子。本發(fā)明的另一個目的是編碼本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段的表達載體。本發(fā)明的另一個目的是包含上述核酸的宿主細胞。優(yōu)選地，所述宿主細胞產(chǎn)生本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
[0055]本發(fā)明的另一個目的是產(chǎn)生本發(fā)明抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生上述抗體的細胞并從細胞培養(yǎng)物回收所述抗體。
[0056]在本發(fā)明中，公開的⑶R的突變體可通過使所述⑶R序列中的一個或多個氨基酸突變來產(chǎn)生。已知合適位于CDR中的單氨基酸取代就足可改善親和性。研究人員已采用定點突變來使一些免疫球蛋白產(chǎn)物的親和性增加約10倍。這種通過使CDR突變來增加或減少(即，調(diào)節(jié))抗體親和性的方法是常識(參見，例如，Paul，W.E.，1993)。因此，使本發(fā)明CDR發(fā)生氨基酸取代、缺失或添加以增加或減少(即，調(diào)節(jié))結(jié)合親和性或特異性也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0057]簡潔起見，可用以下名稱來表示本發(fā)明的優(yōu)選抗體:10H6(包含SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:65)、8B12(包含 SEQ ID N0:18 和 SEQ ID N0:66)、13D11 (包含 SEQ ID NO: 21SEQ ID NO: 67)、19.10(包含 SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO: 68)、AL6 (包含 SEQ ID NO:24 和SEQ ID N0:69)(如圖9所示)、0MD4(包含SEQ ID NO:25)(如圖22所示)。雖然本發(fā)明著眼于此類抗體以作為本發(fā)明的示例，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，一旦確定本公開內(nèi)容，其它類似的抗體及其抗體片段，以及這些類似抗體的抗體片段的產(chǎn)生和使用都落在本發(fā)明范圍內(nèi)。此類類似抗體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過合理量的實驗來產(chǎn)生。
[0058]另優(yōu)選所述抗體是含有所述表位結(jié)合區(qū)的SCFV、FV片段、Fab片段、F(ab)2片段、多聚體抗體、肽或蛋白水解片段。優(yōu)選所述scFv片段包含
[0059]a) SEQ ID NO: 22和/或74 (本文以名稱3B6表示，如表3所示)或b) SEQ ID NO: 23和/或85 (本文以名稱3C10表示，如表3所示)。
[0060]包含本發(fā)明抗體的試劑盒或其它物品也是本發(fā)明的部分。
[0061]本發(fā)明的另一個目的是包含上述至少一種抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，以及合適的稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。所述組合物包含有效量的所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。藥物組合物在該領(lǐng)域中是常規(guī)的，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于一般常識來制備。包含所述抗體和/或其片段和/或重組衍生物和/或偶聯(lián)物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體混合的藥物組合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0062]治療和/或預(yù)防對象內(nèi)癌癥的方法也是本發(fā)明的目的，所述方法包括給予需要的對象治療有效量的上 述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的一個目的是減少和/或抑制uPAR的方法，所述方法包括給予有效量的上述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
[0063]本發(fā)明提供包含治療有效量的本文公開的抗體、pH保持在約4.5~約6.5的緩沖液和可任選的表面活性劑的制劑。所述制劑典型地用于本發(fā)明公開的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其活性濃度原則為約0.lmg/ml~約100mg/ml。在某些實施方式中，所述抗體、其重組或合成抗原結(jié)合片段的濃度是約0.lmg/ml~lmg/ml ;優(yōu)選為lmg/ml~10mg/ml，優(yōu)選為10~100mg/ml。出于本文目的，“藥物組合物”是適合且合適給予哺乳動物，尤其是人的藥物組合物。因此，所述組合物可用于治療哺乳動物中的疾病或病癥。此外，所述組合物中的抗體已經(jīng)過一次或多次純化或分離步驟，從而已將可能對其治療應(yīng)用產(chǎn)生干擾的污染物分離在外。所述藥物組合物通常包含治療性的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的運載體或稀釋劑。所述組合物通常是無菌的，并且可被凍干。下文對藥物制備進行更詳細的描述?？赏ㄟ^使具有所需純度的抗體和可任選的生理學(xué)上可接受的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第 16 版,Osol, A.編，1980)混合來制備凍干制劑或水溶液形式的所述一種或多種抗體的治療制劑?？山邮艿倪\載體、賦形劑或穩(wěn)定劑就使用的劑量和濃度而言是對接受者無毒的，并且可包括緩沖液、抗氧化劑、防腐劑、肽、蛋白質(zhì)、親水性聚合物、螯合劑(例如EDTA)、糖類、成鹽的反荷離子(如鈉)；金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑(例如TWEEN?、PLURONICS?或聚乙二醇(PEG))。活性成分也可包入通過(例如)凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊中，例子分別是羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，或包入膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或包入乳池液(macroemulsion)中。此類技術(shù)可參見《雷明頓藥物科學(xué)》第16版，Osol,A.編(1980)。用于體內(nèi)給予的制劑必須是無菌的。這可通過無菌濾膜過濾容易地實現(xiàn)。
[0064]在另一個實施方式中，就疾病預(yù)防或治療而言，本發(fā)明的一種或多種抗體的合適劑量將取決于待治療的疾病類型、所述疾病的嚴重性和療程、所述抗體是否以預(yù)防或治療目的給予、先前治療、患者的臨床史和對所述抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)師的判斷力。所述抗體適合于以一次或經(jīng)一系列治療給予所述患者。
