專利名稱：一種組織特異性兼可調(diào)控性慢病毒基因表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種慢病毒雙基因表達(dá)載體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢病毒載體是以人類免疫缺陷1型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體.區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力.該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久件表達(dá).在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的基因治療效果。一種有效的治療基因載體需滿足以下基本條件基因表達(dá)效率高，能達(dá)到治療效果；對(duì)靶細(xì)胞組織有特異性且基因表達(dá)水平可控性從而使其使用具有安全性。為了達(dá)到基因表達(dá)的可控性，目前常用四環(huán)素或其衍生物作用于與其相對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子達(dá)到受其控制的外源目的基因水平的調(diào)控。為了提高基因治療的安全性，在載體構(gòu)建中通常使用組織特異性啟動(dòng)子以達(dá)到相應(yīng)組織細(xì)胞內(nèi)的目的基因的表達(dá)。由于基因治療的效果很大部分取決于靶細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)水平。因此，為提高基因表達(dá)效率，目前在基因治療領(lǐng)域中常用的方法是采用兩個(gè)獨(dú)立載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第一個(gè)載體通常含一啟動(dòng)子用于表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄激活因子，第二個(gè)載體含一對(duì)應(yīng)與第一載體所含的轉(zhuǎn)錄激活因子的啟動(dòng)子用來表達(dá)目的基因，第一載體的轉(zhuǎn)錄激活因子通過加強(qiáng)作用于第二載體的啟動(dòng)子從而增高目的基因的表達(dá)水平。 用這種方法雖能提高基因表達(dá)治療量卻增加了用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞所需的總病毒量滴度。此外，由于慢病毒載體的基因組(genome)約8kb，只能容納有限的外源性插入DNA 序列，而且雙基因表達(dá)載體多為順式表達(dá)，對(duì)第二個(gè)基因的表達(dá)量具有一定的降低。因此， 構(gòu)建一種可控性與高效率的基因表達(dá)盒于一體的載體既能提高治療效果又能增加安全性。 同時(shí)這樣一種載體不但具有聯(lián)合轉(zhuǎn)染的效果同時(shí)又降低為了能達(dá)到聯(lián)合轉(zhuǎn)染效果所需的兩個(gè)載體的總病毒量滴度，從而保證了既具使用安全性又降低了成本。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上所述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的構(gòu)建了一種具有組織細(xì)胞特異性并兼?zhèn)淇烧{(diào)控目的基因高效表達(dá)的慢病毒雙基因表達(dá)載體。此慢病毒載體具有兩個(gè)各自獨(dú)立的基因表達(dá)盒。兩個(gè)基因表達(dá)盒呈反式方向設(shè)置并共享一個(gè)PolyA尾巴。一個(gè)基因表達(dá)盒沿5’至3’方向含有對(duì)藥物呈可調(diào)控啟動(dòng)子，由其控制外源性目的基因的表達(dá)。另一個(gè)基因表達(dá)盒沿3’至5’方向含有組織細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制一轉(zhuǎn)錄激活因子。此轉(zhuǎn)錄激活因子在四環(huán)素衍生物DoxycyclineQox)的存在并達(dá)到一定劑量下能激活并放大另一基因表達(dá)盒內(nèi)的可調(diào)控啟動(dòng)子從而顯著提高目的基因的表達(dá)量。在藥物不存在或低于一定劑量時(shí)，此載體由于轉(zhuǎn)錄激活因子未有效作用于可調(diào)控性啟動(dòng)子而呈低基線基因表達(dá)水平。此夕卜，在特異的組織細(xì)胞內(nèi)，組織細(xì)胞特異性啟動(dòng)子由于該組織內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄激活因子對(duì)其的作用而活性增強(qiáng)，使受控于該組織細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的外源性轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)提高。在非特異的組織細(xì)胞內(nèi)，外源性轉(zhuǎn)錄激活因子呈基線表達(dá)水平。當(dāng)此慢病毒載體感染對(duì)應(yīng)與其組織特異細(xì)胞并在Dox存在一定劑量下，受控于可調(diào)控啟動(dòng)子的外源性目的基因因雙重放大效應(yīng)而達(dá)到最高表達(dá)水平。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述載體的構(gòu)建方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述載體在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是腫瘤治療。


圖 1 是載體 TRELuc，VEcadrtTA 和 SindLuc-Al。圖2是熒光酶基因在四環(huán)素衍生藥物D0X(l/ml)調(diào)控下分別在血管特異性內(nèi)皮細(xì)胞和非特異性細(xì)胞中的表達(dá)水平。圖3是TRELuc,VEcadrtTA雙載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染和SindLuc-Al載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染人體宮頸癌Hela細(xì)胞72小時(shí)后的慢病毒滴度量與插入基因表達(dá)盒大小的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本實(shí)施例將以SEQ IDN0. 