專利名稱：源于人多能干細胞的胰腺細胞的包封的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥和細胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及源于人胚胎干細胞和其它人多能細胞的細胞的包封。
背景技術(shù)：
人胚胎干(hES)細胞和從成人分化的細胞誘導(dǎo)的多能干(iPS)細胞特別適合于細胞治療應(yīng)用，這是因為它們是多能的且可自我更新?；谠诜只嗄芨杉毎囵B(yǎng)物中能夠出現(xiàn)極為多樣的細胞類型，成功實現(xiàn)有效的、定向分化對于人多能干細胞的治療應(yīng)用是有用的。使用不同生長和信號傳導(dǎo)因子以及小分子對于使人多能干細胞有效的定向分化成各種中間細胞類型，包括胰腺細胞系是必要的。發(fā)明概述本文所述的實施方案涉及在哺乳動物中生成胰島素的方法，所述方法通過下述步驟進行向宿主哺乳動物中提供可植入的腔室(chamber)，向所述腔室提供源于人多能干細胞(例如hES或iPS細胞)的胰腺祖細胞，使所述胰腺祖細胞成熟成為成熟的胰腺激素分泌細胞，其中所述胰腺激素分泌細胞為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激生成胰島素的胰島素分泌細胞，從而在所述哺乳動物中體內(nèi)生成胰島素。在一些實施方案中，所述腔室在引入胰腺祖細胞之前植入到哺乳動物中。在其它實施方案中，在引入胰腺祖細胞之前使所述腔室血管化。 還在其它實施方案中，在植入之前將細胞引入所述腔室。一個實施方案涉及在哺乳動物中生成胰島素的方法，所述方法包括(a)向可植入的可半滲透裝置中提供人PDX-I陽性的胰腺祖細胞群；(b)使該細胞群在所述裝置中成熟為胰島，其中所述胰島包含內(nèi)分泌細胞和腺泡細胞，并且其中所述內(nèi)分泌細胞至少為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激生成胰島素的胰島素分泌細胞，從而體內(nèi)為所述哺乳動物生成胰島素。另一個實施方案涉及用于將細胞群植入到哺乳動物宿主中的細胞包封組件。一方面，該組件包含限定用于包封活細胞的至少一個腔室的密封外緣。另一方面，該組件包含具有外周邊緣的壁機構(gòu)，其中該組件包含在所述壁機構(gòu)的外周邊緣的第一密封件(seal)，從而形成該包封組件。在一些方面，該組件包含有效降低腔室容積的第二密封件。另一個實施方案涉及冷凍保存的人胰腺祖細胞群。在該實施方案的一個方面，所述細胞群適合移植到哺乳動物中。另一個實施方案涉及獲得適于移植的細胞群的方法。在該實施方案的一個方面， 通過包括下述步驟的方法獲得適于移植的細胞a)人胰腺祖細胞群接觸冷凍保存溶液，從而獲得用于冷凍保存的細胞群；b)降低用于冷凍保存的祖細胞的溫度至大約-196°C，以獲得冷凍保存的細胞；和C)提高所述冷凍保存的細胞的溫度，從而獲得適于移植的胰腺祖細胞群。在一些實施方案中，用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于0°C、-10°C、-20°C、-3 0°C ,-40 °C ,-50 °C ,-60 °C ,-70 °C ,-80 °C ,-90 °C ,-IOO0C ,-IlO0C、-120°C、-130°C ,-140 °C、-150°C、-160°C、-170°C、-180°C、-190°C、-200°C、-210°C、-220°C、-230°C、-240°C、-250°C或-260°C。附圖簡述

圖1為雙開口包封裝置的透視圖，該包封裝置具有內(nèi)部超聲焊接部分(weld)以分
隔主腔。圖2為圖1所示的包封裝置的頂截面視圖。圖3為圖1所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有沿著內(nèi)部超聲焊接區(qū)通過該裝置中心獲取的橫截面。圖4為圖1所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有沿著開口的軸并通過被分隔的腔的中心獲取的橫截面。圖5為圖1所示的包封裝置的端視圖，其具有通過被分隔的腔獲取的橫截面。圖6為包封裝置的透視圖，其沒有裝載口且包含定期超聲點焊部分以分隔內(nèi)腔。圖7為圖6所示的包封裝置的頂部橫截面視圖。圖8為圖6所示的包封裝置的側(cè)視圖，其具有通過被分隔的腔中心獲取的橫截面。圖9為圖6所示的包封裝置的端視圖，其具有通過被分隔的腔的橫截面。圖10為包封裝置的透視圖，其沒有裝載口且包含定期超聲點焊部分以分隔內(nèi)腔。 每個點焊部分都去除了中心以促進血管化。圖11為圖10所示的包封裝置的放大視圖。優(yōu)選實施方案的詳述本文所述的實施方案涉及通過在哺乳動物中植入處在包封裝置中的源于人胚胎干細胞的人胰腺祖細胞，從而體內(nèi)生成胰島素的方法，所述包封裝置包括生物可相容的基于聚乙二醇的裝置和機械/醫(yī)學(xué)裝置。除非另有說明，本文使用的術(shù)語為相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)用法所理解的。除了下文提供的術(shù)語定義以外，分子生物學(xué)中的常用術(shù)語的定義還可見于Rieger 等人，1991 Glossary of genetics !classical and molecular,5th Ed. , Berlin Springer-VerlagjPiC^Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等人， Eds. , Current Protocol, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc,and John Wiley & Sons，he.，(1998增刊)。應(yīng)該理解，在本說明書和權(quán)利要求書中使用的“a”或“an”可以表示一個或多個，取決于其使用的上下文。因此，例如，述及“細胞” 可以表示可以使用至少一個細胞。此外，出于本說明書和所附權(quán)利要求書的目的，除非另有說明，所有表示成分的數(shù)量的數(shù)字、材料的百分比或比例、反應(yīng)條件和在本說明書和權(quán)利要求書中使用的其它數(shù)值在所有情況下都將被理解為通過術(shù)語“約”修飾。相應(yīng)地，除非相反指出，在以下說明書和所附權(quán)利要求書中提出的數(shù)值參數(shù)為可以依據(jù)本發(fā)明想要獲得的期望性質(zhì)而改變的近似值。 每個數(shù)值參數(shù)都應(yīng)該至少根據(jù)報道的有效數(shù)字和通過應(yīng)用常規(guī)舍入技術(shù)來理解，絲毫不想將等同原則的應(yīng)用限制于權(quán)利要求書的范圍。在一個實施方案中，使用生物可相容的聚乙二醇(PEG)包封源于hES的細胞。基于PEG的包封更詳細地描述于題為“用于治療疾病的包封生物材料的植入”的美國專利 No. 7，427，415 ；題為“用于包封生物材料的凝膠”的美國專利No. 6，911，227 ；以及題為“用于包封生物材料的凝膠”的美國專利No. 6，911，227,5, 529，914,5, 801，033,6, 258，870中， 它們通過引用以其全文并入本文。在另一個實施方案中，包封裝置為TheraCyte裝置(Irvine，California)。 TheraCyte細胞包封裝置進一步描述于美國專利No. 6，773，458 ；6, 156，305 ；6, 060，640 ； 5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ；5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ； 5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ；5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ； 5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ；5，324，518 ；5，219，361 ；5，100，392 ；和 5，011，494中，上述所有專利通過全文引用以其全文并入本文。在一個實施方案中，描述了用于從多能干細胞培養(yǎng)物或源于hES的細胞培養(yǎng)物的單細胞懸液制備hES細胞團塊懸液的方法。所述多能干細胞培養(yǎng)物可以最初在成纖維細胞飼養(yǎng)層(feeder)上培養(yǎng)，或者它們可以不使用飼養(yǎng)層。分離hESC和在人飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)hESC的方法描述于題為“用于在人飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)人胚胎干細胞的方法”的美國專利No. 7，432，104中，其通過引用以其全文并入本文。用于制備hES細胞團塊懸液培養(yǎng)物和 /或源于hES的細胞團塊懸液培養(yǎng)物的多種方法詳細描述于2008年10月4日提交的題為 “干細胞團塊懸液組合物及其分化方法”的美國申請No. 12/264, 760中，其通過引用以其全文并入本文。本文所述的分化培養(yǎng)條件和源于hES的細胞類型基本上類似于上文的D'Amour等人2006年所述的，或描述于美國專利No. 7，534，608 ；2007年3月2日提交的美國專利申請No. 11/681,687 ；和2007年7月5日提交的美國專利申請No. 11/773,944中的那些，它們的公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。D'Amour等人描述了 5步分化方案階段1 (主要結(jié)果為定形內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段2 (主要使PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段3 (主要使 PDXl陽性的前腸內(nèi)胚層產(chǎn)生)，階段4(主要使胰腺內(nèi)胚層或胰腺內(nèi)分泌祖細胞產(chǎn)生)和階段5 (主要使表達激素的內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生)。本文所用的“定形內(nèi)胚層(DE) ”是指能夠分化成為腸管細胞或源于腸管的器官的多能內(nèi)胚層細胞系。根據(jù)某些實施方案，定形內(nèi)胚層細胞為哺乳動物細胞，且在優(yōu)選實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞為人細胞。在一些實施方案中，定形內(nèi)胚層細胞表達或未能顯著表達某些標(biāo)志物。在一些實施方案中，在定形內(nèi)胚層細胞中表達一種或多種選自CER、F0ZA2、 S0X17、CXCR4、MIXLl、GATA4、HNF3-3、GSC、FGFl7、VWF、CALCR、FOXQl、CMKORl 和 CRIPl 的標(biāo)志物。在其它實施方案中，選自O(shè)CT 4、α-胎蛋白(AFP)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、SPARC、S0X7 和HNF4-a中的一種或多種標(biāo)志物不在定形內(nèi)胚層細胞中顯著表達。為了清楚起見，將定形內(nèi)胚層細胞區(qū)別于其它內(nèi)胚層譜系的細胞，例如前腸內(nèi)胚層或腸內(nèi)胚層或PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細胞，這些細胞相比定形內(nèi)胚層都可識別地表達HNF4-a。定形內(nèi)胚層細胞群及其制備方法還描述于題為“定形內(nèi)胚層”的美國專利No. 7，510，876，其以其全文并入本文。其它實施方案還涉及名為“PDX1陰性的前腸內(nèi)胚層細胞”或“前腸內(nèi)胚層細胞”或 “腸內(nèi)胚層”或其等同物的細胞培養(yǎng)物。在一些實施方案中，前腸內(nèi)胚層細胞表達S0X17、 HNFl-β、HNF4-a和FOXAl標(biāo)志物，但不實質(zhì)上表達PDX1、AFP、S0X7、S0X1。PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細胞群及其制備方法還描述于2006年10月27日提交的題為“表達PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國申請No. 11/588，693，其通過引用以其全文并入本文。并且，與定形內(nèi)胚層細胞或階段1的細胞相比，腸內(nèi)胚層可識別地表達HNF4-a ；參見下文實施例。本文所述的其它實施方案涉及“PDX1陽性的偏向背部的前腸內(nèi)胚層細胞”、“PDX1 陽性的前腸內(nèi)胚層細胞”或“PDX1陽性的內(nèi)胚層”或其等同物的細胞培養(yǎng)物。在一些實施方案中，PDXl陽性的前腸內(nèi)胚層細胞表達PDX1、HNF6、S0X9和PROX 1標(biāo)志物，但不實質(zhì)上表達 NKX6. 