[0065]根據(jù)疾病的類型和嚴重性，給予患者的抗體或其片段的初始候選劑量是約I μ g/kg~15mg/kg,例如,通過一次或多次分開給予或通過連續(xù)輸注來給予。就經(jīng)數(shù)天或更長時間的重復(fù)給予而言，根據(jù)所述病癥，使所述治療持續(xù)直至疾病癥狀得到所需的抑制。然而，也可采用其他劑量方案?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)和方法來容易地監(jiān)測該治療進展。所述抗體組合物應(yīng)以遵循良好醫(yī)學(xué)實踐的方式來制備、配劑和給予。本發(fā)明的抗體/衍生物可通過任何合適的途徑給予。這包括(但不限于)腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)或皮膚給予。就該范圍考慮的因素包括治療的具體病癥、治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、所述病癥的起因、試劑的遞送位點、給予方法、給予安排，以及醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的其它因素。待給予的抗體的“治療有效量”將由此類考慮來決定，并且是所需的最小量，以預(yù)防、改善或治療疾病或病癥。所述抗體不需要，但可任選地與一種或多種當(dāng)前使用的試劑一同配制以預(yù)防或治療所針對的病癥。此類其它試劑的有效量取決于所述制劑中抗體的量、病癥或治療類型，以及上述其它因素。
[0066]在本發(fā)明中，抗體指
[0067]a)單克隆、多克隆或嵌合的，或人源化的，或去免疫的，或親和性成熟的抗體，或完全人抗體或scFv ；
[0068]b)其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，以及包含此類抗原結(jié)合片段的分子，包括工程改造的抗體片段、抗體衍生物、雙特異性抗體和其它多特異性分子。
[0069]本文 的術(shù)語“抗體”以其最廣泛含義使用，并且涵蓋不同抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，和抗體片段(前提是它們顯示所需的抗原結(jié)合活性)。
[0070]“抗體片段”指除完整抗體以外的分子，所述分子包含完整抗體的部分，該部分結(jié)合與所述完整抗體結(jié)合的抗原。
[0071]抗體片段的示例包括但不限于，F(xiàn)v、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0072]術(shù)語“嵌合”抗體指其中重鏈和/或輕鏈部分來源于特定來源或物種，而剩余的重鏈和/或輕鏈來源于不同的來源或物種的抗體。
[0073]本文術(shù)語"Fe區(qū)〃優(yōu)選用于定義抗體的C末端區(qū)域，優(yōu)選是免疫球蛋白，更優(yōu)選是人IgG，含有至少恒定區(qū)的部分的重鏈，更優(yōu)選用于定義人IgG鉸鏈和恒定區(qū)(hFc)或小鼠IgG鉸鏈和恒定區(qū)(mFc)。該術(shù)語也包括來自其它免疫球蛋白類型和/或物種的，形成二聚體或寡聚體的類似序列。所述術(shù)語還包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。
[0074]術(shù)語〃宿主細胞〃、〃宿主細胞系〃和〃宿主細胞培養(yǎng)物〃可互換使用，并且指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的子代。宿主細胞包括〃轉(zhuǎn)化株〃和〃轉(zhuǎn)化細胞"，其包括最初轉(zhuǎn)化的細胞及其衍生的子代，不計傳代次數(shù)。子代的核酸含量可不與親本細胞完全相同，并可包含突變。本文包括功能或生物活性與在初始轉(zhuǎn)化細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的突變子代。
[0075]“人抗體”是具有的氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細胞產(chǎn)生的抗體，或具有的氨基酸序列來源于非人來源但使用人抗體庫的抗體，或具有其它編碼人抗體的序列的抗體。人抗體的這一定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0076]“人源化的”抗體指含有來自非人類HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方式中，人源化的抗體將基本包含至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中，全部或基本全部的HVR(例如，CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些，并且全部或基本全部的FR對應(yīng)于人抗體的那些。人源化的抗體可任選地包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少部分。抗體的“人源化形式”，例如，非人抗體，指已經(jīng)過人源化的抗體。
[0077]“去免疫化的”抗體是基于HLA結(jié)合(T細胞刺激的基本要求)被破壞的免疫原性降低的抗體。
[0078]本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本均一抗體群的抗體，即，除可能的變體抗體(例如少量存在的包含天然發(fā)生的突變或在單克隆抗體制備生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的變體)以外，所述群包含的單獨抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位。不同于通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑，單克隆抗體制劑中的各單克隆抗體均針對抗原的單一決定簇。因此，定語"單克隆"表明的抗體特征在于獲自基本均一的抗體群，而不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生所述抗體。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過不同技術(shù)制備，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體的此類方法和其它示例性方法。
[0079]與參照多肽序列相關(guān)的"氨基酸序列相同性百分率(%)"被定義為，在對齊所述序列并引入缺口(如有需要)以達到最大序列相同性百分率之后，候選序列中與參照多肽序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率，并且認為任何保守性取代都不作為所述序列相同性的部分。以測定氨基酸序列相同性百分率為目的的對齊可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的不同方式實現(xiàn)，例如，使用公共渠道可獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定合適的參數(shù)供于對齊序列，包括使比較的序列實現(xiàn)全長最大對齊所需的任何算法。
[0080]術(shù)語〃藥物制劑〃指此類形式的制劑:所述制劑允許其中所含活性成分的生物學(xué)活性有效，并且不含具有待給予該制劑的對象不可接受的毒性的額外成分。
[0081]本文中所用的“治療”(及其語法變化形式)指企圖改變受治療的個體的自然病程，并且可供預(yù)防或在臨床病理學(xué)的病程中進行的臨床介入。所需的治療效果包括但不限于，預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理學(xué)結(jié)果、防止轉(zhuǎn)移、減緩疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態(tài)，和減輕或改善預(yù)后。在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病發(fā)展或減緩疾病進展。