1所示的慢病毒表達(dá)載體為例來具體描述其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明的表達(dá)載體具有序列表SEQ ID No. 1所示的序列，其至少包括polyA60尾巴、逆式四環(huán)素反應(yīng)激活因子(rtTA2s-M2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性(VEcad)啟動(dòng)子，四環(huán)素調(diào)控性白蛋白融合(TRE/alb)啟動(dòng)子、熒光素酶基因(Iuciferase)。本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述表達(dá)載體的方法，其包括如下步驟1.以 pRRL. cPPT. PGK. eGFP. WPRE (Adogen 購買)為模版，用 BamHl-SaLl 酶切釋放 eGFP 片段，然后把含有 BamHl-Xhol-Xmal-Smal-Xbal-Mlul-Nhel-BglII-SaLl 多酶切位點(diǎn)的DNA片段通過BamHl-SaLl位點(diǎn)聯(lián)接到模版DNA載體，得到中間載體pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE ； 2.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 載體為模版，用 Xmal-Xbal 從 pG13_basic 載體(Invitrogen購買)酶切釋放熒光媒體基因片段后再通過Xmal-Xbal位點(diǎn)，聯(lián)結(jié)到pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE，得到中間載體 pRRL. cPPT. PGK. Luc. WPRE ；3.以 pRRL. cPPT. PGK. linker. WPRE 為模版，同過Xhol 酶切釋放出 PGKDNA片段，得到中間載體 pRRL. cPPT. linker. WPRE ；4.通過 Nhel-BamHl 酶切載體 pmVEcad-rtTA(Invitrogen 購買)，釋放出 mVEcad-rtTA片段，然后通過Nhel-BglII位點(diǎn)，聯(lián)結(jié)到pRRL. cPPT. linker. WPRE得到慢病毒載體 pRRLcPPT.mVEcad-rtTA. WIRE(VEcadrtTA)(圖 1)；5.通過 Xhol-Xbal 酶切點(diǎn)，從載體 pTREalb-Luc (Invitrogen 購買)釋放 TREalb-Luc 片段；聯(lián)接到 pRRL. cPPT. linker. WPRE，得到載體 pRRL. cPPT. TREalb-Luc (TRELuc)(圖 1)；6. mVEcad-rtTA-S60PA 基因表達(dá)盒從載體 pmVEcad-rtTA-S60PA (Invitrogen 購買)通過Xhol-Accl酶切位點(diǎn)釋放后再通過Xhol-ClaI聯(lián)接到TRELuc載體，得到pRRL. cPPT. S60PA-rtTA-mVEcad-TREalb-Luc (SindLuc-Al)(圖 1)慢病毒可控性載體。慢病毒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞與熒光酶基因表達(dá)水平測(cè)試人體微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humvec)，人體臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humvec)，人體臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)，！fep3B細(xì)胞和人體宮頸癌細(xì)胞(Hela)分別置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔用300微升DMEM含10%牛血清的培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞在每孔中達(dá)到50-60%克隆率后，用慢病毒載體SindLuc-Al和TRELuc,VEcadrtTA雙載體分別轉(zhuǎn)染人體微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humvec)， 人體臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)，！fep3B細(xì)胞和人體宮頸癌細(xì)胞(Hela)，感染復(fù)數(shù)(MOI) 為5次。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，每孔內(nèi)細(xì)胞用PBS清洗以去除病毒RNA，然后再加上述培養(yǎng)液繼續(xù)擴(kuò)增生長。至72小時(shí)，每孔內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞再次由PBS液清洗兩次后加Passive Lysis Buffer (Promega購買)溶碎，各孔內(nèi)細(xì)胞提取物被系列稀釋后每20微升用100微升熒光酶基因表達(dá)測(cè)試劑Luciferase Assay Reagent (Promega購買)混合，熒光酶基因表達(dá)水平由光度計(jì)測(cè)試。慢病毒滴度量測(cè)試慢病毒滴度的定量通過測(cè)試慢病毒感染顆粒量。分別被SindLuc-Al和TRELuc， VEcadrtTA雙載體轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞被置于24-孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液中每毫升含8微克的聚凝胺(Sigma購買)。72小時(shí)后，被各載體轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的全細(xì)胞基因組DNA用微小DNA血測(cè)試劑盒DNA Blood Mini Kit 50(Qiagen購買)提取.慢病毒顆粒滴度量用 (TU/mL)表示并通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR來作定量分析。探針的5’用波長為518nm 的報(bào)告染色分子FAM標(biāo)記，3’用波長為582nm的報(bào)告染色分子TAMRA標(biāo)記，在PCR過程中探針的3’又被磷酸化。用于PCR作慢病毒滴度測(cè)試的引物和探針分別為正向引物 5，-CCGTTTCAGGCAACGTG-3，；反向引物5，-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3，；探針5，F(xiàn)AM-CCAGC CATGTACGTTGCTATCCAGGC-TAMRA-3 ‘ . PCR 的測(cè)試用 PCR Master Mix (Promega 購買)。