1、PTF1A、CPA、cMYC、S0X17、HNF1B 或 HNF4alpa。PDXl 陽性的前腸內(nèi)胚層細胞群及其制備方法還描述于2006年10月27日提交的題為“表達PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國申請No. 11/588，693，其通過引用以其全文并入本文。本文所述的其它實施方案涉及“胰腺祖細胞”、“PDX1陽性的胰腺內(nèi)胚層細胞”、 "PDX1陽性的胰腺祖細胞”、“胰腺上皮”、“PE”或其等同物的細胞培養(yǎng)物。PDXl陽性的胰腺祖細胞是多能的，且可以在胰腺中產(chǎn)生多種細胞，包括但不限于腺泡細胞、導(dǎo)管細胞和內(nèi)分泌細胞。在一些實施方案中，與不會可識別地表達PDXl和NKX6. 1的非前胰腺內(nèi)胚層細胞相比，該PDXl陽性的胰腺祖細胞表達高水平的這些標(biāo)志物。PDXl陽性的胰腺祖細胞還表達低水平的 PTF1A、CPA、cMYC、NGN3、PAX4、ARX 禾Π ΝΚΧ2. 2、INS、GCG, GHRL, SST 禾Π PP,甚至不表達?？蛇x擇地，其它實施方案涉及“PDX1陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞”或其等同物的細胞培養(yǎng)物。在一些實施方案中，類似于PDXl陽性的胰腺祖細胞，PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞表達高水平的PDXl和ΝΚΧ6. 1，但是不同于PDXl陽性的胰腺祖細胞，PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞額外地表達高水平的PTF1A、CPA和cMYC。PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞還表達低水平的 NGN3、PAX4、ARX 和 NKX2. 2、INS、GCG、GHRL, SST 和 PP，甚至不表達。其它實施方案涉及“胰腺內(nèi)分泌前體細胞”、“胰腺內(nèi)分泌祖細胞”或其等同物的細胞培養(yǎng)物。胰腺內(nèi)分泌祖細胞是多能的，且產(chǎn)生成熟的內(nèi)分泌細胞，包括α、β、S和PP 細胞。在一些實施方案中，相比其它非內(nèi)分泌祖細胞類型，胰腺內(nèi)分泌祖細胞表達高水平的 NGN3、ΡΑΧ4、ARX和ΝΚΧ2. 2。胰腺祖細胞還表達低水平的INS、GCG、GHRL, SST和PP，甚至不表達。其它實施方案還涉及“胰腺內(nèi)分泌細胞”、“胰腺激素分泌細胞”、“胰腺胰島激素表達細胞”或其等同物的細胞培養(yǎng)物，所述等同物是指體外源于例如α、β、δ和/或PP細胞或其組合的多能細胞的細胞。該內(nèi)分泌細胞可以是多激素的或單激素的，例如表達胰島素、胰高血糖素、胃饑餓素、生長激素抑制素和胰腺多肽或其組合。因此，該內(nèi)分泌細胞可以表達一種或多種胰腺激素，其具有人胰島細胞的至少部分功能。胰島激素表達細胞可以是成熟的或不成熟的?；谀承?biāo)志物的差別表達，或者基于它們的功能，例如體外或體內(nèi)葡萄糖響應(yīng)，可以將不成熟的胰島激素表達細胞與成熟的胰島激素表達細胞相區(qū)分。胰腺內(nèi)分泌細胞還可以表達低水平的NGN3、PAX 4、ARX和NKX2. 2，甚至不表達。相比間質(zhì)的定形內(nèi)胚層細胞，上文細胞類型中的絕大多數(shù)為上皮化的。在一些實施方案中，胰腺內(nèi)胚層細胞表達選自表3的一種或多種標(biāo)志物和/或相關(guān)的下述美國申請的表4中的一種或多種標(biāo)志物2006年10月27日提交的題為“表達PDXl的背部和腹部前腸內(nèi)胚層”的美國申請11/588,693，以及2005年4月沈日提交的題為“表達PDXl的內(nèi)胚層”的美國申請No. 11/115，868，這些申請通過引用以其全文并入本文。在某些實施方案中，術(shù)語“富集的”、“分離的”、“分開的”、“分選的”、“純化的”或通過耗盡而純化或其等同方式是指這樣的細胞培養(yǎng)物或細胞群或細胞樣品其含有至少 15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的目的細胞系或具有某種細胞表型，例如表達該細胞表型的某細胞標(biāo)志物或不表達該細胞表型的某細胞標(biāo)志物基因特征的目標(biāo)細胞。用于純化、富集、分離、分開、分選和/或耗盡源于hES細胞的內(nèi)胚層譜系細胞的方法還描述于 2008年4月21日提交的題為“用于純化內(nèi)胚層和源于人胚胎干細胞的胰腺內(nèi)胚層細胞的方法”的美國申請NO. 12/107，020，其通過引用以其全文并入本文。本文使用的術(shù)語“接觸”(即，例如可分化細胞的細胞接觸化合物)意在包括將化合物和細胞一起體外孵育(例如將化合物添加到培養(yǎng)的細胞中)。術(shù)語“接觸”不意在包括細胞體外暴露于包含ErbB3配體和任選地可能天然存在于受試者中的TGF-β家族成員的限定的細胞培養(yǎng)基(即可能作為自然生理過程的結(jié)果而發(fā)生的暴露)。細胞和包含ErbB3 配體和任選的TGF-β家族成員的限定的細胞培養(yǎng)基接觸的步驟可以以任何適合的方式進行。例如，可以在貼壁培養(yǎng)中或在懸浮培養(yǎng)中處理細胞。應(yīng)該理解，與限定的培養(yǎng)基接觸的細胞可以進一步用細胞分化環(huán)境處理，以穩(wěn)定細胞或分化細胞。本文使用的術(shù)語“分化”是指比其來源的細胞類型更為分化的細胞類型的產(chǎn)生。在一些實施方案中，術(shù)語“分化”表示產(chǎn)生比其來源的細胞具有更少命運選擇的細胞。因此該術(shù)語包括部分和終末分化的細胞類型。源于hES細胞的分化細胞通常被稱為源于hES的細胞或源于hES的細胞團塊培養(yǎng)物，或源于hES的單細胞懸液，或源于hES的細胞貼壁培養(yǎng)物等。本文使用的術(shù)語“可分化的細胞”用于描述可以分化成至少部分成熟的細胞，或者可以參與細胞分化，例如與可以分化成至少部分成熟的細胞的其它細胞融合的細胞或細胞群。本文使用的“部分成熟的細胞”、“祖細胞”、“不成熟細胞”、“前體細胞”、“多能細胞”或其等同物包括不是終末分化的那些細胞，例如定形內(nèi)胚層細胞、PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細胞、PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層細胞，PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層細胞進一步包括PDXl陽性的前胰腺內(nèi)胚層細胞和PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞。所有細胞都是表現(xiàn)出來自相同器官或組織的成熟細胞的至少一個表型特征，例如形態(tài)或蛋白表達，但是可以進一步分化成至少一種其它細胞類型。例如，正常的成熟肝細胞典型地表達例如白蛋白、纖維蛋白原、 α-1-抗胰蛋白酶、凝血素凝集因子(prothrombin clotting factor)、轉(zhuǎn)鐵蛋白和解毒酶 (detoxification enzyme)，如細胞色素P-450等及其它的蛋白。因此，本文使用的“部分成熟的肝細胞”可以表達白蛋白或另外的一種或多種蛋白，或者開始具有正常的成熟肝細胞的外觀或功能。本文使用的術(shù)語“基本上”是指大的限度或程度，例如，上下文中的“基本上類似的”可以用于描述一種方法以大范圍或程度類似于另一種方法。然而，本文使用的術(shù)語“基本上不含”，例如，“基本上不含”或“基本上不含污染物”，或“基本上不含血清”或“基本上不含胰島素或胰島素樣生長因子”或其等同物表示，溶液、培養(yǎng)基、補充物、賦形劑等為至少98%或至少98. 5%、或至少99%、或至少99. 5%、或至少100 %不含血清、污染物或其等同物。在一個實施方案中，限定的培養(yǎng)基不含血清，或為100%不含血清，或基本上不含血清。相反地，本文使用的術(shù)語“基本上類似的”或其等同方式表示，組合物、過程、方法、溶液、 培養(yǎng)基、補充物、賦形劑等為至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%類似于在本文說明書中之前描述的、或在以其全文并入本文的之前描述的過程或方法中的過程、方法、溶液等。并且，本文與細胞群的組合物一起使用的術(shù)語“實質(zhì)上”或“基本上”表示占主導(dǎo)地位地或主要地。在一些實施方案中，這些術(shù)語表示細胞群中的至少85%的細胞、細胞群中的至少86%的細胞、細胞群中的至少87%的細胞、細胞群中的至少88%的細胞、細胞群中的至少89%的細胞、細胞群中的至少90%的細胞、細胞群中的至少91%的細胞、細胞群中的至少92%的細胞、細胞群中的至少93%的細胞、細胞群中的至少94%的細胞、細胞群中的至少95%的細胞、細胞群中的至少96%的細胞、細胞群中的至少97%的細胞、細胞群中的至少98%的細胞、或細胞群中的至少99%的細胞。在其它實施方案中，術(shù)語或短語 “實質(zhì)上不含”或“基本上不含”是指在任何細胞培養(yǎng)物中存在最低量或少量的組分或細胞，例如本文所述的胰腺祖細胞為“實質(zhì)上或基本上同質(zhì)的”、“實質(zhì)上或基本上同-細胞的 (homo-cellular) ”、“實質(zhì)上hES細胞”、“實質(zhì)上或基本上定形內(nèi)胚層細胞”、“實質(zhì)上或基本上前腸內(nèi)胚層細胞”、“實質(zhì)上或基本上腸內(nèi)胚層細胞”、“實質(zhì)上或基本上PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層細胞”、“實質(zhì)上或基本上PDXl陽性的前胰腺內(nèi)胚層細胞”、“實質(zhì)上或基本上PDXl 陽性的前胰腺祖細胞”、“實質(zhì)上或基本上胰腺上皮細胞”、“實質(zhì)上或基本上PDXl陽性的胰腺內(nèi)胚層端細胞”、“實質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)胚層前體細胞”、“實質(zhì)上或基本上胰腺內(nèi)分泌細胞”等。術(shù)語“實質(zhì)上”和“基本上”還可以表示至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%該細胞(定形內(nèi)胚層；PDXl陰性的前腸內(nèi)胚層；PDXl陽性的前胰腺內(nèi)胚層；PDXl陽性的胰腺祖細胞；PDXl陽性的胰腺端細胞；內(nèi)分泌前體細胞，和內(nèi)分泌激素分泌細胞)。本文使用的術(shù)語化合物的“有效量”或其等同物是指該化合物的濃度在存在所限定的培養(yǎng)基的剩余組分下足以實現(xiàn)培養(yǎng)物中的可分化細胞在缺乏培養(yǎng)層細胞和在缺乏血清或血清替代物時穩(wěn)定超過一個月。該濃度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。本文使用的術(shù)語“表達”是指細胞中多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或多肽的翻譯，使得分子在表達該分子的細胞中的可測量水平比它們在不表達該分子的細胞中的更高。測量分子表達的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，且包括但不限于，RNA印跡、RT-PCR、原位雜交、蛋白質(zhì)印跡和免疫染色。當(dāng)述及細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或細胞群時，本文使用的術(shù)語“分離的”是指基本上與該細胞的天然來源分開的，從而該細胞、細胞系、細胞培養(yǎng)物或細胞群能夠在體外培養(yǎng)。此外，術(shù)語“分離”用于指從兩種或更多種細胞的組中物理選擇一種或多種細胞，其中基于細胞形態(tài)和/或各種標(biāo)志物的表達選擇細胞。本文使用的術(shù)語“保存細胞”表示在移植前以可存活的狀態(tài)維持細胞一段時間。 該時間段可以是1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、2天、4天、5天、 1周、2周、4周、1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、1年、2年、4年、6年、8年、10 年、12年、14年、16年、18年、20年、22年、M年、30年、35年、40年、45年或100年或在該范圍內(nèi)提供的任意時間之間的任何時間段。本文使用的可分化細胞可以是多能的(pluripotent)、多能的(multipotent)、寡能的(oligopotent)或甚至單能的。在某些實施方案中，可分化細胞是多能的可分化細胞。 在更具體的實施方案中，該多能的可分化細胞選自胚胎干細胞、ICM/上胚層細胞、原初外胚層細胞、原始生殖細胞和畸胎癌細胞。