[0082]本發(fā)明的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段可以與分子偶聯(lián)，所述分子優(yōu)選是治療劑。
[0083]通過參考下圖的非限制性實施例來描述本發(fā)明。
[0084]圖1:分別描述三種uPAR變體:uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc (作為對照)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的卡通圖。(A)描述uPAR-hFc (含有人Fe標(biāo)簽的uPAR的可溶性二聚體形式)的結(jié)構(gòu)的卡通圖。uPAR-hFc (序列I，對應(yīng)于SEQ ID NO: 14)由人uPAR(序列4的全部序列，對應(yīng)于SEQ ID NO:1)的殘基1-277(序列1A，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277、結(jié)構(gòu)域D1、D2和D3)、接頭區(qū)(序列1B，對應(yīng)于SEQ ID NO:9)和人IgG重鏈(序列1C，對應(yīng)于SEQID NO:5)的鉸鏈和恒定區(qū)(Fe)組成。hFc-標(biāo)簽的存在導(dǎo)致同源二聚體形成，其中兩個多肽通過二硫鍵連接在一起。
[0085](B)描述uPAR-mFc (含有小鼠Fe標(biāo)簽的uPAR的可溶性二聚體形式)的結(jié)構(gòu)的卡通圖。uPAR-mFc (序列2，對應(yīng)于SEQ ID NO: 15)由人uPAR(序列1A，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)的殘基1-277、接頭區(qū)(序列2A，對應(yīng)于SEQ ID NO: 10)和鼠IgG重鏈(序列2B，對應(yīng)于SEQ ID NO: 6)的鉸鏈和恒定區(qū)(Fe)組成。就uPAR-hFc而言，所述mFc-標(biāo)簽的存在導(dǎo)致同源二聚體形成，其中兩個多肽通過二硫鍵連接在一起。(C)描述uPARmyc (含有C末端myc-標(biāo)簽的uPAR的可溶單體形式)的結(jié)構(gòu)的卡通圖。uPARmyc (序列3,對應(yīng)于SEQ ID NO: 26)由人uPAR(序列3A，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)的殘基1-274和C末端myc-標(biāo)簽(序列3B，對應(yīng)于SEQ ID NO: 27)組成。如圖所示，成熟野生型uPAR由三種同源結(jié)構(gòu)域(稱作D1、D2和D3)組成。
[0086]圖2:使用免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的uPAR的強制二聚化增加VN結(jié)合親和性，但不增加uPA的結(jié)合親和性。(A)uPAR-hFc與經(jīng)固定VN的結(jié)合。使采用VN被覆的96孔板在有過量前uPA(黑色)或無過量前uPA(灰色)存在下用遞增濃度的uPAR-hFc在室溫下孵育2小時。清洗后，通過采用單克隆uPAR抗體(13F6)和Eu3+標(biāo)記的抗山羊小鼠抗體依次孵育來檢測結(jié)合的受體。通過檢測時間分辨熒光強度來檢測所述結(jié)合的物質(zhì)。通過減去在采用相同樣品孵育的未被覆的孔中檢測到的非特異性結(jié)合來計算特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)以代表性實驗的平均值土SD顯示。通過非線性回歸(四參數(shù)擬合)，采用Prism5.0軟件包來計算結(jié)合曲線、平衡解離常數(shù)(Kd，以納摩爾單位計)和最大結(jié)合能力(Bmax，以CPS單位計(計數(shù)/秒))。注意到與圖B所示的單體uPARmyc相比，uPAR-hFc具有約10倍更高的親和性和約3倍更高的結(jié)合能力。(B) uPARmyc和經(jīng)固定VN的結(jié)合。使采用VN被覆的96孔板在有過量前uPA (黑色)或無過量前uPA (灰色)存在下用遞增濃度的uPARmyc在室溫下孵育2小時。完全按 照圖A所述檢測并分析uPARmyc的結(jié)合。(C)uPAR-hFc和uPARmyc與經(jīng)固定的前uPA的結(jié)合。使采用前uPA被覆的96孔板用遞增濃度的uPAR-hFc (圓形)和uPARmyc (方形)在室溫下孵育2小時。完全按照圖A所述檢測并分析uPARmyc的結(jié)合。注意到uPAR-hFc和uPARmyc與經(jīng)固定的前uPA的結(jié)合的Kd和非常相似。
[0087]圖3:由uPA的生長因子樣結(jié)構(gòu)域和uPAR通過其N末端結(jié)合的嵌合分子制成的uPAR變體，其增加VN結(jié)合并且減少uPA結(jié)合。(A)描述野生型人uPAR和uPAR變體GFD_uPAR嵌合體的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的卡通圖。成熟的野生型uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))由3個同源蛋白結(jié)構(gòu)域(Dl、D2和D3)組成，其通過位于uPAR的C末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)脂質(zhì)錨著子連接所述細胞膜的外葉。所述GFDuPAR-嵌合體(序列5，(SEQ ID NO: 16))與野生型uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))具有相同序列，但額外包含uPA的受體結(jié)合生長因子樣結(jié)構(gòu)域GFD (序列5A，(SEQ ID NO: 3))，該結(jié)構(gòu)域利用短接頭序列(序列5B, (SEQ ID NO: 7))被工程改造到uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))的N末端上。(B) 293細胞中的GFDuPAR表達促進細胞對玻連蛋白的粘附。使表達野生型uPAR (uPAR)、VN結(jié)合缺陷型uPAR突變體(UPARW32A和 UPARR91A，(Madsen 等，2007))、GFDuPAR 嵌合體(GFDuPAR)或無 uPAR (模擬)的 293 細胞于37°C在采用整聯(lián)蛋白結(jié)合缺陷型VN片段(VN(1-66)RAD，(Madsen等，2007))被覆的孔中粘附I小時。清洗后，將粘附的細胞固定，用結(jié)晶紫染色，然后通過在530nm檢測吸光度來定量。通過減去非特異性結(jié)合(在未被覆孔中檢測)來計算特異性細胞粘附，并以粘附聚-L-賴氨酸的百分率(%)表示。數(shù)據(jù)以獨立實驗(n=3)的平均值土SD表示。注意到uPAR和GFDuPAR都促進細胞對VN的穩(wěn)健粘附，但W32A和R91A突變受體，以及模擬轉(zhuǎn)染細胞都未能粘附。(C)GFDuPAR-嵌合體未能促進細胞對經(jīng)固定的前uPA的粘附。使表達不同uPAR變體的293細胞與采用前uPA被覆的孔在37°C下結(jié)合I小時，并如圖B所述定量細胞粘附。注意到uPAR、uPARW32A和UPARR91A的表達誘導(dǎo)細胞對前uPA的牢固粘附，而GFDuPAR嵌合體并非如此，因此證明該嵌合體無法結(jié)合前uPA。