專利名稱：豬細小病毒l株及在制備豬細小病毒病滅活疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新分離的病毒毒株，尤其涉及一株豬細小病毒毒L株，本發(fā)明還 涉及病毒L株在制備豬細小病毒病滅活疫苗中的用途，屬于豬細小病毒病的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細小病毒(PPV)可引起豬的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為胎兒和胚胎的感染和死亡， 而母體通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。血清學(xué)陰性母豬主要在妊娠的前半期經(jīng)口鼻感染病毒，結(jié) 果免疫機能不全的胎兒經(jīng)胎盤受到感染，從而導(dǎo)致發(fā)病。經(jīng)檢查得知在世界各地的豬群中， 該病毒是普遍存在的，在大多數(shù)豬場呈地方性流行。此病流行很廣，在歐、美、亞及大洋洲很 多國家均有報道。我國的各省市相繼分離到豬細小病毒，血清陽性率很高。本病對養(yǎng)豬業(yè) 的危害極大。由于PPV目前尚無有效的藥物治療方法，因此，該病的預(yù)防免疫就顯得更為重 要。近年來，公認使用疫苗是預(yù)防PPV、提高母豬繁殖率的唯一方法。到目前為止，世界 上已有美國、澳大利亞、日本、丹麥、西班牙、捷克、德國、原蘇聯(lián)和中國等10多個國家報告 研制了 PPV疫苗，其中除美國和日本有3個弱毒疫苗外，其余均為滅活疫苗，并都已成為商 品化生產(chǎn)苗，常用的滅活劑有AEI、BEI、甲醛溶液和丙內(nèi)酯。美國的Mengeling(1979) 還報告生產(chǎn)應(yīng)用了一種PPV和豬偽狂犬(PrV) 二聯(lián)苗，效果較好。中國均普遍使用PPV滅活疫苗，使用的主要滅活劑有福爾馬林、B2丙內(nèi)酯 (B2PL)、N-乙酰乙烯亞胺(AEI)、二乙烯亞胺(BEI)等。有試驗結(jié)果表明，PPV用福爾馬林滅 活后做成的疫苗的保護效果不如用二乙烯亞胺滅活后做成的疫苗的保護效果好；用B-丙 內(nèi)酯滅活的疫苗的保護力較好(潘雪珠等，1992)。免疫佐劑也是影響PPV滅活疫苗免疫效 果的重要因素。有試驗結(jié)果表明，50%的氫氧化鋁、順丁烯乙酰(EMA)、油水乳劑、DDA分別 作為佐劑的疫苗，均誘導(dǎo)豬產(chǎn)生高滴度的抗體。但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、氫氧 化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低 (Mo lito r等，1985)。目前國內(nèi)有兩種豬細小病毒滅活疫苗供預(yù)防本病。一種是豬細小病 毒滅活氫氧化鋁疫苗，另一種是豬細小病毒滅活油佐劑苗。對于豬細小病毒應(yīng)用二乙烯亞 胺滅活，并加入油佐劑配制而成雙向油乳劑滅活苗，還未報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一株新分離的豬細小病毒毒株；本發(fā)明的目的之二是將上述豬細小病毒毒株用于制備豬細小病毒病雙向油乳劑 滅活疫苗；本發(fā)明目的之三是提供一種制備上述豬細小病毒病雙向油乳劑滅活疫苗的方 法；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一株新分離的豬細小病毒(PPV) L株，其微生物保藏號是CGMCC No. 3352 ；分類命名是豬細小病毒；保藏時間是2009年10月23日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微 生物研究所。本發(fā)明豬細小病毒(PPV)L株的分離方法，包括無菌采集取母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結(jié)、腎、腦等組織。以1 10加入滅菌生 理鹽水，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，2000r/min離心15min，收集上清液，再經(jīng) 0. 2ul濾膜濾器過濾，將濾出液置-30°C冰箱凍結(jié)保存。取分離的毒株接種ST傳代細胞上， 在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)，每天對細胞病變效應(yīng)(CPE)進行觀察。形態(tài)結(jié)果顯示細胞固縮， 突立聚集，顆粒增多，有的細胞融合，細胞脫落，出現(xiàn)空斑。本發(fā)明豬細小病毒L株電鏡負染觀察結(jié)果可觀察到外觀呈六角形或圓形，無囊 膜的病毒粒子，直徑約為20nm。本發(fā)明豬細小病毒L株免疫熒光法檢查結(jié)果標本感染ST傳代細胞，細胞有病變， 在細胞核細胞質(zhì)中，可見呈蘋果綠色的特異性熒光，陰性對照無特異性熒光出現(xiàn)。