在一些實施方案中，可分化細胞源于植入前胚胎。在一個具體實施方案中，可分化細胞是哺乳動物胚胎干細胞。在一個更具體的實施方案中，可分化細胞是人胚胎干細胞。從可分化細胞分化的細胞類型在多個研究和開發(fā)領(lǐng)域具有幾種用途，所述領(lǐng)域包括但不限于藥物發(fā)現(xiàn)、藥物開發(fā)和試驗、毒理學(xué)、用于治療目的以及基礎(chǔ)科學(xué)研究的細胞制備。這些細胞類型表達在廣泛研究領(lǐng)域中感興趣的分子。這些包括已知的如標(biāo)準參考教科書描述的各種細胞類型的功能所需的分子。這些分子包括但不限于細胞因子、生長因子、細胞因子受體、胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、分泌的多肽和其它分子以及生長因子受體。本發(fā)明考慮到可分化細胞可以通過與細胞分化環(huán)境接觸而被分化。本文使用的術(shù)語“細胞分化環(huán)境”是指這樣的細胞培養(yǎng)條件其中誘導(dǎo)可分化細胞分化，或者誘導(dǎo)可分化細胞成為富集了分化的細胞的人細胞培養(yǎng)物。優(yōu)選地，通過生長因子誘導(dǎo)的分化的細胞系在性質(zhì)上將是同質(zhì)的。術(shù)語“同質(zhì)的，，是指含有超過約50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、86 %、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的目的細胞系的群體?？梢岳眉毎只囵B(yǎng)基或環(huán)境來部分地、終末地或可逆地分化本文所述的可分化細胞。根據(jù)本文所述的實施方案，細胞分化環(huán)境的培養(yǎng)基可以含有多種組分，包括例如， KODMEM培養(yǎng)基(Knockout Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基)、DMEM、Ham氏F12培養(yǎng)基、 FBS (胎牛血清)、TOR2 (成纖維細胞生長因子2)、KSR或hLIF (人白血病抑制因子)。細胞分化環(huán)境還可以含有補充物，例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/鏈霉素)、N2、B27和β-巰基乙醇(β-ME)。本發(fā)明考慮到可以向細胞分化環(huán)境中添加額外的因子，包括但不限于纖連蛋白、層粘連蛋白、肝素、硫酸肝素、視黃酸、表皮生長因子家族(EGF) 的成員、成纖維細胞生長因子家族(FGF)的成員(包括TOF2、FGF7、reF8和/或FGF10)、血小板源性生長因子家族(PDGF)的成員、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)/骨形成蛋白(BMP)/生長和分化因子(DGF)家族拮抗劑，包括但不限于頭蛋白(noggin)、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、 cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高劑量活化素和amnionless或其變體或功能片段。 還可以以TGF/BMP/⑶P受體-Fc嵌合體的形式添加TGF/BMP/⑶P拮抗劑?？梢蕴砑拥钠渌蜃影梢约せ罨蛞种仆ㄟ^Notch受體家族傳遞信號的分子，包括但不限于δ -樣和 Jagged家族的蛋白以及Notch加工或切割的抑制劑，或其變體或功能片段。其它生長因子可以包括胰島素樣生長因子家族(IGF)成員、胰島素、無翅相關(guān)(WNT)因子家族和hedgehog 因子家族或其變體或功能片段?？梢蕴砑悠渌蜃觼泶龠M中內(nèi)胚層干/祖細胞、內(nèi)胚層干 /祖細胞、中胚層干/祖細胞、或定形內(nèi)胚層干/祖細胞增殖和存活以及這些祖細胞衍生物的存活和分化?？梢酝ㄟ^對目的細胞系的標(biāo)志物基因特征的表達以及可分化細胞類型的標(biāo)志物基因特征的表達的缺乏定量，來監(jiān)測可分化細胞向目的細胞系的發(fā)展，或其維持在未分化狀態(tài)。定量此類標(biāo)志物基因的基因表達的一種方法是使用定量PCR(Q-PCR)。本領(lǐng)域熟知進行Q-PCR的方法。本領(lǐng)域已知的其它方法也可用于定量標(biāo)志物基因表達。可以通過使用針對該目標(biāo)標(biāo)志物基因的特異性抗體來檢測標(biāo)志物基因表達。本文所述的實施方案還考慮到來自動物中的任何來源的可分化細胞，條件是該細胞是本文所限定的可分化的。例如，可以從胚胎或其中的任何初生胚層、從胎盤或絨毛膜組織、或從例如成人干細胞的更為成熟的組織，包括但不限于脂肪、骨髓、神經(jīng)組織、乳腺組織、肝組織、胰腺、上皮組織、呼吸組織、性腺組織和肌肉組織收獲可分化細胞。在特定實施方案中，可分化細胞是胚胎干細胞。在其它特定實施方案中，可分化細胞是成人干細胞。還在其它特定實施方案中，可分化細胞是源于胎盤或絨毛膜的干細胞。其它實施方案考慮到使用來自能夠產(chǎn)生可分化細胞的任何動物的可分化細胞。從其收獲可分化細胞的動物可以是脊椎動物或無脊椎動物，哺乳動物或非哺乳動物，人或非人。動物來源的實例包括但不限于靈長類動物、嚙齒類動物、狗、貓、馬、牛和豬?！嵤┓桨缚紤]到使用誘導(dǎo)的多能干(iPS)細胞，其為源于非多能細胞的多能干細胞。參見 Zhou 等人 Q009)，Cell Stem Cell 4 :381-384 ;Yu 等人，(2009) Science 324(5928) :729-801, Epub March 26,2009 ；Yu 等人，(2007) Science 318(5858) :1917-20, Epub November 20,2007 ；Takahashi 等人，(2007) Cell，131 :861-72 ；以及Takahashi K.和 Yamanaka S. Q006)，CellU6 :663_76，這些文獻通過引用以其全文并入本文。從其收獲非多能細胞的動物可以是脊椎動物或無脊椎動物，哺乳動物或非哺乳動物，人或非人。動物來源的實例包括但不限于靈長類動物、嚙齒類動物、狗、貓、馬、牛和豬?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法生成本文所述的可分化細胞。例如，可以使用去分化和核轉(zhuǎn)移方法制備人多能細胞。此外，本文使用的人ICM/上胚層細胞或原初外胚層細胞在體內(nèi)或體外生成。原初外胚層細胞可以在貼壁培養(yǎng)中產(chǎn)生，或作為細胞團塊在懸浮培養(yǎng)中產(chǎn)生，如在W099/53021所述的。此外，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法傳代人多能細胞，該方法包括人工傳代方法，和批量傳代方法，例如酶促或非酶促的傳代。在某些實施方案中，當(dāng)利用ES細胞時，胚胎干細胞具有正常的核型，而在其它實施方案中，胚胎干細胞具有異常的核型。在一個實施方案中，胚胎干細胞中的多數(shù)具有正常的核型。本發(fā)明考慮超過50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或超過95% 的被考察的中期細胞表現(xiàn)出正常的核型。儲存用于包封和移植的細胞一些實施方案涉及用于冷凍保存已經(jīng)體外培養(yǎng)和/或分化的細胞的方法。該儲存將實現(xiàn)保存、質(zhì)量控制和其它期望的操作和管理，或與體外分析有關(guān)，或與體內(nèi)植入有關(guān)。用于移植前細胞儲存的方法包括通過冷凍細胞(冷凍保存)；或者通過在高于冷凍溫度時冷藏細胞(冬眠)保存組織。參見Chanaud等人，1987 Neurosci Lett 82:127-133; Collier 等人，(1987) 436 :363-366 ；以及 Sauer 等人，1991 Neurology and Neuroscience 2 :123-1；35 ;Gage等人，1985 Neurosci Lett 60 133-137，這些文獻的公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。盡管已報道冬眠相比冷凍保存的組織提高移植物存活率和功能，但是在冬眠期間，細胞可能在這樣的條件下無法長期維持而不損害細胞活力。本文使用的“細胞懸液”或其等同物是指與培養(yǎng)基接觸的細胞團塊和/或簇和/或球。這樣的細胞懸液詳細描述于2008年11月8日提交的題為“干細胞團塊懸液組合物及其分化方法”的美國申請12/264，760中，其公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。本文使用的“適合的細胞懸液”或細胞懸液培養(yǎng)物或其等同物包括已在冷凍以上， 優(yōu)選在4°C下在冬眠培養(yǎng)基中儲存約1小時和長達約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或長達 30 天的細胞懸液。
本文使用的適于移植的細胞是指對于體內(nèi)治療代謝障礙來說活力和/或功能充足的細胞或細胞群。例如，在將適于移植的細胞植入到患有糖尿病的受試者中之后的一段時間，糖尿病或其一種或多種癥狀可以得到改善或減輕。在一個優(yōu)選實施方案中，適于移植的細胞或細胞群為胰腺祖細胞或群，或PDXl陽性的胰腺祖細胞或群，或內(nèi)分泌前體細胞或群，或多激素或單激素內(nèi)分泌細胞和/或細胞或細胞群的任意組合，或甚至是其純化的或富集的細胞或細胞群。適于本文所述的實施方案的細胞進一步詳細描述于美國專利 7，534，608，其公開內(nèi)容通過引用以其全文并入本文。本文使用的術(shù)語“儲存”或其等同方式是指在冷凍以上或以下保持或維持細胞。該術(shù)語還表示包括在用于受試者移植之前維持細胞。本文使用的術(shù)語“冷凍保存”或其等同方式是指在冷凍以下的溫度保存細胞。本文使用的術(shù)語“冬眠”或其等同方式是指在冷凍以上和相比正常生理溫度足夠低的溫度下保存細胞，使得一種或多種正常細胞生理過程減少或停止。在一個實施方案中， 優(yōu)選的冬眠溫度范圍為0至4°C，優(yōu)選約4°C。本文使用的冬眠培養(yǎng)基包括缺少冷凍保存劑且對于在冷凍溫度以上，優(yōu)選約4°C下儲存細胞是生理上相容的任何培養(yǎng)基。冬眠條件冬眠溫度范圍通常為0至5°C，優(yōu)選約4°C。不同類型的培養(yǎng)基可以用作冬眠培養(yǎng)基與現(xiàn)有方法相結(jié)合。用于冷凍和冬眠細胞的現(xiàn)有技術(shù)方法利用包含緩沖劑和添加的蛋白質(zhì)的復(fù)合培養(yǎng)基，有時候包括完全不限定的組分，例如血清。然而，為了使毒性和免疫原性最小化，這樣的添加物對于移植到人體中是不期望的。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培養(yǎng)基不含添加的Ca++。在某些實施方案中，用于冬眠細胞的培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或不含緩沖劑。優(yōu)選的冬眠培養(yǎng)基包括最小量的葡萄糖或適量的葡萄糖的鹽水溶液，例如在鹽水中沒有額外的葡萄糖或約0. 1% -0.9%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括約0. 1-0. 5%葡萄糖，或者由其組成。在更優(yōu)選的實施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括約 0.2%葡萄糖，或者由其組成。在優(yōu)選實施方案中，冬眠培養(yǎng)基包括非常小百分比(體積/ 體積)的NaCl，例如約0. 1-1% NaCl，優(yōu)選約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在某些實施方案中，可以使用更復(fù)雜的培養(yǎng)基，例如Hank氏平衡鹽溶液、Dulbecco氏最低必需培養(yǎng)基或fegle氏改良的最低必需培養(yǎng)基。在某些實施方案中，用添加物補充所選擇的冬眠培養(yǎng)基是需要的，該添加物例如添加的蛋白質(zhì)(例如，哺乳動物血清蛋白或全血清(優(yōu)選熱滅活的))、緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑，HEPES等)、抗氧化劑、生長因子、KCl (例如約30mM)、 乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2_3mM)、山梨醇(例如約300mM)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。在某些實施方案中，在約0_5°C、優(yōu)選約4°C下冬眠細胞。在某些實施方案中，在冷凍或使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞。在其它實施方案中，在冷凍之后在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞。還在其它實施方案中，不經(jīng)冷凍在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C 下維持細胞。在某些實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在約4°C下在冬眠培養(yǎng)基中維持細胞至少約1小時和長達約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25或長達30天。在其它實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞至少約12-72小時。在某些實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在用于移植之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞至少約24小時。在更優(yōu)選的實施方案中，在冷凍之前、冷凍之后或在使用之前，在冬眠培養(yǎng)基中在約4°C下維持細胞至少約36-48小時。冷凍保存條件在一些實施方案中，使用冷凍保存溶液冷凍保存細胞。冷凍保存溶液或培養(yǎng)基包括含有冷凍保存劑的溶液，該冷凍保存劑即隨著細胞冷凍或解凍保護細胞免受胞內(nèi)和/或細胞膜傷害的化合物。通過下述方法鑒別冷凍保存劑當(dāng)和在無冷凍保存劑存在時進行類似地冷凍或解凍的細胞相比時，與冷凍保存劑接觸的細胞的存活和/或功能性提高。任何冷凍保存劑可以和現(xiàn)有方法一起使用，該術(shù)語意味著包括胞內(nèi)和胞外的冷凍保存劑。本領(lǐng)域已知的任何冷凍保存劑可以用于冷凍保存溶液中。在某些實施方案中，冷凍保存溶液包括胞內(nèi)冷凍保存劑，包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)、各種二醇和三醇(例如乙二醇、丙二醇、丁二醇和三醇以及甘油)以及各種酰胺(例如甲酰胺和乙酰胺)；并且，也可以單獨使用或者與任何胞內(nèi)冷凍保存劑組合使用的胞外冷凍保存劑，包括但不限于磷酸甘油酯的磷酸單酯和磷酸二酯代謝物、聚乙烯吡咯烷酮或甲基纖維素(例如至少 0. )。在優(yōu)選實施方案中，DMSO用作冷凍保存劑。可以以大范圍的濃度使用DMS0，例如約 1%、2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、 約13%、約14%、約15%或更大。在更優(yōu)選實施方案中，DMSO的濃度范圍為約6%至約 12%。在特別優(yōu)選的實施方案中，DMSO的濃度為約10%。在某些實施方案中，冷凍保存劑以逐步方式添加到細胞中，從而梯度提高該冷凍保存劑的濃度直到達到冷凍保存劑的期望終濃度。在某些實施方案中，使細胞與冷凍保存溶液接觸，該冷凍保存溶液含有期望終濃度的冷凍保存劑，或者直接將冷凍保存劑添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而無需濃度梯度上升。冷凍保存溶液包括在適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的冷凍保存劑。任何類型的培養(yǎng)基都可以用于此目的。在優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含有添加的Ca++。在某些實施方案中，添加冷凍保存劑的培養(yǎng)基不含有添加的蛋白質(zhì)和/或不含有緩沖劑。在其它實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 1-0. 5% 葡萄糖或者由其組成，或不包括葡萄糖或包括少量葡萄糖。在該實施方案的一些方面，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM或DMEM/F12)包括約0. 5-0.9% NaCl，或者由其組成。在優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括非常少的葡萄糖，甚至至沒有以及約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在另一個優(yōu)選實施方案中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括約0. 1-0. 2%葡萄糖，或者由其組成。在該實施方案的一些方面中，添加冷凍保存劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括約0. 5-0. 9% NaCl，或者由其組成。在某些實施方案中，冷凍保存溶液還可以含有添加的蛋白質(zhì)，例如血清(例如胎牛血清或人血清)，或者血清蛋白(例如白蛋白或敲除的血清替代物)。在其它實施方案中， 冷凍保存劑還可以含有其它添加物，例如上述用于包含在冬眠培養(yǎng)基中的，例如抗氧化劑、 生長因子、KCl (例如約30mM)、乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2_3mM)、山梨醇(例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。一旦細胞懸浮在冷凍保存溶液中時，以受控方式降低細胞的溫度。在冷卻細胞到低于冷凍溫度時，優(yōu)選緩慢進行溫度的降低，使得細胞在冷凍保存劑的胞內(nèi)和胞外濃度之間建立平衡，從而抑制胞內(nèi)冰晶形成。在一些實施方案中，優(yōu)選冷凍速度足夠快，從而保護細胞免于過多損失水分和冷凍保存劑的毒性作用。然后可以在_20°C至約_250°C的溫度下冷凍保存細胞。優(yōu)選地，在低于_90°C下儲存細胞，從而將冰再結(jié)晶的風(fēng)險最小化。在特別優(yōu)選的實施方案中，在約-196°C的液氮中冷凍保存細胞?；蛘?，可以在商業(yè)可得的電子控制冷凍設(shè)備的幫助下實現(xiàn)受控冷凍。解凍條件冷凍保存后，可通過任何可用的方法解凍細胞。在優(yōu)選實施方案中，迅速解凍細胞，例如通過快速浸沒在37°C的液體中。一旦細胞解凍，通過添加稀釋培養(yǎng)基實現(xiàn)冷凍保存劑的稀釋。任何培養(yǎng)基都可以用于稀釋與解凍的細胞接觸的冷凍保存溶液。例如，用于冬眠細胞的或者用于細胞生長和分化的上文列出的任何培養(yǎng)基，都可以用于稀釋冷凍保存溶液。其它培養(yǎng)基也是合適的，例如Hank氏平衡鹽溶液(優(yōu)選不含Ca++)、含DMEM且不含葡萄糖或含最少量至少量葡萄糖的培養(yǎng)基。例如上文列出的用于包含于冬眠或冷凍培養(yǎng)基中的添加物也可以用于稀釋培養(yǎng)基中。示例性的添加物包括，例如，緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖劑、HEPES等)、抗氧化劑、生長因子、KCl (例如約30mM)、乳酸鹽(例如約20mM)、丙酮酸鹽、MgCl2 (例如約2-3mM)、山梨醇(例如至約300mM的摩爾滲透壓濃度)或本領(lǐng)域熟知的其它添加物。其它適合的添加物包括DNA酶(例如可從Genentech，hcorporated以 PULM0ZYME0R商購的)。用于稀釋冷凍保存溶液的培養(yǎng)基可以任選地含有添加的蛋白質(zhì)，例如添加的蛋白質(zhì)(例如哺乳動物血清(優(yōu)選熱滅活的))或血清蛋白，例如白蛋白。在其它實施方案中，培養(yǎng)基不含添加的蛋白質(zhì)和/或添加的緩沖劑。稀釋冷凍保存劑后，然后可以使細胞沉降，或者可以在離心力下形成細胞團，以盡可能多地從細胞中去除冷凍保存溶液。然后在不含有冷凍保存劑的培養(yǎng)基中洗滌細胞。在加入洗滌培養(yǎng)基之后和使細胞沉降或在離心力下形成團之前，對細胞來說保持在室溫是優(yōu)選的。在優(yōu)選實施方案中，在第二次離心前，細胞在室溫下保持約10、15、20、30分鐘。本領(lǐng)域已知的任何培養(yǎng)基都可以用于洗滌細胞，例如可以使用上文列出的任何冬眠或稀釋培養(yǎng)基。解凍和洗滌后，在37°C下培養(yǎng)細胞不同的時間，從而在移植之前使其復(fù)蘇?？梢栽谌魏闻囵B(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，優(yōu)選在適合它們的分化階段的培養(yǎng)基中。在此時間內(nèi)，一些細胞可能會死亡。為了用于移植，應(yīng)該將細胞懸浮在適于施用給受試者的最終培養(yǎng)基中。細胞移植基本上類似于美國專利號7，534，608所述，其通過引用以其全文并入本文。此外，在用于移植之前，可以如上所述在0至37°C、優(yōu)選約4°C下將解凍的細胞維持在冬眠培養(yǎng)基中長達1小時和長達約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25或長達30天，而不會有活力的明顯損失。在一些實施方案中，細胞活力沒有發(fā)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的損失。測定復(fù)蘇的細胞的活力儲存后，測定移植前細胞的活力和/或功能以確定它們用于，例如移植的適用性是需要的。這可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法實現(xiàn)。例如，可以使用活體染料使細胞染色， 該活體染料例如臺盼藍或溴化乙錠或吖啶橙。在有些實施方案中，適于移植的細胞群為至少約50-100%是存活的。在優(yōu)選實施方案中，適于移植的細胞群為至少約50%、為至少約 55 %、為至少約60 %、為至少約65 %、為至少約70 %、為至少約75 %、為至少約80 %、為至少約85%、為至少約90%、為至少約95%、為至少約96%、為至少約97%、為至少約98%、為至少約99%是存活的。在特別優(yōu)選的實施方案中，這樣的細胞群為至少約85%是存活的。在其它實施方案中，可以測定細胞的形態(tài)特征作為用于移植的細胞適合性的度量。在優(yōu)選實施方案中，已使用現(xiàn)有方法儲存的且適于移植的細胞的形態(tài)和新鮮細胞沒有區(qū)別(例如，統(tǒng)計學(xué)上顯著的)。在優(yōu)選實施方案中，已使用現(xiàn)有方法儲存的且適于移植的細胞的體內(nèi)形態(tài)和新鮮細胞沒有區(qū)別(例如，統(tǒng)計學(xué)上顯著的)。在細胞簇的情況下，可以在細胞冷凍/解凍和復(fù)蘇之前和之后對細胞量進行定量。在一個實施方案中，可以控制懸液中培養(yǎng)的細胞簇以壓緊。然后可以對該簇占據(jù)的區(qū)域拍照并測量。通過比較冷凍/解凍和復(fù)蘇之前和之后細胞占據(jù)的區(qū)域，可以測定復(fù)蘇百分比的值。也可測定已儲存的細胞的某些hES和/或胰腺祖細胞或激素分泌細胞標(biāo)志物的存在，以確定它們是否適合用于移植。該方法詳細描述于上文2008年的Kroon等人的上述描述，或者美國專利No. 7，534，608中，這些文獻通過引用以其全文并入本文。此外，或者可選擇地，可以測試細胞的功能，例如如上文2008年的Kroon等人或者在美國專利No. 7，534，608中所討論的，這些文獻通過引用以其全文并入本文。包封裝置本文所述的一個實施方案涉及包封裝置。該裝置可以植入到哺乳動物中以治療多種疾病和障礙。在優(yōu)選實施方案中，該裝置包含生物相容的免疫分離的裝置，其能夠完全將治療生物活性劑和/或細胞包封在其中。例如，此類裝置可以在半滲透膜內(nèi)容納治療有效量的細胞，該半滲透膜具有的孔徑使得對細胞存活和功能重要的氧和其它分子能夠通過該半滲透膜移動，而免疫系統(tǒng)的細胞無法滲透或穿過該孔。類似地，此類裝置可以含有治療有效量的生物活性劑，例如血管生成因子、生長因子、激素等。可以采用本文所述的裝置來治療需要向生物體連續(xù)供給生物活性物質(zhì)的病理。例如，此類裝置還可以被稱為生物人工器官，其含有生物活性劑和/或細胞的同質(zhì)或異質(zhì)混合物，或者產(chǎn)生一種或多種目標(biāo)生物活性物質(zhì)的細胞。理想地，生物活性劑和/或細胞被完全包封或包裹在至少一個內(nèi)部空間內(nèi)，或者為包封腔室，其被至少一個或多個半滲透膜界定。這樣的半滲透膜應(yīng)該容許包封的目標(biāo)生物活性物質(zhì)(例如胰島素、胰高血糖素、胰腺多肽等)通過，使活性物質(zhì)可到達裝置外的靶細胞和患者體內(nèi)。在優(yōu)選實施方案中，半滲透膜容許天然存在于受試者中的營養(yǎng)物通過該膜，從而將必需的營養(yǎng)物提供給包封的細胞。同時，這樣的半滲透膜抑制或防止患者細胞，更具體地為免疫系統(tǒng)細胞通過和進入該裝置并傷害裝置中的包封的細胞。例如，在糖尿病的情況下，該方法能夠使葡萄糖和氧刺激胰島素生成細胞來實時釋放身體所需的胰島素，同時防止免疫系統(tǒng)細胞識別和破壞植入的細胞。 在優(yōu)選實施方案中，半滲透膜抑制植入的細胞從包封中逸失。