本發(fā)明涉及一種塔格糖的制備方法，尤其涉及一種體外多酶催化將淀粉或纖維素及其衍生物轉(zhuǎn)化為塔格糖的方法，屬于塔格糖的酶催化制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：：塔格糖(D-Tagatose)是天然存在的一種稀有單糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向異構(gòu)體。甜味特性與蔗糖相似，而產(chǎn)生的熱量只為蔗糖的三分之一，所以被稱之為低熱量甜味劑。塔格糖具有低熱量值、零血糖生成指數(shù)、血糖鈍化作用、無(wú)齲齒性、益生元作用和抗氧化活性等優(yōu)良營(yíng)養(yǎng)特性。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善腸道菌群和抗齲齒(OhD-K:Tagatose:properties,applications,andbiotechnologicalprocesses.App.Microbiol.Biotechnol.2007,76:1-8)。生產(chǎn)塔格糖的方法有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法兩種。一般都以半乳糖為原料，通過(guò)化學(xué)方法或生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)而成。半乳糖原料可由乳糖水解得到，也有研究使用半乳糖醇為原料，經(jīng)生物氧化為塔格糖。但半乳糖醇價(jià)格較高，目前暫不適宜用作工業(yè)化生產(chǎn)原料。化學(xué)合成法是利用可溶性堿金屬鹽或堿土金屬鹽為催化劑，促使D-半乳糖在堿性條件下生成塔格糖，并形成金屬氫氧化物-塔格糖復(fù)合物，再用酸中和獲得D-塔格糖。生物轉(zhuǎn)化法包括將半乳糖醇氧化成塔格糖，和利用微生物所產(chǎn)生的異構(gòu)酶將半乳糖異構(gòu)成塔格糖兩種方法。因化學(xué)法能耗高，產(chǎn)物復(fù)雜，純化困難，副反應(yīng)多，產(chǎn)生化學(xué)污染，故生物轉(zhuǎn)化法具有較好的應(yīng)用前景。目前研究較多的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為塔格糖，然而半乳糖的較高價(jià)格影響了塔格糖的最終價(jià)格，導(dǎo)致無(wú)法廣泛的使用(RhimiM,AghajariN,JuyM,ChouayekhH,MaguinE,HaserR,BejarS:RationaldesignofBacillusstearothermophilusUS100l-arabinoseisomerase:Potentialapplicationsford-tagatoseproduction.Biochim.2009,91:650-653.OhH-J,KimH-J,OhD-K:Increaseind-tagatoseProductionRatebySite-directedMutagenesisofl-arabinoseIsomerasefromGeobacillusthermodenitrificans.Biotechnol.Lett.2006,28:145-149.BosshartA,HeeCS,BechtoldM,SchirmerT,PankeS:DirectedDivergentEvolutionofaThermostableD-TagatoseEpimerasetowardsImprovedActivityforTwoHexoseSubstrates.ChemBioChem2015,16:592-601.MenY,ZhuY,ZhangL,KangZ,IzumoriK,SunY,MaY:EnzymaticconversionofD-galactosetoD-tagatose:Cloning,overexpressionandcharacterizationofl-arabinoseisomerasefromPediococcuspentosaceusPC-5.Microbiol.Res.2014,169:171-178.)。韓國(guó)科學(xué)家發(fā)明一種多酶催化的方法將果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖，包括利用6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶將果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖(OhDK,HONGSH,LeeSH:Aldolase,aldolasemutantsandtagatoseusingthesameproductionmethodsandcompositionsforproduction.WO2015016544A1.GooglePatents；2015.)，但是從果糖生產(chǎn)6-磷酸果糖需要ATP對(duì)果糖進(jìn)行底物磷酸化，導(dǎo)致塔格糖生產(chǎn)成本高，不適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，亟待開(kāi)發(fā)一種低成本，低污染，高產(chǎn)率的適合規(guī)?；a(chǎn)塔格糖的新方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種塔格糖的制備方法，該方法通過(guò)體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物，或者蔗糖制備塔格糖，具有塔格糖的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)成本低，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：本發(fā)明首先公開(kāi)了一種淀粉塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入含有α-葡聚糖磷酸化酶(α-Glucanphosphorylase，EC2.4.1.1)、葡萄糖磷酸變位酶(Phosphoglucomutase，EC5.4.2.2)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶(Tagatose6-phosphate4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶催化反應(yīng)，即得。為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應(yīng)產(chǎn)物按照常規(guī)的方法進(jìn)行分離、純化。所述多酶反應(yīng)體系中，所述底物的濃度為1-500g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述底物的濃度為100g/L，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL。所述酶催化反應(yīng)的條件為：10-90℃反應(yīng)1-100小時(shí)；優(yōu)選為，37℃反應(yīng)24-40小時(shí)。