圖4:可溶性的GFDuPAR顯示對VN的uPA非依賴性高親和性和減少的uPA結(jié)合。(A)描述GFDuPARmyc的結(jié)構(gòu)域組織的卡通圖。GFDuPARmyc (序列6 (SEQ ID NO: 28))是含有C末端myc標(biāo)簽的GFDuPAR的分泌的變體(圖3A)。GFDuPARmyc-嵌合體(序列6 (SEQ ID NO:28))由uPA的受體結(jié)合生長因子樣結(jié)構(gòu)域，GFD (序列 5A(SEQ ID NO: 3))、短接頭(序列 5B (SEQ ID NO: 7))、uPAR殘基 1-274 (序列 3A，對應(yīng)SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)和C末端myc標(biāo)簽(序列3B (SEQ ID NO: 27))組成。(B) GFDuPARmyc和uPARmyc對固定的VN的結(jié)合。使采用VN被覆的96孔板用遞增濃度的GFDuPARmyc (黑色方形)和uPARmyc (灰色圓形)在室溫下孵育2小時。清洗后，通過采用單克隆uPAR抗體(13F6)和Eu3+標(biāo)記的抗山羊小鼠抗體依次孵育來檢測結(jié)合的受體。通過檢測時間分辨熒光強度來檢測所述結(jié)合的物質(zhì)。通過減去在采用相同樣品孵育的未被覆的孔中檢測到的非特異性結(jié)合來計算特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)以代表性實驗的平均值土SD顯示。通過非線性回歸(四參數(shù)擬合)，使用Prism5.0軟件包來計算結(jié)合曲線和解離常數(shù)(Kd)。注意到，GFDuPARmyc但非uPARmyc以高親和性結(jié)合VN。(C)GFDuPARmyc和uPARmyc對經(jīng)固定的前uPA的結(jié)合。使采用前uPA被覆的96孔板用遞增濃度的GFDuPARmyc (黑色方形)和uPARmyc (灰色圓形)在室溫下孵育2小時，并如圖B所述檢測結(jié)合的受體。通過上述非線性回歸計算結(jié)合曲線、Kd和注意到與uPARmyc相比，GFDuPARmyc結(jié)合uPA的親和性降低約30倍，結(jié)合能力減少約5倍。
[0088]圖5:其它u PAR變體:uPAR的強制二聚化和在其N末端上添加GFD結(jié)構(gòu)域協(xié)同增加所述受體的VN結(jié)合活性。
[0089](A)描述GFDuPAR-hFc的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的卡通圖。GFDuPAR-hFc (序列7 (SEQ IDNO: 12))結(jié)合了通過如圖1A所示添加C末端人Fe標(biāo)簽的強制二聚化和如圖3A所示的在N末端上附加的GFD結(jié)構(gòu)域。(B)描述GFDuPAR-mFc結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的卡通圖。GFDuPAR-mFc (序列8(SEQ ID NO: 13))與GFDuPAR-hFc相同，不同之處在于，所示Fe區(qū)源自小鼠免疫球蛋白(參見圖1B)。(C) GFDuPAR-mFc以極度高親和性結(jié)合經(jīng)固定的VN。使采用VN被覆的96孔板用遞增濃度的GFDuPAR-mFc在室溫下孵育2小時。清洗后，通過用小鼠IgG恒定區(qū)特異性的生物素化的抗體和Eu3+標(biāo)記的鏈霉親和素依次孵育來檢測結(jié)合的受體。結(jié)合的物質(zhì)通過檢測時間分辨的熒光來定量。通過減去在采用相同樣品孵育的未被覆的孔中檢測到的非特異性結(jié)合來計算特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)以代表性實驗的平均值土SD顯示。通過非線性回歸來計算結(jié)合曲線和Kd。
[0090]圖6:不同形式的可溶性uPAR的VN結(jié)合活性的直接比較(A)GFDuPAR-hFc以高親和性結(jié)合經(jīng)固定的VN。使采用VN被覆的96孔板在無前uPA存在下或用遞增濃度的GFDuPAR-hFc孵育，或在有或無過量前uPA存在下用uPAR-hFc和uPARmyc孵育。清洗后，通過采用單克隆uPAR抗體(13F6)和Eu3+標(biāo)記的抗山羊小鼠抗體依次孵育來檢測結(jié)合的受體。數(shù)據(jù)來自單一實驗，并且以平均值土SD顯示。通過非線性回歸來計算結(jié)合曲線和Kd。注意到GFDuPAR-hFc以比所測其它任何uPAR形式高的親和性和能力結(jié)合W。(B)GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc對經(jīng)固定的VN結(jié)合的比較。使采用VN被覆的96孔板在無前uPA存在下用遞增濃度的GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc在室溫下孵育2小時。清洗后，通過采用單克隆uPAR抗體(13F6)和Eu3+標(biāo)記的抗山羊小鼠抗體依次孵育來檢測結(jié)合的受體。數(shù)據(jù)來自單一實驗，并且以平均值土SD顯示。通過非線性回歸來計算結(jié)合曲線和Kd。注意到二聚體GFDuPAR-hFc以比單體GFDuPARmyc更高的親和性(約4倍)和能力(約2.5倍)結(jié)合VN。圖7:對連接uPAR-hFc中的GFD和uPAR結(jié)構(gòu)域的接頭區(qū)缺乏特殊要求(A)測試的接頭區(qū)。為了比較GFDuPAR-hFc (參見圖5A)中的GFD和uPAR結(jié)構(gòu)域之間的不同接頭長度的可能的影響，用指示的接頭序列(長度為5、8、16或20個殘基)制得GFDuPAR-hFc變體。接頭8與全部上述實驗中所用的序列5B(SEQ ID NO:7)和序列9B(SEQ ID NO:8)相同。(B)與經(jīng)固定VN的結(jié)合。使采用VN被覆的孔在有或無IOnM前uPA存在下用來自用指示的uPAR變體瞬時轉(zhuǎn)染的293細胞的條件培養(yǎng)基(稀釋10倍)孵育。清洗后，通過用Eu3+標(biāo)記的抗人Fe抗體孵育并檢測時間分辨的熒光來檢測結(jié)合的物質(zhì)。注意到,不依賴接頭長度，全部GFDuPAR-hFc變體都不依賴前uPA而結(jié)合VN。(C)對經(jīng)固定uPA的結(jié)合。使采用前uPA被覆的孔用來自用指示的uPAR變體瞬時轉(zhuǎn)染的293細胞的條件培養(yǎng)基(稀釋10倍)孵育。清洗后，如圖B所述檢測結(jié)合的物質(zhì)。注意到，不依賴于接頭長度，全部GFDuPAR-hFc變體顯示相較于uPAR-hFc減少的uPA結(jié)合。圖8:描述在uPAR上附加GFD能增加VN結(jié)合并減少uPA結(jié)合的兩種可能機制的卡通圖。(A)分子內(nèi)結(jié)合。若空間上允許，則GFDuPAR中的GFD結(jié)構(gòu)域會結(jié)合uPAR中的uPA結(jié)合口袋，導(dǎo)致所述嵌合受體的自動飽和。uPAR的自動飽和可誘導(dǎo)所述受體內(nèi)的構(gòu)象變化，導(dǎo)致VN結(jié)合位點的有效暴露，并防止與uPA結(jié)合。(B)分子間結(jié)合。如果圖A所示的自動飽和就空間原因沒有可能，那么GFDuPAR將是雜二價的，并因而顯示uPA和uPAR結(jié)合活性。在該情況下，GFDuPAR可能形成寡聚體，該寡聚體具有減少的uPA結(jié)合活性和和增加的VN結(jié)合活性。圖9:8個抗體可變區(qū)的氨基酸序列。從通過如材料與方法中所述的PCR擴增獲得的cDNA序列推出重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。按照Kabat系統(tǒng)對所 述氨基酸序列編號。互補決定區(qū)化0幻1、2和3(從左到右)有下劃線。連字符表不引入所述序列以保持對齊的缺口。對應(yīng)序列表中的Xaa的標(biāo)點符號表不所述序列是未知的或不確定的。因此，Xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸。