優(yōu)選的裝置可以具有某些需要的特征，但該特征不限于下述特征中的一種或組合i)包含在生理條件下起作用的生物相容性材料，該生理條件包括PH和溫度；實例包括但不限于，各向異性材料、聚砜(PSF)、納米纖維墊、聚酰亞胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯 (PTFE ；也稱為Teflon )、ePTFE (膨體聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸樹脂、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚酰胺以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)膜；ii)不釋放傷害包封在裝置中的生物活性劑和/或細胞的毒性化合物；iii)促進生物活性劑或大分子跨裝置的分泌或釋放；iv)促進大分子擴散的快速動力學(xué)；ν)促進包封的細胞的長期穩(wěn)定性；vi)促進血管生成；vii)包含化學(xué)惰性的膜或外殼結(jié)構(gòu)；viii)提供穩(wěn)定的機械特性；ix)維持結(jié)構(gòu)/外殼整體性(例如，防止毒性或有害試劑和/或細胞的不期望的泄露)；X)是可重裝填和/或可灌注的；xi)是機械上可擴展的；xii)不含開口或含至少1個、2個、3個或更多個開口 ； xiii)提供用于從宿主組織中免疫分離移植的細胞的機構(gòu)；xiv)易于制造和制備；以及XV) 可被滅菌。本文所述的包封裝置的實施方案不意在限于特定的裝置尺寸、形狀、設(shè)計、容量和 /或用于制備該包封裝置的材料，只要實現(xiàn)上述一個或多個因素即可。裝置設(shè)計在一個實施方案中，通過在裝置中形成一個或多個隔室來改善該包封裝置，而不是通過圍繞外周或邊緣來密封或焊接該裝置來防止細胞和/或生物活性劑的泄露而制成的。圖1是裝置的一個實施方案的示意圖實例，但是該裝置不意在局限于此設(shè)計。而且，該設(shè)計可以包括例如本領(lǐng)域中常規(guī)設(shè)計的變化。在一些實施方案中，裝置設(shè)計可以依據(jù)包封的生物活性劑和/或細胞的類型而進行修改以滿足需要和發(fā)揮研究功能。具有可行的任意尺寸或形狀的裝置可以經(jīng)進一步被分隔而具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少 13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少M個或更多個腔室或隔室。形成多個隔室的一個目的是其提高了包封的細胞和例如裝置周圍的空隙空間之間的營養(yǎng)物和氧交換的表面積；例如參見圖1-11。此外，這樣的設(shè)計抑制或并不促成大的細胞團塊或簇或聚集體，它們使得被塞進大的細胞簇/聚集體中心中的細胞被摒棄，或接受很少的營養(yǎng)物和氧，因此可能無法存活。因此含有多個腔室或隔室的裝置更能夠?qū)⒓毎稚⒃谡麄€腔室/隔室或多個腔室/ 隔室中。這樣，每個細胞更有機會接受營養(yǎng)物和氧，從而促進細胞存活而非細胞死亡。一個實施方案涉及基本上橢圓形至矩形裝置；參見圖1和6。這些裝置進一步被分隔或重構(gòu)建，從而替代稍平的裝置，存在通過裝置中心走向的焊接部分或焊縫，將裝置的每一半密封起來，從而形成兩個分開的儲庫、腔、腔室、中空空間、容器或隔室；或者該焊接部分或焊縫形成一個U形腔室，由于該焊接部分其從中間被隔開或分開，但在此情況下的這樣的焊接部分沒有完全密封該室；參見圖1。圖1中，提供的兩個開口用于容易地使細胞裝填和沖進該腔室和通過該腔室。另一個實施方案涉及類似的橢圓形或矩形裝置，其具有跨該裝置平面的2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多個焊接部分。在一些方面，焊接部分跨裝置的水平面或水平平面。在其它方面，焊接部分跨裝置的垂直面或垂直平面。還在其它方面，相貫的焊接部分存在于跨該平面的水平面和垂直面二者。在一些方面，焊接部分彼此平行且等距。在其它方面，焊接部分是垂直的。還在其它方面，焊接部分平行但不等距。如上述實例中，如果焊接部分穿過裝置延伸并連接裝置的兩個邊界的話，這樣的設(shè)計可有效形成完全分開的多達2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多的室，或者其可以形成一個連續(xù)但互相交叉的腔室。此外，盡管某些示例性裝置在圖1-11中與平行或平行并等距的焊接部分一起描述，但其它裝置還可以以任何方向或取向上的焊接部分定制或制備，包括具有不被焊接部分中斷的區(qū)域的長焊接部分。使用的焊接部分的類型和數(shù)量可以取決于采用的細胞群或試劑，并且取決于治療或用途。在一些實施方案中，可以排列焊接部分以修飾裝置的外觀。圖1顯示了體現(xiàn)本文所述特征的包封裝置，但是如上所述，這僅是一個示例，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以預(yù)見到通過在任意此裝置中使用焊接部分或焊縫形成不同構(gòu)型， 可以定制適于用途的隔室的數(shù)量。圖2-5顯示同一裝置的上部、側(cè)面和端部橫截面。該裝置可以圍繞整個邊緣1超聲焊接，以形成完全封閉的內(nèi)腔?？梢允褂眯纬纱鼱钛b置的密封或隔絕膜的其它機構(gòu)。通過位于中心且沿裝置的長軸延伸的內(nèi)部焊接部分2將腔進一步分隔。該焊接部分延伸到點3，該點3有效限制了每個隔室的厚度或深度，但尚未完全將內(nèi)腔分開。通過此方法，隔室的寬度和深度得到控制且可以根據(jù)需要變化，從而實現(xiàn)細胞產(chǎn)物存活和性能。此外，該裝置的所有尺寸，包括但不限于總長度、總寬度、外緣焊接部分厚度、外緣焊接部分寬度、隔室長度、隔室寬度、隔室深度、內(nèi)部焊接部分長度、內(nèi)部焊接部分寬度和開口位置為可以變化的設(shè)計規(guī)格，變化的目的在于最優(yōu)化用于特定細胞產(chǎn)物和/或生物活性劑的裝置。參照圖1，通過兩個單獨的開口 5、5’向隔室裝載細胞產(chǎn)物或生物活性劑，該開口 5、5’在外緣超聲焊接時引入到裝置中。這些開口延伸到腔或隔室中，并容許通向隔室，用于在裝載期間均勻分布細胞和/或試劑的目的。此外，由于通過如圖1中的U形內(nèi)腔連接開口 5、5’，在裝載鄰近的開口 5’時，使得氣體經(jīng)每個開口 5通氣，因此防止在裝置內(nèi)積累壓力?？蛇x擇地，在另一個實施方案中，本文提供的裝置不含有入口或出口，即該裝置稱為是少開口的。這樣的實施方案顯示于圖6中。圖7-9顯示了基本上類似的裝置的頂部、 側(cè)面和端部橫截面。為了制成如圖6-11所示的少開口裝置，兩個、三個、或更多個階段的焊接加工是必須的。例如，在一個方面，首先通過超聲焊接形成橢圓形/矩形外緣6和分隔點焊部分7。點焊接部分7的功能類似于圖1的內(nèi)部焊接部分2。該點焊部分7以跨裝置的方式設(shè)置，以定期限制在任何給定點處的腔或隔室8的擴展。并且，通過點焊產(chǎn)生腔或隔室 8，由此隔室8相互連接，并且不分離或完全分開任一腔或隔室。此外，點焊部分7的總數(shù)、 直徑和分布為設(shè)計參數(shù)，其可以最優(yōu)化以適應(yīng)裝載動力學(xué)和任何細胞產(chǎn)物或試劑的生長速率。一旦細胞被載入裝置中時，通過跨裝置的邊緣9的第二個超聲焊接部分將該外部邊緣完全和無菌地密封。多步密封方法的結(jié)果是完成的裝置完全封閉，且不具有從外緣延伸的開口。這種方式簡化了裝載過程，且改善了裝置的總體完整性和安全性，因為開口可以是這樣的外緣區(qū)域，在該處由于未達到最佳的超聲焊接導(dǎo)致可能發(fā)生開裂。此外，盡管上述方法以按順序的2個步驟描述，用于包封細胞和/或試劑的手段并不限于所描述的2個步驟，而是以任何順序的任意數(shù)目的步驟，該步驟對包封細胞是必需的且同時防止或降低裝置開裂的水平。在另一個實施方案中，圖10和11顯示了基本上類似于圖6所示裝置的包封裝置， 但是在焊接過程中改進了點焊接部分10以去除中心。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以以各種方式實現(xiàn)這一點，例如通過使用具有尖銳的內(nèi)部邊緣的超聲焊極(ultrasonic sonotrode), 可以在焊接后立刻切割材料。這些切割出的焊接部分10具有的優(yōu)勢在于，它們更易于與宿主組織整合，這是由于切割出的焊接部分10促進裝置的血管化，因此改善了氧依賴性細胞產(chǎn)物和/或試劑的存活和性能。通過裝置實現(xiàn)和促進新的血管系統(tǒng)的結(jié)果是氧在X-Y方向上的擴散運輸?shù)玫礁纳疲摂U散運輸通常局限于平面片層裝置的中心。在另一個實施方案中，該裝置設(shè)計可以為不同形狀，例如細胞包封裝置可以是管狀或平管狀，或者是滿足本發(fā)明裝置的上述要求之一的任何其它形狀。裝置材料所包括的本領(lǐng)域已描述的細胞可滲透膜和不可滲透膜包括上文Baxter之前描述的那些專利或之前被稱為TheraCyte細胞包封裝置，包括美國專利No. 6，773，458 ； 6，520，997 ；6，156，305 ；6，060，640 ；5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ； 5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ；5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ； 5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ；5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ； 5，324,518 ；5, 219, 361 ；5, 100，392 ；和5，011，494，上述所有專利通過引用以其全文并入本文。在一個實施方案中，由生物相容性材料組成包封裝置，該生物相容性材料包括但不限于各向異性材料、聚砜(PSF)、納米纖維墊、聚酰亞胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯(PTFE; 也稱為Teflon )、ePTFE(膨體聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸樹脂、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚酰胺以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)膜。至少由例如G0re 、Phillips Scientific 、Zeus 、Pall⑧和Dewal⑧等制備這些和基本上類似的膜類型和組分。固定化的裝置還提供了可植入的裝置，其固定在植入位點處，以將包封的細胞和/或生物活性劑維持在植入位點并使得例如表達和分泌的治療多肽從該植入位點擴散。一方面，該植入位點在治療所針對的組織或器官處或者鄰近該組織或器官。在其它方面，在從裝置分泌的試劑的遞送并非位點依賴性的且該試劑的生物分布取決于血管系統(tǒng)的情況下，該裝置可以植入遠離的位置。例如，在優(yōu)選實施方案中，該生物相容的裝置皮下植入在前臂、或側(cè)腹、 或背部、或臀部、或腿部等的皮膚下面，在該處其基本上保持直到需要將其移出的這樣的時間?？蓴U展的裝置本文所述的裝置具有內(nèi)表面和外表面，其中該裝置含有至少一個空隙(或儲庫、 或腔、或容器或隔室)，并且其中至少一個空隙對裝置的內(nèi)表面是開放的。常規(guī)可植入的裝置通常由剛性的、非擴展的生物相容性材料制成。本文所述的裝置的一個實施方案由可擴展的材料制成。其它實施方案涉及不可擴展的材料。裝置是否能夠擴展可以是制作該裝置而采用的材料的固有部分，例如可擴展的聚合物外鞘，或者可以設(shè)計使得其可擴展或具有可擴展的能力。例如，提供了擴展尺寸以容納額外的細胞或以重新裝填現(xiàn)有裝置的裝置。在另一個實施方案中，該可植入的裝置包含在外殼或支架中，該外殼或支架是稍微更為剛性的，且為不可擴展的，但是能夠以足夠的手段通過增加植入裝置的數(shù)量來提高細胞或試劑容量。例如，用于插入各自具有預(yù)先裝載的細胞或試劑的額外的儲庫、腔、容器、 隔室或盒子的機構(gòu)?？蛇x擇地，該外殼含有多個裝置，該多個裝置中僅部分裝載了細胞或其中包封了細胞，而其它裝置是空的，可以在之后的時間段及時或在最初植入后的任意時間裝載和裝填細胞或試劑。這樣的可擴展外殼由適于體內(nèi)移植的惰性材料組成，該惰性材料例如金屬、鈦、鈦合金或不銹鋼合金、塑料和適合在哺乳動物中、更具體地在人體內(nèi)植入的陶瓷。還在另一個實施方案中，這樣的外殼或植入裝置支架包括外部套管，該外部套管具有縱軸、沿著該縱軸的至少一個通道和遠端以及適合共同接合裝置的裝置接合區(qū)域。類似地，該裝置支架起的作用類似于能夠在任何時間或長時間容納超過一個磁盤或盒式錄音帶的磁盤或盒式錄音帶支架。還在一些實施方案中，該裝置支架含有適合提高支架高度的延展器?？芍匮b填細胞的包封裝置另一個實施方案涉及具有可重裝填的儲庫、腔、容器或隔室的包封裝置，其可以用適合的治療或生物活性試劑和/或細胞定期裝填或灌注?？梢酝ㄟ^將治療有效量的適合的治療或生物活性劑和/或細胞注射進植入的儲庫、腔、容器或隔室來實現(xiàn)這樣的裝填，例如使用注射器或本領(lǐng)域用于體內(nèi)裝填像儲庫、腔、容器或隔室的其它標(biāo)準手段真皮下或皮下進行。