本發(fā)明涉及對(duì)生物合成方法的改進(jìn)，具體涉及改造人工“兩步法”萜類(lèi)生產(chǎn)途徑及利用大腸桿菌高產(chǎn)drimane型萜類(lèi)化合物。

背景技術(shù)：

1、萜類(lèi)化合物是部分來(lái)源于萜類(lèi)途徑的混合天然產(chǎn)物，主要存在于真菌、海洋生物和高等植物中，在細(xì)菌中的報(bào)道較少。其中，drimane-type?merosesquiterpenoids(dmts)因其結(jié)構(gòu)多樣性和顯著的生物特性而備受關(guān)注。迄今為止，已從天然資源中鑒定出500多種具有不同結(jié)構(gòu)和強(qiáng)效生物活性的dmts。dmts結(jié)構(gòu)的多樣性賦予了它們廣泛的生物活性。例如，具有drimane骨架的一系列代謝產(chǎn)物pyripyropenes?a-r，具有膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(acat)抑制活性。同時(shí)drimane型天然產(chǎn)物如水蓼二醛具有很好的抗真菌、抗病毒等活性，目前已經(jīng)作為抗菌增強(qiáng)劑廣泛應(yīng)用。

2、目前常用于合成dmts的傳統(tǒng)手性原料(如香紫蘇內(nèi)酯和香紫蘇醇)面臨著很大挑戰(zhàn)，如合成路線復(fù)雜，產(chǎn)物收率較低以及降碳帶來(lái)的原子不經(jīng)濟(jì)性。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，研究人員不斷探索并發(fā)現(xiàn)了其他手性構(gòu)建模塊，如drimane型化合物drimenol和albicanol，它們作為dmt合成中的直接drimane核心具有更高的原子經(jīng)濟(jì)性。

3、因此，提高drimenol和albicanol的產(chǎn)量，通過(guò)廉價(jià)的生產(chǎn)獲得大量化合物對(duì)后續(xù)其功能產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要推動(dòng)作用。目前生產(chǎn)的drimenol和albicanol的方法有化學(xué)合成法，但是步驟繁瑣，并且環(huán)境不友好。之前有研究通過(guò)異源表達(dá)獲得drimenol和albicanol，如在煙葉中表達(dá)植物來(lái)源drimenol合酶phds，獲得392μg/g鮮重產(chǎn)量，選擇釀酒酵母作為底盤(pán)異源表達(dá)albicanol合酶ancc，4l發(fā)酵培養(yǎng)基96h只獲得了8.3mg產(chǎn)物。萜類(lèi)化合物生物合成途徑有經(jīng)典的mva途徑和mep途徑，近十年來(lái)，隨著生物合成技術(shù)的發(fā)展，利用人工“兩步法”合成萜類(lèi)化合物逐漸受到人們的關(guān)注，“兩步法”途徑反應(yīng)體系外源加入商業(yè)化的五碳醇化合物，經(jīng)過(guò)兩步磷酸化反應(yīng)，即可生成萜類(lèi)生物合成前體化合物異戊烯基焦磷酸dmapp和ipp，相較于經(jīng)典途徑的優(yōu)勢(shì)在于：參與的酶少，反應(yīng)過(guò)程好調(diào)控，更具工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用前景。同時(shí)，對(duì)于本研究選用的兩步法途徑的第一步酸性磷酸酶phon，作為一個(gè)催化可逆反應(yīng)的磷酸酶，已有相關(guān)研究對(duì)其催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其磷酸化反應(yīng)的km值遠(yuǎn)大于水解反應(yīng)。

4、基于現(xiàn)有“兩步法”途徑發(fā)酵生成drimenol產(chǎn)量較低，只有15mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的水平。

5、關(guān)于近年來(lái)優(yōu)化“兩步法”發(fā)酵生產(chǎn)萜類(lèi)化合物的研究中，大多數(shù)集中在嘗試替換不同來(lái)源的磷酸酶，比較產(chǎn)量最佳的磷酸酶，以及發(fā)酵條件的優(yōu)化。目前還沒(méi)有對(duì)兩步法途徑中的磷酸酶進(jìn)行改造提高產(chǎn)量的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于首先解決了“兩步法”生產(chǎn)drimenol體系中內(nèi)源性水解酶催化效果不佳的問(wèn)題，通過(guò)引入鏈霉菌來(lái)源的水解酶ssndh，并構(gòu)建融合表達(dá)體系，通過(guò)比較不同長(zhǎng)度的linker對(duì)產(chǎn)量的影響，選擇最佳linker長(zhǎng)度的融合體系，用于提高大腸桿菌體內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)量。