[0091 ] 圖10:針對GFDuPAR-hFc產(chǎn)生的單克隆抗體識別細胞表面uPAR。表達人uPAR (huPAR)、小鼠uPAR (muPAR)或不表達uPAR (模擬)的293細胞用針對GFDuPAR-hFc產(chǎn)生的單克隆抗體8B12、10H6、13D11、19.10、13F6、AL6、AL38和BE18染色。使用熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體檢測結(jié)合的抗體，并通過流式細胞術(shù)來分析所述染色。直方圖顯示染色亮度(X軸，F(xiàn)L1-H)和頻率(Y軸，以最高頻亮度的％計)。注意到全部八種抗體都對表達人uPAR的細胞特異性染色。先前已對抗體BR4和AK17有所描述，并且與小鼠uPAR特異性反應(yīng)(Tjwa 等，2009)。
[0092]圖11:mAb8B12的功能抑制活性。將表達人uPAR的293細胞接種于用玻連蛋白(A和B)或纖連蛋白(C)被覆的96孔E平板中，然后轉(zhuǎn)移至實時細胞分析儀儀器(RTCA，xCELLigence, SP羅氏公司(SP Roche Corp.))。以規(guī)律間隔記錄電阻抗(稱為細胞指數(shù)，Cl)。大約2小時后，向細胞添加前uPA (B和C)或載劑(A)并繼續(xù)檢測細胞指數(shù)。大約另一個小時之后，以圖中指示的終濃度向孔添加稀釋曲線的8B12抗體，并繼續(xù)檢測細胞指數(shù)。圖中通過垂直點線指示了添加前uPA和8B12的時間。所述曲線顯示標(biāo)準(zhǔn)化的細胞指數(shù)(NCI，Y軸)與時間(X軸)的關(guān)系。基于抗體添加之前直接檢測的細胞指數(shù)對全部細胞指數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。為檢測IC50值(圖D)，在抗體添加后一小時檢測NCI (以相同時間點的未處理細胞的NCI的百分比(%) (ANCI，Y軸)計算)并對與抗體濃度(X軸)的關(guān)系作圖。
[0093]圖12:通過流式細胞術(shù)的表位作圖(I)。表達人uPAR (uPAR WT)、UPARR83/89A的293細胞用指示的不同抗體染色，并通過流式細胞術(shù)分析所述結(jié)合。在有或無前uPA的存在下進行uPAR WT細胞染色，以檢測配體占用度對抗體結(jié)合的可能影響。如同陰性對照(Neg.Ct.)，全部圖中的uPAR WT細胞的染色譜都顯示細胞沒有接納一抗。圖13:通過流式細胞術(shù)的表位作圖(II)。如圖12所述，但分析不同的uPAR變體。
[0094]圖14:通過流式細胞術(shù)的表位作圖(III)。如圖12和13所述，但分析不同的uPAR變體。
[0095]圖15:uPAR中的抑制性抗體的結(jié)合表位的位置。uPAR由三個結(jié)構(gòu)域(D1、D2和D3)組成，其中Dl通過短接頭區(qū)連接D2。該接頭區(qū)包含對與VN相互作用的受體而言至關(guān)重要的殘基(R91 和 Y92，有下劃線)(Madsen 等，2007) (Gardsvoll 和 Ploug, 2007)。該實施例中生成的抑制性抗體的結(jié)合位點與具有結(jié)合熱點重要性的R89、R91和Y92有重疊的表位。uPAR的D2D3截短形式的結(jié)構(gòu)示于下文。該變體缺乏SEQ ID NO:1的uPAR的殘基1_82。
[0096]圖16:抑制 Eu3+-uPA 通過 mAb8B12、13F6、R3 和前 uPA 與 293/uPAR 細胞結(jié)合。mAb8B12不干擾uPAR的蛋白水解功能。為了研究所述抑制性抗體8B12是否是uPAR/VN相互作用的特異性抑制劑，或其是否也干擾uPA與所述受體結(jié)合，我們進行了體外結(jié)合試驗。注意到，mAb8B12顯示沒有或幾乎沒有抑制活性，說明了該抗體不干擾所述受體的蛋白水解功能。該試驗的有效性通過R3抗體和未標(biāo)記的前uPA顯示有效競爭活性來說明。(CPS-計數(shù)/秒)。
[0097]圖17:mAb8B12抑制體內(nèi)PC3腫瘤生長。雄性Balb C nu/nu小鼠通過皮下(s.c.)途徑接種(IxlO6) PC-3細胞。通過腹膜內(nèi)途徑兩周注射一次10.0mg/kg的mAb8B12、mAbl3F6、非免疫對照小鼠IgG(mlgG)或PBS來處理動物。一周測量兩次腫瘤，如材料與方法中所述測定腫瘤體積。在PBS和mlgG處理的動物之間沒有觀察到腫瘤生長差異，并且匯集這些數(shù)據(jù)然后進行統(tǒng)計學(xué)分析。對照動物和8B12處理動物之間的顯著性差異用星號表示(NS,非顯著性，Ρ>0.05，*Ρ〈.05，**Ρ〈.01和_Ρ〈.001)。指示對照和8Β12處理動物之間的腫瘤體積差異(以％計)。
[0098]圖18:mAb8B12減少PC-3腫瘤細胞增殖并促進體內(nèi)凋亡。雄性Balb C nu/nu小鼠用PC-3細胞皮下接種，并每兩周一次地用10.0mg/kg的mAb8B12、mAbl3F6或非免疫對照小鼠IgG通過腹膜內(nèi)途徑注射處理。異種移植后8周，收集腫瘤并如材料與方法部分所述通過免疫組化進行分析(圖A)。示出K1-67和活化的胱冬酶3染色并且用Dapi對細胞核進行復(fù)染。圖B中顯示對數(shù)據(jù)的定量。注意到，相較于采用對照IgG的處理，采用抑制性mAb8B12的處理顯著減少腫瘤細胞增殖并增加凋亡。相同同種型的非抑制性mAbl3F6沒有顯示該活性，說明抗增殖和促凋亡作用的原因是mAb8B12的抑制活性。Y軸的單位是每個視野下的陽性細胞數(shù)。
[0099]圖19.mGFDmuPAR-Fc的結(jié)構(gòu)域組成和VN結(jié)合特性
[0100](A)描述—muPAR-hFc的結(jié)構(gòu)域組織的卡通圖。"^muPAR-hFc (序列9 (SEQ IDNO: 17))由鼠uPA的受體結(jié)合生長因子樣結(jié)構(gòu)域mGFD(序列9A(SEQ ID N0:4))、短接頭(序列9B(SEQ ID NO:8))、小鼠uPAR殘基1-273(序列9C，對應(yīng)于SEQ ID NO: 2的氨基酸1-273)、另一個短接頭(序列9D (SEQ ID NO: 11))和C末端人Fe標(biāo)簽(hFc，序列IC (SEQ IDNO: 5))組成。同樣地，可以使用小鼠Fe標(biāo)簽的C末端。
[0101]⑶mGFDmuPAR-hFc與經(jīng)固定VN的結(jié)合。使采用VN被覆的96孔板用遞增濃度的mGFDmuPAR-hFc在室溫下孵育2小時。清洗后，通過用Eu3+標(biāo)記的山羊抗人Fe抗體孵育來檢測結(jié)合的受體。通過檢測時間分辨熒光強度來檢測所述結(jié)合的物質(zhì)。通過減去在采用相同樣品孵育的未被覆的孔中檢測到的非特異性結(jié)合來計算特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)以代表性實驗的平均值土SD顯示。通過非線性回歸(四參數(shù)擬合)，使用Prism5.0軟件包來計算解離常數(shù)(Kd)。