包封的細胞在一些實施方案中，該系統(tǒng)包含的細胞密度為約IX 105、1X IO6細胞/mL至約 1 X 101°細胞/mL或更大。在一些實施方案中，細胞在培養(yǎng)條件下或在系統(tǒng)中體內(nèi)存活至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、 12個月或1年或更長，且具有的功能相當(dāng)于細胞被引入系統(tǒng)時或細胞在系統(tǒng)中完全發(fā)育和 /或成熟時，例如植入需要在體內(nèi)進一步發(fā)育或成熟為功能細胞的祖細胞表現(xiàn)的功能的至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一些實施方案中，系統(tǒng)中的細胞在所述系統(tǒng)中擴增，以提高系統(tǒng)體內(nèi)植入后的細胞密度和/或細胞功能。提高細胞存活的方法細胞和組織包封/免疫分離領(lǐng)域的一個障礙是跨過用于包封細胞和組織的聚合物膜的氧和營養(yǎng)運輸?shù)牟蛔?。這種氣體和營養(yǎng)交換不足的結(jié)果是降低的代謝活性和細胞死亡。本文所述的實施方案涉及解決現(xiàn)有技術(shù)的這一缺陷的可植入的細胞包封裝置。已經(jīng)測量了在胰島的天然環(huán)境中分離后和移植后，在不同聚合物裝置中以及裸露或游離的，例如在腎包囊下胰島內(nèi)的氧分壓。胰腺胰島中的氧分壓是體內(nèi)任何器官中最高的(37-46mmHg)。然而，經(jīng)過分離，這些值急劇下降(14-19mmHg)。胰腺胰島經(jīng)移植到血糖量正常的動物中后，和它們分離的值相比，該值輕微下降(9-15mmHg)。參見Diorme等人’ Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs. 1989 ；35 :739-741 ；禾口 Carlsson 等人，Diabetes July 199847(7) :1027_32，所述文獻的公開內(nèi)容通過引用明確并入本文。這些研究證實了當(dāng)組織被免疫分離且移植時，即使在血管化的區(qū)域，例如腎包囊中，與其自然狀態(tài)相比 (37-46mmHg)，該氧分壓也下降。因此，這些近乎缺氧的條件可以導(dǎo)致細胞死亡，特別是更為接近細胞簇的中心或包封裝置的中心的細胞。為了達到更好的氧利用性和向包封的細胞或組織和/或生物活性劑的更好的遞送，本文所述的實施方案涉及在裝置設(shè)計和/或制劑中，例如在用于裝配該裝置的膜或材料中使用例如全氟化物質(zhì)。特別是全氟有機化合物，例如全氟化碳(PFC)，由于其對氧的溶解性比水高數(shù)倍，是良好的溶劑。例如，在正常條件下，液體PFC溶解以體積計的40至55%的氧和以體積計的100至150%的C02。PFC被大量用作血液替代物和組織保存。此外，PFC 衍生物是無法代謝的密集的、化學(xué)惰性的水可溶性化合物。在該實施方案的另一個方面，&遞送的增強通過PFC-乳液或PFC和一些基質(zhì)的混合物進行。例如，裝置部件或細胞可以懸浮于或浸于或孵育于乳液/基質(zhì)中以形成涂層。已知還有某些具有更高的重量/體積濃度的PFV乳液具有改善的氧遞送和保留特性。并且， 由于由PFC的化攜帶能力產(chǎn)生更高氧分壓，產(chǎn)生&壓力梯度，其推動溶解的氧擴散到組織中，從而增強向細胞的A遞送。PFC物質(zhì)包括但不限于全氟三丁基胺(FC-43)、全氟萘烷、全氟溴辛烷、二-全氟丁基乙烯或其它適合的PFC。優(yōu)選的PFC通常含有約60至約76重量百分比的碳鍵合的氟。該全氟流體可以是單一化合物，但通常是此類化合物的混合物。美國專利 No. 2，500，388 (Simons) ；2，519，983 (Simons) ；2，594，272 (Kauck 等人)；2，616，927 (Kauck 等人)；和4，788，339(M00re等人)，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。用于本文所述 ^ ' PFC ^1^ Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer, 第三版，第10卷，第874-81頁，John ffiley&Sons (1980)的那些。例如，有用的PFC包括全氟-4-甲基嗎啉、全氟三乙基胺、全氟-2-乙基四氫呋喃、全氟-2- 丁基四氫呋喃、 全氟戊烷、全氟-2-甲基戊烷、全氟己烷、全氟-4-異丙基嗎啉、全氟二丁基醚、全氟庚烷、全氟辛烷、及其混合物。優(yōu)選的惰性液體氟化物包括全氟己烷、全氟-2-丁基四氫呋喃、全氟庚烷、全氟辛烷、及其混合物。用于本文所述的實施方案的可商購的PFC包括 FLUORINERT. TM.流體，例如FC-72、FC-75、FC-77和FC-84 (描述于1990年產(chǎn)品說明書 #98-0211-5347-7(101. 5) NPI), FLUORINERT. TM.流體(可得自 Minnesota Mining and Manufacturing Company, St. Paul, Minn)昆^^I 。體內(nèi)成像能力在一個實施方案中，提供了用于在包封裝置中體內(nèi)成像或檢測細胞的手段。成像在干細胞療法中起到重要作用。例如，無創(chuàng)的成像形式可以用于(1)確定細胞和/或要治療的疾病的存在、嚴重性或表型；( 監(jiān)測移植細胞療法中有害或非靶向細胞類型和結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，例如囊腫或小囊腫；C3)引導(dǎo)療法的遞送；(4)跟蹤疾病的時間進程和評估效果或療效；( 提供標(biāo)簽和限定療法的機制；(6)分析和評估移植的細胞的存活和功能；以及 (7)通常促進任何細胞療法的過程，例如通過確定細胞療法的移植、存活和局部功能，包括本文所述的通過替代和/或植入胰腺祖細胞用于治療糖尿病的細胞療法。此外，盡管細胞療法致力于降低致病率/死亡率，此處和下文更詳細描述的無創(chuàng)成像技術(shù)可以作為有用的替代性終點，例如在初步試驗或初步研究中。任何理想的體內(nèi)成像技術(shù)為i)無創(chuàng)的；ii)可靠地重復(fù)的；iii)能夠進入組織直到至少3mm的深度；iv)分辨能力不大于100 μ m,并且理想地不大于50 μ m ；ν)成像不被裝置材料削弱，例如可以透過PTFE成像；vi)臨床上相容的，且不是技術(shù)上難處理的或復(fù)雜的；vii)可商購的；viii)FDA批準用于人類使用；ix)合理的成本效益；以及χ)可以在合理的時間段(例如數(shù)秒或數(shù)分鐘)內(nèi)對細胞成像，或者上述的任意組合。到目前為止，當(dāng)前的方法包括但不限于共聚焦顯微技術(shù)、2-光子顯微技術(shù)、高頻超聲、光學(xué)相干斷層成像術(shù)(OCT)、光聲成像技術(shù)(photoacoustic tomography, PAT)、計算機斷層掃描技術(shù)(CT)、磁共振成像(MRI)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(SPECT)和正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)。這些技術(shù)單獨或組合可以提供監(jiān)測移植細胞的有用手段。此外，期望此類技術(shù)將隨著時間而改進，并且每項技術(shù)發(fā)揮功能或其利用的基本原理基本上是類似的。這就是說，本文所述的體內(nèi)成像不意在局限于下文描述的技術(shù)，還涉及將起到和本文所述的相同效用的今后開發(fā)的和描述的技術(shù)。 在一個實施方案中，采用的成像技術(shù)為無創(chuàng)的，且提供3維斷層掃面數(shù)據(jù)，具有高的時間和空間分辨率，能夠分子成像，并且是低廉和便于攜帶的。盡管現(xiàn)在沒有單獨的模式是理想的(下文更為詳細地描述)，每一個具有不同的特性，并且這些模式可以共同提供值得稱贊的信息。共聚焦顯微技術(shù)為提高顯微相差的光學(xué)成像技術(shù)，其能夠通過使用光學(xué)針孔來消除比聚焦平面更厚的樣本中的焦點外光線，從而重建三維圖像。由于在樣品中一次只有一個點被照射，2D或3D成像需要掃描樣本中的規(guī)則的光柵(即矩形的平行掃描線條式樣)。 通常采取三個主要掃描變量來產(chǎn)生共聚焦顯微掃描圖像?？梢酝ㄟ^下述方式來實現(xiàn)基本等同的共聚焦操作采用偶聯(lián)于穩(wěn)定照射光束的側(cè)向移動的樣本鏡臺(鏡臺掃描)、具有穩(wěn)態(tài)的掃描光束(光束掃描)、或通過在用通過旋轉(zhuǎn)的Nipkow或Mpnov盤的孔投射的光點陣列掃描樣本的同時，保持鏡臺和光源穩(wěn)定。每項技術(shù)具有使得其有利于特定共聚焦應(yīng)用的性能特性，但是限制了其他應(yīng)用的特性的使用。所有的共聚焦顯微鏡都依賴于該技術(shù)順序通過相對厚的切面或全部封固的樣本而產(chǎn)生高分辨率圖像的能力，該高分辨率圖像稱為光切面。基于作為基礎(chǔ)圖像單元的光切面，可以以單、雙、三或多波長照射模式從固定的和染色的樣本收集數(shù)據(jù)，并且用不同照射和標(biāo)記策略收集的圖像將互相對準?；罴毎上窈脱訒r順序是可行的，并且應(yīng)用于圖像順序的數(shù)字圖像處理方法能獲得樣本的ζ-系列和三維表現(xiàn)，以及作為四維成像的3D數(shù)據(jù)的時間順序表現(xiàn)。并不限制上述共聚焦顯微鏡的使用，因為現(xiàn)在或以后開發(fā)的其它共聚焦顯微鏡也包括于本文所述的實施方案中。可使用大量的熒光探針，當(dāng)引入到相對簡單的操作中時，其可以給某些細胞表面標(biāo)志物和/或蛋白和胞內(nèi)細胞器和結(jié)構(gòu)染色，例如CelltrackeiNDil、核活體染料等等。特異地直接或間接結(jié)合某些細胞表面標(biāo)志物的熒光標(biāo)志物可以特別用于鑒別例如不想要的細胞類型。在一個優(yōu)選實施方案中，對體內(nèi)存在的包封的多能細胞實時成像提供了檢測手段，并因此提供了預(yù)防由多能干細胞導(dǎo)致的畸胎瘤形成的可能性，該多能干細胞例如hES 或人胚胎生殖細胞或誘導(dǎo)的多能干(IPQ細胞或無精生殖(parthenote)細胞等。同一檢測手段還可以鑒別從裝置逸出或泄漏的(或變得不被包封的)多能干細胞。還可以使用在多能干細胞中表達上調(diào)的熒光標(biāo)記的啟動子基因0CT4和NANOG進行此類細胞的鑒別。類似地，某些標(biāo)記核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的胞內(nèi)熒光標(biāo)志物以及甚至例如以細胞內(nèi)聚合肌動蛋白為靶點的熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽的染料都是可商購的，且可以提供有關(guān)細胞命運的重要信息。在另一個實施方案中，二光子發(fā)射熒光(TPEF)顯微術(shù)是監(jiān)測分化或反過來說是鑒別多能干細胞的無創(chuàng)手段，該多能干細胞(例如hESC或IPS細胞或無精生殖細胞)不分化，且作為包封于本文所述裝置的非常小百分比的產(chǎn)物細胞而無意中植入。二光子發(fā)射熒光顯微術(shù)基本上依賴于內(nèi)部來源的相差，但還可以通過二次諧波發(fā)生檢測例如原纖維基質(zhì)。簡單來說，二光子顯微術(shù)所依賴的熒光發(fā)射類似于共聚焦顯微術(shù)采用的熒光發(fā)射。Rice等人(2007年)描述了 TPEF可用于揭示生物化學(xué)狀態(tài)中的量差和分化和未分化干細胞的二維 O-D)形狀。參見 Rice 等人(2007 年)J BiomedOpt. 2007 年 11 月-12 月；12 (6)，其公開內(nèi)容通過引用明確并入本文。在一個實施方案中，可以基因修飾多能干細胞以表達熒光蛋白，例如增強的綠色熒光蛋白，并被多能干細胞啟動子(例如0CT4或NANOG或以后鑒別的任何其它多能干細胞啟動子)驅(qū)動。對于比皮下移植更深，即深度低于皮膚表面的那些可植入裝置，二光子提供比共聚焦顯微術(shù)更深的無創(chuàng)成像。此外，使用的紅外線對活細胞的傷害比暴露于可見光或紫外線的小，這是因為熒光發(fā)射所需的光子能量僅在焦點平面處，并且不被焦點外平面中的細胞或組織感受到。還在一個實施方案中，超聲是便于攜帶的、基本上無害的、多功能的，且可在包封的細胞產(chǎn)物和/或包封的生物活性劑植入時實時進行。特別地，高頻超聲例如 VisualSonics所描述的。高分辨率成像使得可以體內(nèi)評估哺乳動物縱向研究中的解剖結(jié)構(gòu)和血液動力學(xué)功能。例如VisualSonics的Vevo提供(1)進行個體受試者的疾病發(fā)展和退行的縱向研究的能力；(2)低至30微米的解剖和生理結(jié)構(gòu)的成像分辨率；(3)使圖像引導(dǎo)的針注射和抽取可視化的能力；(4)微循環(huán)和心血管血流評估；( 經(jīng)用戶友好的設(shè)備和研究推動的界面的高通量；和(6)獲得全面測量和注釋以及離線數(shù)據(jù)分析的開放性結(jié)構(gòu)。