病毒血凝活性檢測收獲含毒細胞培養(yǎng)液能凝集豚鼠紅細胞，具有較高的血凝活 性，而且隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，病毒對細胞的適應(yīng)性增強，病毒血凝價有提高。本發(fā)明豬細小病毒L株的測序結(jié)果對PPV VP2進行測序，測序結(jié)果見附圖4，利 用DNA MAN軟件對L株VP2基因片段進行序列分析，L株和其它幾株P(guān)PV VP2的進化樹分 析，見附表1及附圖5。表明L株與NADL-2株和China株的遺傳距離最近。將上述豬細小病毒毒株滅活，加入佐劑，就可得到豬細小病毒病滅活疫苗；優(yōu)選的，一種利用本發(fā)明細小病毒毒株制備豬細小病毒病雙向油乳劑滅活疫苗的 方法，包括培養(yǎng)所述的豬細小病毒L株，得到豬細小病毒抗原液；將豬細小病毒抗原液滅 活；濃縮；分別配制油相和水相，將水相和油相混合在一起后乳化，即得。二乙烯亞胺的濃度及作用時間對滅活苗的效果有非常顯著的影響，鑒次，本發(fā)明 選用二乙烯亞胺作為滅活劑，對滅活劑的使用劑量、作用時間、滅活效果等進行一系列試 驗，以優(yōu)化二乙烯亞胺滅活豬細小病毒程序。最終發(fā)現(xiàn)以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液 滅活豬細小病毒效果為好；當以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液在30°C，lOOr/min，氣浴 振蕩的條件下，72h滅活豬細小病毒的效果為最佳。其中，所述油相可參考下述方法制備得到注射用白油94份、司本-806份和硬脂 酸鋁1. 5份混合在一起，配制得到油相；所述水相可參考下述方法制備得到96ml滅活后的豬細小病毒抗原液中加入4ml 吐溫-80，加入硫柳汞至終濃度為0. 01wt% ；配制得到水相；優(yōu)選的，將所述水相和油相按照4 1. 5比例混合在一起進行乳化。本發(fā)明滅活疫苗免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期 可達6個月以上。超劑量接種10ml/頭，單劑量3次重復(fù)接種后，均未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)， 說明本發(fā)明所制備的滅活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。


圖1細胞病變效應(yīng)(CPE)結(jié)果。圖2病毒的電鏡檢查結(jié)果。
圖3免疫熒光法檢查結(jié)果。圖4本發(fā)明豬細小病毒毒株滅活疫苗的工藝流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1豬細小病毒L 株的分離、培養(yǎng)、鑒定一、選育方法1.病料采集無菌采集取母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結(jié)、腎、腦等組織。以1 10 加入滅菌生理鹽水，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，2000r/min離心15min，收集上 清液，再經(jīng)0. 2ul濾膜濾器過濾，將濾出液置-30°C冰箱凍結(jié)保存。2.分離培養(yǎng)將上述病料按病毒培養(yǎng)液的10%含量接入尚未形成單層的細胞培 養(yǎng)物中，37°C感作lh，換加含2%讀牛血清的MEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)5日。第二代培養(yǎng)78h， 收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收毒。連續(xù)傳代5代。3.基礎(chǔ)種子批建立取原始毒種，按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的 ST細胞培養(yǎng)物中，置37°C培養(yǎng)，當病變達到70%時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收 毒。連續(xù)傳代6代。4.生產(chǎn)種子批建立取基礎(chǔ)種子，按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的 ST細胞培養(yǎng)物中，置37°C培養(yǎng)，當病變達到70%時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收 毒。連續(xù)傳代11代。最終獲得一株具有希望特性的所需豬細小病毒毒株，并命名為并命名為豬細小病 毒L株；取分離的毒株接種ST傳代細胞上，在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)，每天對細胞病變效應(yīng) (CPE)進行觀察。