[0102]圖20.針對—muPAR-hFc產(chǎn)生的抗體通過小鼠uPAR介導(dǎo)抑制細胞對VN的粘附。293/muPAR細胞對VN粘附的抑制通過來自骨髓瘤雜交的細胞培養(yǎng)上清液來達到，所述骨髓瘤雜交產(chǎn)生識別mGFDmuPAR-hFc的抗體。將表達鼠uPAR的293細胞接種在VN被覆的E平板中，然后使用xCELLigence酶標(biāo)儀(羅氏公司(Roche))通過阻抗測量來檢測細胞粘附。當(dāng)粘附到達平臺(通過垂直點線表示)時，向所述孔添加來自13種不同骨髓瘤雜交的條件培養(yǎng)基(終濃度30%v/v)，所述骨髓瘤雜交源自用m(:FDmuPAR-hFC免疫的小鼠的脾細胞。注意到，來自4種雜交的條件培養(yǎng)基導(dǎo)致細胞粘附的大幅(0MD4、NE43和00F12)或中等減少(NM23)(以標(biāo)準(zhǔn)化的細胞指數(shù)檢測)，而來自剩余9種雜交的條件培養(yǎng)基顯示幾乎沒有或沒有抑制活性。
[0103]圖21.抑制性抗體0MD4和NE43結(jié)合至小鼠uPAR中的VN結(jié)合位點。為了檢測生成抗體的結(jié)合表位是否落在小鼠uPAR (muPAR)的VN結(jié)合位點中，對用于免疫的抗原(meFDmuPAR-hFc)和在muPAR的VN結(jié)合位點包含單個氨基酸取代的該嵌合體的變體(mGFDmuPAR-hFc R92A)以及人可溶性受體(suPAR)進行體外結(jié)合試驗以確定所述抗體是否也識別人uPAR。使采用—DmuPAR-hFC^muPAR-hFc R92A或人可溶性uPAR (suPAR)被覆的96孔ELISA平板用在稀釋緩沖液中以1:100稀釋的雜交瘤細胞上清液封閉并孵育。清洗后，通過用Eu3+標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體孵育來探測結(jié)合的抗體，并通過增強的時間分辨熒光輕度檢測(Delfia)來定量。通過減去未經(jīng)被覆孔觀察到的結(jié)合來計算特異性結(jié)合。注意到，0MD4和NE43不識別"^muPAR-hFc R92A變體，說明這些抗體結(jié)合muPAR中的VN結(jié)合位點。這些抗體之一(0MD4)還識別人受體。
[0104]圖22.針對meFDmuPAR-Fc重鏈可變區(qū)產(chǎn)生的mAb 0MD4的氨基酸序列。從通過如實施例2材料與方法中所述的PCR擴增獲得的cDNA序列推出0MD4重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。根據(jù)Kabat系統(tǒng)對所述氨基酸序列編號?；パa決定區(qū)化0幻1、2和3(從左到右)有下劃線。
[0105]圖23.mAb 0MD4、NE43、00F12、NM23、8B12的抑制活性的物種特異性。將表達人uPAR (圖A)和小鼠uPAR(圖B)的293細胞接種在用VN被覆的E平板上，并通過阻抗檢測來監(jiān)測細胞粘附。一旦細胞粘附達到平臺(垂直點線)，向孔添加純化的孔體至IOOnM*的終濃度，并記錄細胞粘附變化結(jié)果。注意到，表達人uPAR的細胞的粘附受mAb8B12抑制，且部分受mAb 0MD4抑制，而其余的抗體沒有顯著影響。相反，表達鼠uPAR的細胞的粘附受mAb NE43、00F12、匪23抑制，部分受0MD4抑制，但完全不受8B12抑制。使用13F6作為結(jié)合人uPAR的非抑制性陰性對照抗體。*所述0MD4抗體是IgA同種型，并且以1:5稀釋的細胞培養(yǎng)物上清液形式使用。該抗體在所述上清液中的濃度未知并且可能較低。因此，采用該抗體觀察到的部分影響可能歸因于此。
[0106]圖24:供于分離scFv識別配體占用二聚體uPAR的淘選策略。
[0107]圖25:分離的scFv和細胞表面uPAR的反應(yīng)性。表達人uPAR的293細胞用指示的SCFv(200nM)染色。使用熒光素標(biāo)記的山羊抗人F(ab) 2抗體檢測結(jié)合的抗體，并通過流式細胞術(shù)分析染色。直方圖顯示染色亮度(X軸，F(xiàn)L1-H)和頻率(Y軸，以計數(shù)計)。
[0108]圖26:scFv3B6的抑制活性。如圖11中針對mAb8B12所述來檢測scFv3B6的抑制活性。所述曲線顯示標(biāo)準(zhǔn)化的細胞指數(shù)(NCI，Y軸)與時間(X軸)的關(guān)系?；诳贵w添加之前直接檢測的細胞指數(shù)對全部細胞指數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。為檢測IC50值(圖D)，在抗體添加后一小時檢測NCI (以相同時間點的未處理細胞的NCI的百分比(%) (ANCI, Y軸)計算)并對與抗體濃度(X軸)的關(guān)系作圖。
[0109]圖27:scFv3C10的抑制活性。完全按照圖26中針對scFv3B6所述來檢測3C10的抑制活性。
[0110]圖28:將8B12和其它已知化合物抑制uPAR/VN相互作用或uPAR功能的抑制活性做比較。如圖11中針對8B12抗體所述檢測SMB結(jié)構(gòu)域(圖A)、肽P7 (圖B)、抗體R3和R5(圖C)以及R2抗體(圖D)的抑制活性。為檢測IC50值，在化合物添加后一小時檢測NCI (以相同時間點的 未處理細胞的NCI的百分比(%) (ΛΝ(:Ι，Υ軸)計算)并對與化合物濃度(X軸)的關(guān)系作圖。圖11的8Β12的抑制曲線已經(jīng)包括在全部四個圖中以供比較。所測化合物各自的經(jīng)計算的IC50和最大抑制常數(shù)示于表2。
[0111]實施例1
[0112]材料與方法
[0113]表達載體的構(gòu)建
[0114]用于帶有人IgG恒定區(qū)(hFc)標(biāo)簽的重組蛋白的表達載體基于pFRT/TO-Fc質(zhì)粒(Madsen等，2007)，然而，引入了許多修飾以便于不同編碼區(qū)的改組并促進蛋白質(zhì)產(chǎn)量。首先，通過定點突變利用寡核苷酸dXu/dXd破壞位于hFc編碼區(qū)的載體序列下游的XhoI限制性位點。第二，將通過對寡核苷酸PreF/PreR進行退火所制備的編碼PreScission蛋白酶的切割序列的接頭插入到位于信號肽/Fe連接處的XhoI位點。為了去除所述構(gòu)建體的Fe區(qū)中存在的內(nèi)含子(發(fā)現(xiàn)這樣做增加重組蛋白的產(chǎn)量(我們未經(jīng)公開的觀察結(jié)果))，將所述載體轉(zhuǎn)染進入CHO細胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，然后用寡核苷酸hVNukpn/FcNr擴增cDNA，并 KpnI/Notl 克隆進入 pcDNA5/FRT_T0 (英杰公司(Invitrogen corp.))和 pEGFP-Nl (克隆泰克公司(Clontech corp.)),以分別牛.成pFRT/TO-hFc和pNl-hFc。帶有小鼠IgG恒定區(qū)(mFc)標(biāo)簽的重組蛋白的表達載體如下生成:通過使用寡核苷酸mFcU/mFcD來PCR擴增小鼠 IgGlcDNA (克隆 IRAVp968B035D，獲自 imaGenes GmbH)，并 Xhol/Notl 克隆進入 pFRT/ΤΟ-hFc和pNl-hFc中，以分別牛成pFRT/TO-mFc和pNl-mFc。編碼帶有人Fe標(biāo)簽的可溶性uPAR (uPAR-hFc,序列 I (SEQ ID NO: 14))和帶有小鼠 Fe 標(biāo)簽的可溶性 uPAR (uPAR-mFc，違^ll 2 (SEQ ID N0:15))的構(gòu)建體如下制備:通過用寡核苷酸URskF/UpreR2D擴增全長uPARcDNA (Madsen 等，2007)，并 KpnI/XhoI 克隆進入 pFRT/TO-hFc 和 pFRT/TO-mFc 以分別生成pFRT/TO-uPAR-hFc 和 pFRT/TO-uPAR-mFc。編碼帶有 myc 標(biāo)簽的可溶性 uPAR (uPARmyc，序歹 1丨3(SEQ ID NO:26))的構(gòu)建體如下生成:通過用寡核苷酸URskF/URMYCR擴增uPAR cDNA，并KpnI/Notl克隆進入pcDNA5/FRT-T0以牛成dFRT/TO-uPARiwc。