本發(fā)明淀粉塔格糖的制備方法中，所述淀粉優(yōu)選為可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括：部分水解淀粉、淀粉糊精、麥芽糊精、麥芽多糖或麥芽糖中的任意一種或多種按照任意比例組成的混合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述多酶催化物中還包括(1)、(2)或(3)中任何一種：(1)淀粉去分支酶或麥芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC2.4.1.8)中的任何一種或兩種；(2)淀粉去分支酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)中的任何一種或兩種；(3)淀粉去分支酶、麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶中的任意一種或三種；優(yōu)選的，在多酶反應(yīng)體系中，所述淀粉去分支酶的用量為0.1-500U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為0.1-500U/mL；更優(yōu)選的，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為1U/mL；其中，所述淀粉去分支酶為異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)或普魯蘭酶(pullulanase，EC3.2.1.41)中的任意一種或兩種。進(jìn)一步優(yōu)選的，為了提高塔格糖的得率，將殘余的葡萄糖轉(zhuǎn)化為塔格糖，所述多酶催化物中還包括：聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，在多酶反應(yīng)體系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為0.1-500U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為1-100mM；更優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為1U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM。其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。反應(yīng)結(jié)束后，殘余的淀粉殘?jiān)鼘⑹羌兊闹辨湹矸?，此時(shí)可加入少量的α淀粉酶(EC3.2.1.1)促進(jìn)淀粉殘?jiān)乃猓M(jìn)一步提高塔格糖的產(chǎn)量。優(yōu)選的，在多酶反應(yīng)體系中，所述α淀粉酶的用量為0.01-100U/ml，更優(yōu)選為0.1U/ml。本發(fā)明所述多酶反應(yīng)體系中還包括：緩沖液、無(wú)機(jī)磷酸根和二價(jià)鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM，無(wú)機(jī)磷酸根2-100mM、二價(jià)鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH為5.0-9.0；優(yōu)選的，pH為7.0；更優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸鹽緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無(wú)機(jī)磷酸根)、二價(jià)鎂離子5mM。本發(fā)明以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應(yīng)體系，多酶催化途徑包括：由α-葡聚糖磷酸化酶將淀粉或淀粉衍生物中的一個(gè)葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸變位酶將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸異構(gòu)酶將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖和磷酸。由于由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶催化反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉(zhuǎn)化率，而高得率和高轉(zhuǎn)化率可以大大降低塔格糖的分離成本。由于淀粉是直鏈淀粉(20-30％)和支鏈淀粉(70-80％)的混合物。支鏈淀粉中的支鏈?zhǔn)且驭?1,6糖苷鍵與主鏈相連的，而α-葡聚糖磷酸化酶不能分解α-1,6糖苷鍵。為了提高塔格糖的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中加入能夠分解淀粉中α-1,6糖苷鍵的去分支酶—異淀粉酶或普魯蘭酶。由于α-葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最終產(chǎn)物是麥芽糖，為了利用麥芽糖，本發(fā)明進(jìn)一步在反應(yīng)體系中加入麥芽糖磷酸化酶，將麥芽糖分解為1-磷酸葡萄糖和葡萄糖；更優(yōu)選的，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中再進(jìn)一步加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，由6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉(zhuǎn)化為塔格糖，最終將淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為塔格糖，從而提高塔格糖的得率和轉(zhuǎn)化率。在這里，麥芽糖磷酸化酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶替換，該酶可以將短鏈的寡聚糖聚合成為長(zhǎng)鏈的寡聚糖，而該長(zhǎng)鏈的寡聚糖又可被α-葡聚糖磷酸化酶重新利用，從而能夠提高淀粉的利用率。本發(fā)明還公開(kāi)了另一種纖維素塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入含有纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶(cellodextrinphosphorylase，EC2.4.1.49)、纖維二糖磷酸化酶(cellobiosephosphorylase，EC2.4.1.20)、葡萄糖磷酸變位酶(EC5.4.2.2)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(PhosphoglucoseIsomerase，EC5.3.1.9)、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶(Tagatose6-phosphate4-epimerase)和6-磷酸塔格糖磷酸酶(Tagatose6-phosphatase)的多酶催化物建立多酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶催化反應(yīng)，即得。