結(jié)果組織特異性可調(diào)性慢病毒載體SindLuc-Al在轉(zhuǎn)染具血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性人體微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humvec)，人體臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(Huvec)和非血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性 Hep3B細(xì)胞和人體宮頸癌細(xì)胞(Hela) 72小時(shí)后，在無Dox存在下，熒光酶基因在Humvec， Huvec, Hep3B和Hela細(xì)胞中基因表達(dá)水平與用慢病毒載體TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染的同種細(xì)胞中的表達(dá)水平無顯著差別并呈基線水平表達(dá)(圖2)。在Dox以每毫升1 微克存在的情況下同Dox不存在的條件下相比，熒光酶基因在SindLuc-Al轉(zhuǎn)染的Humvec 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與用雙載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平都有顯著提高(圖2)，且呈現(xiàn)藥物 Dox的可調(diào)控性。其中，在SindLuc-Al轉(zhuǎn)染的Humvec細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平雖低于用雙載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，而在SindLuc-Al轉(zhuǎn)染的Huvec細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平卻顯著高于用雙載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平(圖2)。在非血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性H印3B和Hela細(xì)胞內(nèi)，用 SindLuc-A 1載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染和TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染后，Dox的存在于否對(duì)熒光酶基因表達(dá)水平幾乎無影響(圖2)。在用慢病毒載體SindLuc-Al和TRELuc，VEcadrtTA 雙載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后測(cè)試出的SindLuc-Al病毒滴度比TRELuc 和VEcadrtTA的滴度要低。由此可見，慢病毒載體SindLuc-Al不但呈現(xiàn)顯著組織特異性和藥物可調(diào)控性而且在不需增加病毒滴度的前提下能達(dá)到TRELuc，VEcadrtTA雙載體聯(lián)合轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)水平(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種慢病毒基因表達(dá)載體，其特征在于從5’ -3’方向至少包括以下元件i.PolyA尾巴序列；ii.轉(zhuǎn)錄激活因子編碼序列；iii.對(duì)應(yīng)于組織特異性啟動(dòng)子序列；iv.對(duì)應(yīng)于藥物和轉(zhuǎn)錄激活因子的可調(diào)控性啟動(dòng)子；v.包括編碼至少一種目的外源基因序列。
2.權(quán)利要求1所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征是元件i是S60PolyA尾巴。
3.權(quán)利要求1所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征是元件ii是逆式四環(huán)素反應(yīng)激活因子 rtTA2s-M2。
4.權(quán)利要求1所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征是元件iii是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子VEcad。
5.權(quán)利要求1所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征是元件vi是四環(huán)素調(diào)控性白蛋白融合啟動(dòng)子TRE/alb。
6.權(quán)利要求1所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征是元件ν是熒光素酶基因 Iuciferase0
7.權(quán)利要求1-6所述的慢病毒基因表達(dá)載體中的任何一項(xiàng)，其特征是元件ν是選自一種或者多種治療性基因，一種或多種報(bào)告基因。
8.權(quán)利要求7所述的慢病毒基因表達(dá)載體，其特征在于所述外源目的基因在功能與表達(dá)上受啟動(dòng)子iii影響。
9.權(quán)利要求1中所述的慢病毒基因表達(dá)載體在將遺傳序列物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法中的用途。
10.權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9所述的用途，其中所述細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種慢病毒載體。具有組織特異性兼?zhèn)淇烧{(diào)控性雙基因表達(dá)。其特征在于具有沿著5’至3’方向至少包括下列元件polyA60尾巴、逆式四環(huán)素反應(yīng)激活因子(rtTA2s-M2)、血管內(nèi)皮鈣啟動(dòng)子(VEcad)，四環(huán)素調(diào)控性白蛋白融合啟動(dòng)子(TRE/alb)、熒光素酶基因(luciferase)。本發(fā)明構(gòu)建的載體的雙基因表達(dá)盒采用反式表達(dá)的方式，最大限度減少了外源性核苷酸序列片段，使其可插入有容量限制的慢病毒載體，并對(duì)插入的熒光素酶基因不作限定，可以自由選擇外源性目的基因與可調(diào)控性啟動(dòng)子搭配，該載體表達(dá)盒在不需要提高慢病毒量滴度轉(zhuǎn)染細(xì)胞的同時(shí)既能保持外源性目的基因可控性表達(dá)且顯著提高外源基因的表達(dá)效率。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102154368SQ201010110290
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者張文煒, 楊光華, 王 華 申請(qǐng)人:上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司