評估微循環(huán)和心血管血流的能力將有助于確定細胞的活力，例如O2流動和遞送。在另一個實施方案中，磁共振成像(MRI)可以用于使用相差試劑區(qū)分健康的和患病的組織。此外，在另一個實施方案中，計算機斷層掃描技術(shù)(CT)或CT掃描可以用于產(chǎn)生體組織和結(jié)構(gòu)的詳細圖片。并且，此處使用相差試劑，并使其易于由于特定吸附速率使正常組織可視化。相差試劑例如8-羥基喹啉銦-111 (I-Ill)的一個用途是用于追蹤干細胞，盡管其半衰期確實短。此外，在另一個實施方案中，正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)(PET)掃描可以用于測量來自正電子發(fā)射分子，例如碳、氮和氧等的發(fā)射，并且提供有價值的功能信息。在又一個實施方案中，光子共聚焦斷層掃描技術(shù)(OCT)或光聲斷層掃描技術(shù)(PAT)也可用于考察裝置內(nèi)外的細胞和組織。OCT檢測不同組織的反射率差異，而PAT檢測組織暴露于低能量激光而被加熱時產(chǎn)生的超聲波。不同方法和技術(shù)或工具可以單獨或組合用于可視化、分析和評估體內(nèi)裝置內(nèi)的植入的細胞。這些和現(xiàn)在已知或今后開發(fā)的其它技術(shù)可以利用到這樣的程度，即它們能夠用于體內(nèi)成像和監(jiān)測本文所述的細胞和/或試劑。在整個申請中，引用了不同出版物。所有這些出版物和這些出版物中引用的那些參考文獻的公開內(nèi)容都通過引用一起全文加入到本申請中，從而更為全面的描述該專利所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。實施例1包封的胰腺祖細胞的體內(nèi)功能進行了下述實施例，至少部分地首先確定了包封胰腺祖細胞的方法的完整性，其包括生物相容性裝置和醫(yī)學(xué)/機械裝置；第二，確定與未包封的胰腺祖細胞(對照)相比， 完全包封的胰腺祖細胞是否體內(nèi)存活并成熟為有功能的激素分泌細胞。用于制備來自人胚胎干(hEQ細胞的胰腺細胞系的方法基本上描述于下述專利和專利申請中題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國專利No. 7，534，608、2008年10月4日提交的題為“干細胞團塊懸浮組合物及其分化方法”的美國申請No. 12/264, 760 ；2007年7月5日提交的題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”美國專利申請No. 11/773,944 ;2008年6月3日提交的題為“用于生產(chǎn)定形內(nèi)胚層的生長因子”的美國申請No. 12/132，437 ；2008年4月8日提交的題為“用于純化源于人胚胎干細胞的內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)胚層細胞的方法”的美國申請 No. 12/107，020 ；2007年10月19日提交的題為“用于含人血清的無飼養(yǎng)層的多能干細胞培養(yǎng)基的方法和組合物”的美國申請No. 11/875，057 ；2007年2月23日提交的題為“用于培養(yǎng)分化的細胞的組合物和方法”的美國申請No. 11/678,487 ；題為“用于干細胞培養(yǎng)的可選的組合物和方法”的美國專利No. 7，432，104 ；Kroon等人，(2008年)Nature Biotechnology 26(4) :443-452 ；d，Amour 等人，2005 年，Nat Biotechnol. 23 :1534-41 ；D，Amour 等人，2006 年，Nat Biotechnol. 24(11) :1392-401 ；McLean 等人，2007 年，Stem Cells 25:29-38，其公開內(nèi)容都通過弓I用以其全文并入本文。簡單來說，未分化的人胚胎干(hES)細胞在DMEM/F12 (Mediatech)中維持在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層(特殊培養(yǎng)基)上，該DMEM/F12補充了 20% KnockOut血清替代物 (K0SR, GIBCO BRL)、ImM 非必需氨基酸(GIBC0 BRL)、Glutamax (GIBC0 BRL)、青霉素 / 鏈霉素(GIBC0 BRL)、0. 55mM 的 2-巰基乙醇(GIBC0 BRL)和 4ng/mL 重組人 FGF2 (R&DSystems) 以及可選擇地補充了 10-20ng/mL的活化蛋白A (R&D Systems)。每5至7天以約1 4至 1 8、1 9或1 10的分流比人工傳代人ES細胞培養(yǎng)物。在作為貼壁培養(yǎng)物或在細胞團塊懸液中分化之前，在PBSv+(含有Mg++和Ca++，Invitrogen)中簡單洗滌細胞。人ES細胞系可以包括但不限于CyT49、CyT203、Cyt25、BGOl和BG02。用于培養(yǎng)和分化懸液中的細胞或細胞群的方法詳細描述于2007年2月23日提交的“用于培養(yǎng)分化的細胞的組合物和方法”的國際申請PCT/US2007/062755和2008年11月 4日提交的“干細胞團塊懸浮組合物及其分化方法”的美國申請No. 12/264, 760中，這些申請通過引用以其全文并入到本文。分化培養(yǎng)條件基本上類似于上文的D’ Amour等人2006年所描述的條件和下面的實施例4，二者都描述了 5步分化操作階段1 (定形內(nèi)胚層；第1天-第4天)、階段2 (原初腸管或前腸內(nèi)胚層；第5天-第8天)、階段3 (較晚的前腸或Pdxl陽性的內(nèi)胚層；第9 天-第12天)、階段4(胰腺祖細胞、胰腺上皮和/或內(nèi)分泌前體；第13天-第15天)和階段5 (激素表達內(nèi)分泌細胞；第16天或更長)。在階段4，從階段3培養(yǎng)物中去除視黃酸(RA)，用DMEM+B27 (1 IOOGibco)洗滌培養(yǎng)物一次，然后將洗液替換為單獨的DMEM+1 XB27補充物，或替換為DMEM+1 XB27補充物和下述因子的任意組合或任何一種或全部達4-8天頭蛋白(50ng/ml)、FGF10 (50ng/ml)、 KGF(25-50ng/ml)、EGF(25-50ng/ml) ,1-5 % FBS0 在沒有添加 RA 的情況下，將 30_100ng/ ml (R&Dsystems)的頭蛋白加入到培養(yǎng)基中1_9天?？蛇x擇地，在階段4不添加額外的生長因子。并且，可以向培養(yǎng)物中添加細胞存活試劑，例如Y-27632、法舒地爾、H-1152P以及含有胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒(ITS)的混合物。無論是否從貼壁培養(yǎng)物或在細胞團塊懸液中生產(chǎn)胰腺祖細胞，所有的胰腺祖細胞群在移植于哺乳動物中時都體內(nèi)發(fā)育和成熟為功能性內(nèi)分泌組織。由源于hES的移植細胞體內(nèi)生成胰島素描述于上文的美國申請和參考文獻中，例如題為“生產(chǎn)胰島激素的方法”的美國申請No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年。不同于美國申請No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年所描述的細胞組合物，本研究中的胰腺祖細胞為體內(nèi)完全分離的或包封的。使用生物相容性聚乙二醇(PEG) 包封胰腺祖細胞，其更為詳細地描述于題為“用于治療疾病的包封的生物材料的植入”的美國專利No. 7，427，415，其通過引用并入本文。PEG包封的胰腺祖細胞移植在附睪脂肪墊 (EFP)下；測定了葡萄糖刺激后不同時間點的血清C肽水平；并且在PEG包封的外植體上進行了免疫組化分析。此外，這些方法之前已描述于題為“生產(chǎn)胰島激素的方法”的美國申請 No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年(數(shù)據(jù)未示出)。免疫組化分析顯示胰島祖細胞能夠體內(nèi)成熟并含有激素表達細胞，例如胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素。還可以使用醫(yī)學(xué)或機械裝置進行該胰腺祖細胞的包封，該裝置例如TheraCyte 細胞包封裝置。所有述及的TheraCyte細胞包封裝置的參考文獻都指的是直接從廠商(TheraCyte，Inc.，Irvine, California)購買的裝置，并進一步描述于美國專利 No. 6，773，458 ；6，156，305 ；6，060，640 ；5，964，804 ；5，964，261 ；5，882，354 ；5，807，406 ； 5，800，529 ；5，782，912 ；5，741，330 ；5，733，336 ；5，713，888 ；5，653，756 ；5，593，440 ； 5，569，462 ；5，549，675 ；5，545，223 ；5，453，278 ；5，421，923 ；5，344，454 ；5，314，471 ； 5，324,518 ；5, 219, 361 ；5, 100，392 ；和5，011，494，上述所有專利通過引用以其全文并入本文。胰腺祖細胞體外裝載進裝置中，或者當(dāng)該裝置已經(jīng)植入一段時間使得裝置預(yù)血管化后， 然后經(jīng)裝置一側(cè)上的裝載口體內(nèi)裝載細胞。因此，該裝置含有細胞(0.4微米)不可滲透的第一膜，但同時該膜不限制氧和不同營養(yǎng)物進出內(nèi)膜的活動，例如來自內(nèi)膜外的葡萄糖可以滲透進入含有成熟的胰腺激素分泌細胞的囊，該胰腺激素分泌細胞響應(yīng)葡萄糖，可以分泌胰島素，然后該胰島素滲透出內(nèi)膜。該裝置還含有血管化的外膜。為了將裝置用于任何細胞療法，該裝置必需完全體內(nèi)含有細胞(例如源于hES的細胞與宿主免疫分離)。為了測定TheraCyte裝置的完整性，體內(nèi)比較了含有胰腺祖細胞的完整裝置與膜中具有穿孔的那些裝置。將裝置穿孔會使宿主細胞侵入，因此建立起宿主-移植物的細胞間接觸。通過外科手術(shù)將2個4. 5 μ L TheraCyte裝置植入到嚴重組合免疫缺陷型(SCID) 的各只雄性beige (BG)小鼠的附睪脂肪墊(EFP)下或皮下(SQ)，該TheraCyte裝置首先預(yù)血管化。即，一只動物在EFP下接受2個裝置，另一只動物接受2個裝置(SQ)。這些完整但空 (無胰腺祖細胞)的裝置在動物內(nèi)保留足夠的時間，使得宿主血管結(jié)構(gòu)形成并與裝置相連， 例如至少2至8周。8周后，源于hES細胞的約1. 5 X IO6個胰腺祖細胞被裝載進該4個裝置的每一個中。在帶有預(yù)血管化的裝置的動物被裝載的同時，將2個改進的TheraCyte裝置植入另外3只動物，其中相同尺寸的原TheraCyte裝置的改進是在該裝置的膜中穿孔。用具有和裝載進入穿孔的裝置的相同劑量的細胞離體裝載這些穿孔的裝置(每只動物 2個穿孔裝置)。并且在同一時間，和這些實驗平行進行2個陽性對照，并且每只動物移植置了 Gelfoam上的胰腺祖細胞，如題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國申請No. 11/773,944 和上文的Kroon等人2008年所述的，盡管在一只動物中兩個移植物置于EFP下，另一只動物中僅一個移植物置于EFP下。表1總結(jié)了上述實驗的結(jié)果。表1 來自包封的成熟胰腺激素分泌細胞的人C-肽血清水平9周12周15周植入動物#GSIS時間 (分鐘)人C-肽 pMGSIS時間人C-肽 pMy GSIS時間L C-肽 pMPV6750910186EFP60224303042xl.5M60419PV676015703220908SQ606103053258742x1.5M6026373030376790 60239 7270 30374 482nPV +孑L EFP 2χ1.5M6022596800 60218 8990 30 60329 506 2177681040804220155460213630 601059 27515 301615 103306820912048801504EFP GF603716303025518782xl.5M6036733042886840279044401498EFP GF6058030751514112χ1.5M603000304698就葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIQ而言，0指時間為0 ;5指葡萄糖刺激后5分鐘； 30指葡萄糖刺激后30分鐘；60指葡萄糖刺激后60分鐘；PV TC EFP，在附睪脂肪墊下預(yù)血管化的HieraCyte ;PV TC SQ，皮下的預(yù)血管化的TheraCyte ;nPV TC+孔EFP，在附睪脂肪墊下的未預(yù)血管化的TheraCyte ；以及EFP GF, Gelfoam上的附睪脂肪墊，2 X 1. 5M，具有約 IXlO6個細胞的2個構(gòu)建體。