所述表達載體編碼uPA的生長閔子結(jié)構(gòu)域(GFD,序列5A(SEQ ID NO:3))和全長uPAR(序列4(SEQ ID NO:1))的嵌合體。gfdUPAR(序列5 (SEQ ID NO: 16))通過兩步PCR重疊擴增法生成。首先，用寡核苷酸ATFkpnF/GFDlr擴增uPA cDNA,并用寡核苷酸UL8f/F012394擴增uPARcDNA。第二，混合所述兩種PCR產(chǎn)物，使用寡核苷酸ATFkpnF/F012394共擴增，并KpnI/Notl克隆進入pcDNA5/FRT_T0以生成dFRT/TO-^uPAR。編碼帶有C末端iwc標(biāo)簽的可溶件csfdUPARdPARiwc,序列6 (SEQ IDNO: 28))的表達載體如下生成，通過采用寡核苷酸ATFkpnF/URMYCR擴增pFRT/TO_GFDuPAR，并將產(chǎn)物KpnI/Notl克隆進入pcDNA5/FRT-T0以生成PFRTZTO-smUPARmvc0編碼帶有C末端人Fe標(biāo)簽的可溶性二聚體gfdUPAR變體(GFDuPAR-hFc,序列7(SEQ ID NO: 12))和帶有小鼠Fe標(biāo)簽mFc標(biāo)簽的可溶性二聚體gfdUPAR變體(GFDuPAR-mFc，座Hg (SEQ ID NO: 13))的表達載體如下生成:通過采用寡核苷酸ATFkpnF/UpreR2D擴增pFRT/T0_GFDuPAR并將產(chǎn)物與 KpnI/XhoI 克隆進入 pFRT/TO-hFc 和 pFRT/TO-mFc 以分別生成 pFRT/TQ-^PAR-hFc 和pFRT/TO-—uPAR-mFc ο如上所述，用uL5f、uL12f、uL16f或uL20f替代寡核苷酸uL8f來制備編碼多種嵌合體的表達載體，所述多種嵌合體中的GFD和uPAR結(jié)構(gòu)域之間的接頭區(qū)的長度不同。將編碼eFDuPAR-hFc的區(qū)域及其含不同長度接頭的變體KpnI/Notl轉(zhuǎn)移到pEGFP-Nl表達載體(克隆泰克公司)，生成pNl-eFDuPAR-hFC供于瞬時表達實驗。
[0115]重組蛋白的表達和純化
[0116]將pFRT/TO-uPAR-hFc、pFRT/TO-GFDuPAR_hFc、pFRT/TO-uPAR-mFc, pFRT/T0-GFDuPAR-mFc,pFRT/TO-uPARmyc pFRT/TO-GFDuPARmyc 表達載體轉(zhuǎn)染進入 CHO Flp-1n 細胞(英杰公司)，而在無血清條件下表達的重組蛋白如先前所描述(Madsen等，2007)。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白A親和層析從所述條件培養(yǎng)基純化帶有人或小鼠Fe標(biāo)簽的重組體，并用PBS充分透析。將用pFRT/TO-uPARmyc和GFDuPARmyc轉(zhuǎn)染的細胞的條件培養(yǎng)基濃縮約20倍，無需進一步純化即用于結(jié)合試驗。使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA試驗來測定濃縮的條件培養(yǎng)基中的uPARmyc濃度。通過用pNl-eFDuPAR-hFC載體變體瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在OptiMEM無血清培養(yǎng)基(英杰公司)中的Phoenix細胞來使所述多種eFDuPAR-hFc變體(在GFD和uPAR部分之間具有不同長度的接頭)表達，并在培養(yǎng)6-8天后回收所述條件培養(yǎng)基。結(jié)合試驗
[0117]4°C下用在包被緩沖液(50mM碳酸鈉，pH9.6)中稀釋的前uPA或VN(IOnM)被覆黑色96孔免疫板。平板用清洗緩沖液(含有0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS-T))清洗，并用封閉緩沖液(含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS)在室溫下使非特異性結(jié)合位點飽和>2小時。用PBS-T清洗后，使孔在有或無指示前uPA存在下用在稀釋緩沖液(含1%BSA的PBS)中稀釋的指示濃度的uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc孵育。在室溫下允許所述結(jié)合發(fā)生2小時，之后通過用清洗緩沖液漂洗來去除未結(jié)合的試劑。通過用抗uPAR單克隆抗體(13F6，I μ g/ml)和Eu3+標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(1:5.000,珀金埃爾默公司(PerkinElmer Corp.))依次孵育來檢測結(jié)合的uPAR-hFc和uPARmyc。通過使用Envision Xcite酶標(biāo)儀(帕金埃爾默公司)，使用DELFIA標(biāo)記方案檢測時間分辨熒光強度來檢測Eu3+標(biāo)記。為了計算特異性結(jié)合，從被覆孔中檢測到的總結(jié)合減去在用相同樣品孵育的未被覆孔中檢測到的非特異性結(jié)合。
[0118]細胞系和細胞粘附試驗[0119]通過按照已公開的方法(Madsen等，2007)用pFRT/T0_GFDuPAR載體轉(zhuǎn)染來生成表達gfdUPAR的HEK293Flp-1n T-Rex細胞(293)。用空載體轉(zhuǎn)染的293細胞和表達uPARW32A與UPARe9ia的細胞在先前已經(jīng)描述(Madsen等，2007)。
[0120]寡核苷酸序列
【權(quán)利要求】
1.一種尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)變體分子，所述uPAR變體分子相對于野生型分子具有增加的VN結(jié)合活性。
2.如權(quán)利要求1所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述uPAR變體分子包含與以下部分連接的野生型uPAR氨基酸序列: a)連接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生長因子樣結(jié)構(gòu)域(GFD)，和/或 b)連接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗體分子的Fe區(qū)域的鏈，其中，若所述Fe區(qū)域的鏈存在，則所述uPAR變體分子是二聚體。
3.如權(quán)利要求2所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸32-92組成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸32-93組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
4.如權(quán)利要求2所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271組成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸3-270組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
5.如權(quán)利要求2所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277組成的序列，或者基本由SEQ ID NO:2的成熟muPAR的氨基酸1-273組成的序列，或者由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