結(jié)果顯示細胞固縮，突立聚集，顆粒增多，有的細胞融合，細胞脫落，出現(xiàn) 空斑。病變見圖1。二、電鏡負染觀察經(jīng)培養(yǎng)5-7d后，病變細胞上清蔗糖梯度超速離心，分離病毒顆粒進行電鏡負染觀察。結(jié)果顯示可觀察到外觀呈六角形或圓形，無囊膜的病毒粒子，直徑約為20nm。見 圖2三、免疫熒光法檢查取分離的毒株接種ST傳代細胞上，在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)47h，當CPE達70%時， 傳第二代，選用第二代培養(yǎng)物經(jīng)3次凍融后，做熒光抗體檢查。取已培養(yǎng)24h的ST細胞蓋 玻片培養(yǎng)物，接種病毒，再經(jīng)24h培養(yǎng)。取出蓋玻片，用PBS沖洗，經(jīng)丙酮固定，再用豬細小 病毒熒光抗體濕盒內(nèi)染色30min，沖洗，封固，鏡檢。結(jié)果顯示標本感染ST傳代細胞，細胞有病變，在細胞核細胞質(zhì)中，可見呈蘋果綠 色的特異性熒光，陰性對照無特異性熒光出現(xiàn)。見圖3。
(4)病毒血凝活性檢測取96孔微量反應(yīng)板(U型)，用pH 7. 2的PBS將含毒細胞培養(yǎng)液做2倍連續(xù)稀釋， 加入含4HAU豬細小病毒血凝素液，并設(shè)PBS和病毒對照，充分振蕩后，置4°C，18h，再加入 0.6%豚鼠紅細胞懸液，置室溫lh，當對照孔中的紅細胞呈顯著鈕扣狀時判定結(jié)果。結(jié)果顯示收獲含毒細胞培養(yǎng)液能凝集豚鼠紅細胞，具有較高的血凝活性，而且隨 著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，病毒對細胞的適應(yīng)性增強，病毒血凝價有提高。見表1 (5)病毒的測序檢測根據(jù)豬細小病毒NADL-2株的全基因序列自行設(shè)計一對引物，用于擴增VP2基因 片段(2808bp-4407bp)。上游引物為 Pl:5' CAATGAGTGAAAATGTGGAA 3'，下游引物為 P2: 5' TTTGCTGTGAATGTTAGTGT 3'。對PPV提取DNA，并對VP2基因片段進行PCR擴增，測序。結(jié)果顯示利用DNA MAN軟件對L株VP2基因片段進行序列分析，測序結(jié)果得到了 與預(yù)期結(jié)果相符的1600bp的基因片段，其中包括PPV VP1基因的2個核苷酸和VP2基因的 1598個核苷酸。測序結(jié)果見SEQ ID N0:1。PPV L株VP2基因片段與其它PPV毒株的同源性比較結(jié)果見表2。表2 PPV L株VP2基因片段與其它PPV毒株的同源性比較 本發(fā)明病毒L株和其它幾株P(guān)PV VP2的進化樹分析，表明L株與NADL-2株和China 株的遺傳距離最近。實施例2豬細小病毒病滅活苗的制備1.制苗用病毒液的制備生產(chǎn)種子毒種按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的ST細胞培養(yǎng)物中，置37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，當病變達到70%時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次 凍融后，收毒。2.滅活按病毒液總量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亞胺溶液，充分振蕩后， 于30°C、100r/min搖床上滅活72h，然后加入1 %硫代硫酸鈉溶液，終止滅活。并作無菌檢驗。3.濃縮取滅活后的病毒液，經(jīng)13000r/min連續(xù)離心，然后以0. 2um濾膜濾器過 濾。微濾后的病毒液以50KD濾膜濾器超濾濃縮5倍。4.油佐劑滅活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁1. 5份 的比例配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐溫-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水相； 水相和油相按照4 1. 5比例進行乳化，制成油包水單相苗。試驗例1本發(fā)明豬細小病毒毒株滅活疫苗的工藝優(yōu)化試驗選用二乙烯亞胺作為滅活劑，對滅活劑的使用劑量、作用時間、滅活效果等進行一 系列試驗，以優(yōu)化二乙烯亞胺滅活豬細小病毒程序。(1) 二乙烯亞胺使用劑量及濃度確定設(shè)定1%,0. 2%,0. 05%,0. 02%等濃度的二乙烯亞胺，在30°C，100r/min，氣浴振 蕩的條件下，滅活48h，滅活后做滅活病毒液細胞培養(yǎng)物感染性病毒檢查及小白鼠感染試 驗。確定以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液滅活豬細小病毒效果最佳。