為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應(yīng)產(chǎn)物按照常規(guī)的方法進(jìn)行分離、純化。優(yōu)選為，先將纖維素或纖維素衍生物和纖維素酶在冰水浴上混合，4℃離心，去上清，得到纖維素酶和纖維素的混合物；然后在纖維素酶和纖維素的混合物中，再加入纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶建立多酶反應(yīng)體系。其中，纖維素或纖維素衍生物的用量為1-500g/L、纖維素酶的用量為1-500U/ml；優(yōu)選的，纖維素或纖維素衍生物的用量為100g/L，纖維素酶的用量為10U/ml。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。在所述多酶反應(yīng)體系中，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為1-500g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為100g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL。所述酶催化反應(yīng)的條件為：10-80℃反應(yīng)1-120小時(shí)；優(yōu)選為，37℃反應(yīng)48-96小時(shí)，最優(yōu)選為72小時(shí)。為了進(jìn)一步提高纖維素塔格糖的得率，所述多酶催化物中還包括：聚磷酸葡萄糖激酶(EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，在多酶反應(yīng)體系中，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為0.1-500U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為1-100mM；更優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。本發(fā)明所述多酶反應(yīng)體系中還包括：緩沖液、無(wú)機(jī)磷酸根和二價(jià)鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM、無(wú)機(jī)磷酸根2-100mM、二價(jià)鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸緩沖液；更優(yōu)選的，所述磷酸緩沖液的pH值為5.0-9.0，最優(yōu)選為7.2；進(jìn)一步優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無(wú)機(jī)磷酸根)、二價(jià)鎂離子5mM。本發(fā)明所述纖維素衍生物包括：纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的產(chǎn)物，纖維多糖或纖維二糖中的任意一種。所述預(yù)處理方法包括：酸水解法、酶水解法或物理法；優(yōu)選的，所述纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的產(chǎn)物為纖維素經(jīng)過(guò)濃磷酸處理后的產(chǎn)物(Zhang,Y.H.P.,etal.(2006)."ATransitionfromCelluloseSwellingtoCelluloseDissolutionbyo-PhosphoricAcid:EvidencefromEnzymaticHydrolysisandSupramolecularStructure."Biomacromolecules7(2):644-648.)。本發(fā)明以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應(yīng)體系，多酶催化途徑包括：由纖維素酶水解纖維素生成纖維多糖和纖維二糖；由纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶將纖維多糖或纖維二糖的一個(gè)葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸變位酶將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖；由葡萄糖磷酸異構(gòu)酶將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖；由6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖。本發(fā)明在上述多酶反應(yīng)體系中進(jìn)一步加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，將纖維素水解后的最終產(chǎn)物葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，再由葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉(zhuǎn)化為塔格糖，最終將纖維素及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為塔格糖。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種蔗糖塔格糖的制備方法，包括以下步驟：以蔗糖為底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的多酶催化物建立多酶催化反應(yīng)體系進(jìn)行酶催化反應(yīng)，即得。為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選的，將所得到酶催化反應(yīng)產(chǎn)物按照常規(guī)的方法進(jìn)行分離、純化。所述的多酶催化反應(yīng)體系中，所述蔗糖的濃度為10-300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為0.1-1000U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為0.1-1000U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為0.1-1000U/mL；優(yōu)選的，所述蔗糖的濃度為300g/L，所述蔗糖磷酸化酶的用量為30U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為30U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為30U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為30U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為30U/mL。