6.如權(quán)利要求2所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO: 2組成的序列，或由來自uPAR直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的uPAR變體分子,其特征在于，uPA的所述GFD序列包含基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD的氨基酸11-42組成的序列，或者基本由SEQ IDNO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43組成的序列，或由來自GFD直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的uPAR變體分子,其特征在于，uPA的所述GFD序列基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD序列組成，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD序列組成，或基本由來自GFD直系同源基因的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽組成，或其功能突變體或衍生物或類似物。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述Fe區(qū)的鏈?zhǔn)侨嗽葱缘牟⑶野居蒘EQ ID NO:5組成的序列，或者所述Fe區(qū)的鏈?zhǔn)切∈笤葱缘牟⑶野居蒘EQ ID NO:6組成的序列，或者包含由來自Fe區(qū)直系同源基因的鏈的對應(yīng)區(qū)域編碼的多肽，或其功能突變體或衍生物或類似物。
10.如權(quán)利要求2-9中任一項所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述uPAR變體分子還包含: a)在所述uPA的GFD序列和所述野生型uPAR序列的N末端之間的第一接頭區(qū)域，和/或 b)在抗體分子的所述Fe區(qū)域的鏈和所述野生型uPAR序列的C末端之間的第二接頭區(qū)域。
11.如權(quán)利要求10所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述第一接頭區(qū)域基本由SEQID NO:7或SEQ ID NO:8的序列組成。
12.如權(quán)利要求10或11所述的uPAR變體分子，其特征在于，所述第二接頭區(qū)域基本由SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11 的序列組成。
13.如前述權(quán)利要求中任一項所述的uPAR變體分子,其特征在于,所述uPAR變體分子包含基本具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16或17的序列的序列。
14.前述權(quán)利要求中任一項所述的uPAR變體分子作為抗原用于獲得特異性抗體分子或者用于選擇所述抗體的重組體或合成的抗原結(jié)合片段的應(yīng)用，其中，所述特異性抗體分子具有uPAR功能拮抗劑活性。
15.一種能夠與權(quán)利要求1-13中任一項所述的尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)變體結(jié)合的抗體，或其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
16.如權(quán)利要求15所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段具有uPAR功能拮抗劑活性。
17.如權(quán)利要求15或16所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段能夠與uPAR分子的表位結(jié)合，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸殘基中的至少一種。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含至少一個重鏈互補決定區(qū)(CDRH3)氨基酸序列，所述CDRH3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID N0:18、19、20、21 或 25 的氨基酸 90-102、SEQ ID NO: 24 的氨基酸 90-101，和 SEQ IDNO:22 或 23， 和/或至少一個重鏈互補決定區(qū)(CDRH2)氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57， 和/或至少一個重鏈互補決定區(qū)(⑶RHl)氨基酸序列，所述⑶RHl氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸22-26和 SEQ ID NO:25 的氨基酸 17-26。
19.如權(quán)利要求15-18中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID NO:65、66、67、68 或 69 的氨基酸 80-87，和 SEQ ID NO: 74 或 85， 和/或至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸41-47， 和/或至少一個輕鏈互補決定區(qū)(CDRLl)氨基酸序列，所述CDRLl氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸15-23。
20.如權(quán)利要求15-19中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:18、19、20、21、24和.25 ;和/或輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、66、67、68 和 69。
21.如權(quán)利要求20所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:18、19、20、21和24 ;和輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與分別選自下組的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO:66、65、68、67 和 69。
22.用作藥物的如權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
23.用于癌癥治療的如權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
24.用于前列腺癌治療的如權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段。
25.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種如權(quán)利要求15-21中任一項所述的抗體、其重組體或合成的抗原結(jié)合片段和合適的稀釋劑和/或賦形劑。
【文檔編號】A61K38/49GK103930128SQ201280038620
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】N·西頓紐斯, S·甘地 申請人:意大利癌癥研究基金會分子腫瘤學(xué)研究所(Ifom)