2、同時(shí)，為提高“兩步法”途徑第一步磷酸酶phon的磷酸化效率，設(shè)計(jì)基于電荷突變的改造和保守性進(jìn)化的實(shí)驗(yàn)思路，篩選高產(chǎn)突變株，提高磷酸化反應(yīng)效率，從本質(zhì)上為“兩步法”高產(chǎn)萜類(lèi)化合物提供改造思路。

3、完成改造后的高產(chǎn)體系通過(guò)替換drimenol合酶ssdms為albicanol合酶ancc，將高產(chǎn)體系遷移至生產(chǎn)albicanol，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件并進(jìn)行發(fā)酵罐生產(chǎn)，以獲得大量生產(chǎn)albicanol。

4、技術(shù)方案：本發(fā)明所述的改性酸性磷酸酶phon，來(lái)源于shigella?flexneri的酸性磷酸酶phon的第122位氨基酸由谷氨酸轉(zhuǎn)變成精氨酸，第157蘇氨酸轉(zhuǎn)變成賴(lài)氨酸，第160位精氨酸轉(zhuǎn)變成賴(lài)氨酸，氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

5、所述的改性酸性磷酸酶phon，核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

6、所述的改性酸性磷酸酶phon在生物合成萜類(lèi)化合物中的應(yīng)用。所述的改性酸性磷酸酶phon在高產(chǎn)萜類(lèi)化合物中的應(yīng)用。所述的改性酸性磷酸酶phon在高產(chǎn)倍半萜類(lèi)化合物中的應(yīng)用。

7、一種融合水解酶，融合了來(lái)源于焦土鏈霉菌(streptomyces?showdoensis)的ssndh蛋白和drimenol合酶ssdms，氨基酸序列如seq?id?no：3、5、7、9所示。

8、所述的融合水解酶，核苷酸序列如seq?id?no：4、6、8、10所示。

9、一種drimane型萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：(1)原料dmaa和iso在酸性磷酸酶phon和磷酸激酶ipk的作用下生成dmapp和ipp；(2)此外還加入了異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(idi)，以促進(jìn)dmapp和ipp之間的相互轉(zhuǎn)化；(3)在fpp合成酶ispa的作用下形成法尼基二磷酸(fpp)；(4)在drimenol合成酶ssdms、水解酶的作用下生成drimenol；或者在albicanol合成酶ancc的作用下生成albicanol。

10、

11、所述的生產(chǎn)方法，步驟(1)所述酸性磷酸酶phon為shigella?flexneri來(lái)源的磷酸酶phon或所述改性酸性磷酸酶phon。

12、所述的生產(chǎn)方法，步驟(4)中所述水解酶為大腸桿菌內(nèi)源性的水解酶或外源性水解酶ssndh。

13、所述的生產(chǎn)方法，步驟(4)中所述drimenol合成酶ssdms、水解酶或可替換成所述的融合水解酶。

14、一種高效生產(chǎn)drimane型萜化合物的大腸桿菌，含有導(dǎo)入ipk(核苷酸序列如seqid?no：11所示)、ispa(核苷酸序列如seq?id?no：12所示)、idi(核苷酸序列如seq?id?no：13所示)、所述改性酸性磷酸酶phon、ancc(核苷酸序列如seq?id?no：14所示)表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞；或者含有導(dǎo)入ipk(核苷酸序列如seq?id?no：11所示)、ispa(核苷酸序列如seqid?no：12所示)、idi(核苷酸序列如seq?id?no：13所示)、所述改性酸性磷酸酶phon、所述融合水解酶的表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞。

15、1、本發(fā)明首次將鏈霉菌來(lái)源的水解酶與drimenol合酶進(jìn)行融合表達(dá)，使產(chǎn)量從15mg/l提高到110mg/l，提高了7.3倍。

16、2、本發(fā)明首次通過(guò)理性設(shè)計(jì)及電荷和保守性改造“兩步法”途徑phon，產(chǎn)量從110mg/l提高到398.4mg/l，磷酸化效率提高3.6倍，總產(chǎn)量提高27倍。

17、3、本發(fā)明構(gòu)建的高產(chǎn)體系成功遷移至生產(chǎn)albicanol，并通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵罐生產(chǎn)，獲得了3.5g/l的產(chǎn)量。

18、有益效果：本發(fā)明首次將水解酶與drimenol合酶融合表達(dá)，使產(chǎn)量提高了7.3倍。并結(jié)合理性設(shè)計(jì)改造兩步法途徑phon，使其磷酸化效率進(jìn)一步提高3.6倍，使drimenol產(chǎn)量提高27倍，從15mg/l提高到398.4mg/l，并將高產(chǎn)體系成功遷移至生產(chǎn)albicanol，獲得了3.5g/l的產(chǎn)量。