使得胰腺祖細胞體內(nèi)發(fā)育和成熟，并且基本上如題為“生產(chǎn)胰腺激素的方法”的美國專利No. 11/773，944和上文的Kroon等人2008年所述，測定現(xiàn)在成熟的激素分泌細胞的胰島素分泌和葡萄糖響應(yīng)。參見表1。此外，為了確定裝置的完整性，處死一些動物，并進行裝置的免疫組化考察。申請人:之前證明了，對于證明胰島素分泌細胞對體內(nèi)葡萄糖有響應(yīng)的這一點，低于50pM的血清人C-肽水平或低于25pM的胰島素水平是沒有意義的。這一相同標(biāo)準用于這些研究中。該研究的結(jié)果示于表1。原始Theracyte裝置和改進的Theracyte裝置在8、 12和15周后都具有相當(dāng)?shù)难迦薈-肽水平(動物編號675-676&679-681)，動物編號681 在葡萄糖刺激后30分鐘時除外，當(dāng)時血清C-肽水平要比在該時間段的任何其它動物要高得多。首先，就Theracyte包封裝置的完整性而言，進行了原始Theracyte裝置和改進的 Theracyte裝置(動物編號分別為675-676和679-681)的蘇木精和伊紅染色。這些裝置的顯微鏡考察顯示，原始Theracyte裝置具有不同的宿主血管結(jié)構(gòu)，包括裝置周圍的血管型細胞，但是沒有觀察到這些類似的結(jié)構(gòu)侵入細胞不可滲透的內(nèi)膜和進入含有源于hES的細胞的空間。即，在容納源于hES的細胞或移植物的細胞不可滲透的內(nèi)膜內(nèi)沒有觀察到宿主血管結(jié)構(gòu)。相比之下，改進的Theracyte裝置的顯微鏡考察顯示，不僅在裝置的外側(cè)上存在相連的宿主血管結(jié)構(gòu)，在穿孔的細胞不可滲透的內(nèi)膜內(nèi)部也發(fā)現(xiàn)了血管結(jié)構(gòu)和血管細胞。 因此，原始Theracyte裝置可以完整含有源于hES的細胞，并且在容納源于hES的細胞的空間中沒有觀察到宿主細胞和組織。總的來說，Theracyte裝置能夠完全體內(nèi)包封(分離)源于hES的細胞，并且胰腺祖細胞可以在這些裝置中體內(nèi)存活和成熟為功能性的激素分泌細胞。除了證明Theracyte裝置的完整性之外，本研究還證明了完全完整的裝置能夠在包含的源于hES的細胞和宿主環(huán)境之間交換足夠的氧和各種營養(yǎng)物，并且胰腺祖細胞能夠體內(nèi)存活和成熟。例如，和對照(動物682和684)相比，在9和12周時預(yù)血管化的裝置中的血清人C-肽水平不如相同時間點的一樣高。然而，到第15周(細胞植入后)，預(yù)血管化的裝置中的血清人C-肽水平和未包封(Gelfoam)的對照相當(dāng)。此外，處死帶有原始Theracyte (預(yù)血管化的)裝置的動物，并取出裝置(或外植體)(動物編號675&676)?；旧显偃鏚roon等人2008年所述，再次進行免疫組化，其通過固定取出的裝置和/或外植體，將10個切片切成薄的微米切片而進行。用PBS洗滌切片 2 次，之后用 PBST(PBS/0. 2% (wt/vol)吐溫 20 ；Thermo Fisher Scientific)洗滌。在 24°C下，用 5%正常猴血清(Jackson Immuno Research Labs)/PBSTr(PBS/0. 1% (wt/vol) Triton X-IOO(Sigma))封閉 1 小時。在 1 % BSA(Sigma)/PBSiTr 中稀釋一抗和二抗。在 4°C 下孵育一抗過夜，在保濕室中孵育二抗約1小時15分鐘。采用下述一抗和稀釋液；豚鼠抗胰島素(INS), 1 500 (Dako，A0564)；兔抗生長激素抑制素(SST)，1 500 (Dako, A0566)；山羊抗生長激素抑制素(SST), 1 300 (Santa Cruz Biotechnology, SC-7819)；山羊抗胰高血糖素(GCG)，1 100 (Santa Cruz Biotechnology，SC-7780)。通過共聚焦顯微術(shù)(Nikon, Exlipse 80i, Cl)進行成像。原始Theracyte裝置/外植物的免疫組化考察清楚地顯示了單陽性激素細胞，例如GCG、INS和SST表達細胞。該數(shù)據(jù)支持了血清人C-肽數(shù)據(jù)，后者證明了移植的源于hES 的細胞的葡萄糖響應(yīng)。激素分泌細胞的存在證實了胰腺祖細胞能夠體內(nèi)存活和成熟，即使是在完全包封的情況下。上述研究清楚地證明了原始和改進的Theracyte裝置完全包含源于hES的胰腺祖細胞且沒有宿主細胞跨細胞不可滲透的內(nèi)膜侵入的能力。這些研究還證明了該裝置的細胞不可滲透的內(nèi)膜盡管對細胞是不可滲透的，但是對于源于hES的胰腺祖細胞在裝置中存活所需的氧和各種營養(yǎng)物是可滲透的，使得祖細胞能夠體內(nèi)成熟為激素分泌細胞，即為發(fā)揮功能且對葡萄糖響應(yīng)的細胞。此外，預(yù)見到胰腺系細胞群、特別是至少本文所述的胰腺祖細胞，當(dāng)包封于改進的裝置，例如至少為圖1-11中所述的那些之中時，將會體內(nèi)成熟和發(fā)揮功能。實施例2在沒有宿主-移棺物細胞接觸情況下,包封的胰腺祖細胞的體內(nèi)功能為了確定移植的胰腺祖細胞群內(nèi)功能化是否需要宿主-移植物細胞間接觸，將細胞裝載進未預(yù)血管化的細胞包封裝置。胰腺祖細胞群基本上如實施例1中所述生成。在此研究中不對裝置進行預(yù)血管化，并且將所有的TheraCyte裝置5 μ L)中的每個裝置離體裝載至少1. 5X IO6個細胞 (1.5Μ)或4. 5\106個細胞0.511)。將含有1.511個細胞的3個裝置皮下植入(1^ SQ 1. 5Μ)， 將含有4. 5 X IO6個細胞(4. 5Μ)或約15 μ L的3個裝置離體皮下植入(TC SQ 4. 5Μ)。為了對比和作為對照，將具有植入的未包封的胰腺祖細胞的動物與包封的但未預(yù)血管化的實驗平行進行。將3只小鼠中的每一只皮下植入2個Gelfoam構(gòu)建體，所述構(gòu)建體裝載了約 1. 9-2. 4X IO6個細胞O個構(gòu)建體的總合)，或約4 μ L/構(gòu)建體，并且將2只小鼠在EFP下植入2個Gelfoam構(gòu)建體，所述構(gòu)建體裝載了約1. 9_2. 4Χ IO6個細胞O個構(gòu)建體的總合)， 或約4 μ L/構(gòu)建體。表2總結(jié)了上述實驗的結(jié)果。表2 來自包封的未預(yù)血管化的成熟胰腺激素分泌細胞的人C-肽血清水平
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動物中體內(nèi)生成胰島素的方法，所述方法包括(a)向可植入的半滲透裝置中提供體外人PDXl日性的胰腺祖細胞群；(b)將具有所述細胞祖細胞群的裝置植入到哺乳動物宿主中；和(c)使所述祖細胞群在所述裝置中體內(nèi)成熟，使得所述祖細胞群包含內(nèi)分泌細胞和腺泡細胞，其中至少部分所述內(nèi)分泌細胞為響應(yīng)體內(nèi)葡萄糖刺激而生成胰島素的胰島素分泌細胞，從而為所述哺乳動物生成胰島素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括使PDXl陽性的胰腺祖細胞成熟為腺泡細胞或?qū)Ч芗毎?br> 3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置通過植入所述哺乳動物中而首先預(yù)血管化。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個焊接部分，用于使所述裝置中的人PDXl陽性的胰腺祖細胞群的表面積與容積比最大化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置包含多個焊接部分，以提高所述宿主進行的血管化。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可重裝填的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述裝置是可擴展的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中監(jiān)測所述體內(nèi)細胞群。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動物的血清中可檢測到大于25pM的胰島素。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在葡萄糖刺激后所述哺乳動物的血清中可檢測到大于50pM的人C-肽。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞群與所述宿主哺乳動物的一個或多個細胞分隔開。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是經(jīng)免疫抑制的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽性的胰腺祖細胞群包括解凍細胞群。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽性的胰腺祖細胞群還包括富集所述細胞群的PDX1/NKX6. 1共陽性的胰腺祖細胞。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中提供人PDXl陽性的胰腺祖細胞群還包括通過使所述細胞群接觸結(jié)合CD142抗原的抗體以及富集所述CD142結(jié)合細胞而富集所述細胞群的 PDX1/NKX6. 1共陽性的胰腺祖細胞。
16.一種用于植入到哺乳動物宿主中的細胞包封組件，所述組件包含用于包封活細胞的至少一個腔室，其中所述組件包括第一密封件和第二密封件，所述第一密封件位于所述組件的外周邊緣處從而形成所述包封組件，所述第二密封件有效降低腔室容積但提高裝置的表面積。
17.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件包含半滲透膜。
18.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件具有第三或第四密封件，并進一步降低所述腔室容積。
19.如權(quán)利要求16所述的組件，其進一步包含至少一個裝載口。
20.如權(quán)利要求16所述的組件，其包含2個裝載口。
21.如權(quán)利要求16所述的組件，其中所述組件進一步包含活細胞。
22.如權(quán)利要求21所述的組件，其中所述活細胞為人PDXl陽性的胰腺祖細胞。
23.—種冷凍保存的人胰腺祖細胞群，其中所述細胞群適于移植到哺乳動物中。
24.如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述細胞群的細胞能夠在所述哺乳動物中成熟為胰島細胞或腺泡細胞。
25.如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述細胞群的細胞能夠成熟為β細胞，所述β 細胞能夠響應(yīng)葡萄糖刺激而分泌胰島素。
26.如權(quán)利要求23所述的細胞群，其中所述胰腺祖細胞群包含PDXl陽性的胰腺祖細胞。
27.一種保存適于移植的細胞的體外群的方法，所述方法包括a)人胰腺祖細胞群接觸冷凍保存溶液，從而保存用于冷凍保存的細胞體外群；和b)降低所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度至低于約0°C，從而獲得適于移植的胰腺祖細胞群。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于約-50 0C ο
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于約-100°C。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于約-150°C。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述用于冷凍保存的祖細胞的溫度降低至低于約-190"C。
32.一種提供適于移植的細胞的體外群的方法，所述方法包括提高冷凍保存的細胞群的溫度，以獲得適于移植的胰腺祖細胞群。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其進一步包括將所述細胞群提供給細胞包封組件的步馬聚ο
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細胞包封組件為如權(quán)利要求16所述的組件。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在生物相容性半滲透包封裝置中包封胰腺祖細胞的方法。本發(fā)明還涉及在哺乳動物中響應(yīng)葡萄糖刺激生成人胰島素。
文檔編號C12N11/00GK102282254SQ200980154622
公開日2011年12月14日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者喬德·格林, 伊曼紐爾·E·拜特格, 依文特·克魯恩, 凱文·德阿穆爾, 勞拉·馬丁森, 奧利維亞·凱利, 艾倫·奧古爾尼克 申請人:維賽特公司