(2) 二乙烯亞胺作用時間確定0.02%二乙烯亞胺，在301，10017/1^11，氣浴振蕩的條件下，分別做7、10、15、24、 48、60、72、80h等不同時間的滅活，滅活后做滅活病毒液細胞培養(yǎng)物感染性病毒檢查及小白 鼠感染試驗。確定以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液在30°C，lOOr/min，氣浴振蕩的條件 下，做72h滅活豬細小病毒效果最佳。(3) 二乙烯亞胺毒性試驗設(shè)定1%、0. 2%、0. 02%等濃度的二乙烯亞胺溶液，注射18_22g小白鼠，觀察10d， 記錄死亡數(shù)和存活數(shù)。確定0. 2% 二乙烯亞胺注射0. 2ml及0. 02% 二乙烯亞胺0. 4ml為安 全劑量。試驗例2本發(fā)明豬細小病毒病滅活苗的免疫效果試驗按照實施例2的制備方法連續(xù)生產(chǎn)3批疫苗，對10276頭豬(多數(shù)為初產(chǎn)母豬) 進行了疫苗接種實驗。以免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期 可達6個月以上，說明該疫苗具有良好的免疫原性。以使用劑量接種2ml/頭，超劑量接種10ml/頭，未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)。取試制的 疫苗接種后備母豬、妊娠豬未見免疫對生殖功能有任何影響，配種、妊娠、產(chǎn)仔均正常。證明 疫苗安全性良好。
權(quán)利要求
一株分離的豬細小病毒L株，其微生物保藏號是CGMCC No.3352。
2.權(quán)利要求1所述的豬細小病毒L株在制備預(yù)防或治療細小病毒病疫苗中的用途。
3.一種預(yù)防或治療細小病毒病滅活疫苗，含有有效量的權(quán)利要求1所述的豬細小病毒 L株的抗原液和佐劑。
4.一種制備權(quán)利要求1所述豬細小病滅活疫苗的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的 豬細小病毒L株，得到豬細小病毒抗原液；將豬細小病毒抗原液滅活；濃縮；分別配制油相 和水相，將水相和油相混合在一起后乳化，即得。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用二乙烯亞胺滅活豬細小病毒抗原液。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于以終末濃度0.02wt%二乙烯亞胺溶液滅 活豬細小病毒抗原液。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于以終末濃度0.02wt%二乙烯亞胺溶液在 30°C，lOOr/min，氣浴振蕩的條件下，滅活豬細小病毒抗原液72h。
8.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述油相按照下述方法制備得到注射用 白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁1.5份混合在一起，配制得到油相；所述水相按照下述 方法制備得到96ml滅活后的豬細小病毒抗原液中加入4ml吐溫_80，加入硫柳汞至終濃度 為0.01wt% ；配制得到水相。
9.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將所述水相和油相按照4 1.5的體積 比例混合在一起后進行乳化。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬細小病毒L株及在制備豬細小病毒病滅活疫苗中的用途。本發(fā)明所分離毒株的微生物保藏號是CGMCC No.3352。該毒株與NADL-2株及China株具有極高的同源性、保持高的繁殖力，病毒穩(wěn)定。應(yīng)用二乙烯亞胺滅活該病毒的抗原液，加入油佐劑制得雙向油乳劑滅活苗；用所制備的滅活疫苗對10276頭豬(多數(shù)為初產(chǎn)母豬)進行了疫苗接種實驗，免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期可達6個月以上。超劑量接種10ml/頭，單劑量3次重復(fù)接種后，均未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)，說明本發(fā)明滅活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
文檔編號A61K39/23GK101851609SQ201010110218
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者任德強, 吳金, 崔艷麗, 張智明, 張立恒, 戴秀莉, 楊萬秋, 柴華, 潘興廣, 胡瑛瑛, 藏玉婷 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司