所述酶催化反應(yīng)的條件是：20-70℃反應(yīng)2-100h；優(yōu)選為，37℃反應(yīng)10-72h。其中，所述多酶反應(yīng)體系中還包括：緩沖液、無(wú)機(jī)磷酸根和二價(jià)鎂離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液10-500mM，無(wú)機(jī)磷酸根2-100mM、二價(jià)鎂離子1-50mM；其中，所述緩沖液為磷酸緩沖液，pH為5.0-9.0；優(yōu)選的，pH為7.2；更優(yōu)選的，各成分的用量為：磷酸緩沖液30mM(采用磷酸緩沖液就不需要無(wú)機(jī)磷酸根)、二價(jià)鎂離子5mM。為了進(jìn)一步提高蔗糖塔格糖的得率，所述多酶催化反應(yīng)體系中還包括：葡萄糖異構(gòu)酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，每10g/L蔗糖，葡萄糖異構(gòu)酶的用量為1U/mL，聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。本發(fā)明以蔗糖為底物，加入含有蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶配制多酶反應(yīng)體系，多酶催化途徑包括：由蔗糖磷酸化酶將蔗糖中的一個(gè)葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；由葡萄糖磷酸異構(gòu)酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為塔格糖-6-磷酸；由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖和磷酸。本發(fā)明在上述多酶反應(yīng)體系中進(jìn)一步加入葡萄糖異構(gòu)酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鹽，將蔗糖水解后的終產(chǎn)物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，再由葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶轉(zhuǎn)化為塔格糖。本發(fā)明體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物，或者蔗糖制備塔格糖的方法，所述酶催化反應(yīng)可在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)器分步進(jìn)行，優(yōu)選為在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。本發(fā)明多酶反應(yīng)體系中的任何一種酶可以為任何一種具有同等功能的酶所替換，也可以為通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造所獲得的具有同等功能的突變酶。本發(fā)明體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖實(shí)驗(yàn)中，在一個(gè)反應(yīng)體系中，以可溶性淀粉為底物，加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶進(jìn)行催化反應(yīng)，塔格糖的轉(zhuǎn)化率為37％。而在上述反應(yīng)體系中進(jìn)一步加入異淀粉酶、麥芽糖磷酸化酶、聚磷酸葡萄糖激酶、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和聚磷酸鈉，最終塔格糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72％，轉(zhuǎn)化率顯著提高。本發(fā)明體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖實(shí)驗(yàn)中，在一個(gè)反應(yīng)體系中，以重生的非晶形的纖維素為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶進(jìn)行催化反應(yīng)，塔格糖的轉(zhuǎn)化率為35％。在上述反應(yīng)體系中另外加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，最終塔格糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到68％以上，轉(zhuǎn)化率顯著提高。本發(fā)明體外多酶催化將蔗糖轉(zhuǎn)化為塔格糖實(shí)驗(yàn)中，在一個(gè)反應(yīng)體系中，以蔗糖為底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶、葡萄糖異構(gòu)酶、聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉進(jìn)行催化反應(yīng)，最終塔格糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到63％。本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：(1)原料價(jià)格低廉。本發(fā)明以淀粉或纖維素以及它們的衍生物為原料，或者以蔗糖為原料，而不是使用昂貴的半乳糖。因此，塔格糖的生產(chǎn)成本低，適于大規(guī)模生產(chǎn)。(2)塔格糖的得率高。本發(fā)明體外多酶催化反應(yīng)的最后一步，即由6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶催化反應(yīng)是不可逆過(guò)程，因此可以獲得很高的塔格糖轉(zhuǎn)化率，從而降低塔格糖的分離成本。(3)本發(fā)明制備方法不用果糖作原料，不需要ATP進(jìn)行底物磷酸化生產(chǎn)6-磷酸果糖，大大降低生產(chǎn)塔格糖的成本。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。術(shù)語(yǔ)“酶催化反應(yīng)”意指在生物催化劑-酶作用下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)。附圖說(shuō)明圖1為轉(zhuǎn)化淀粉生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，IA，異淀粉酶；PA，普魯蘭酶；αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；MP，麥芽糖磷酸化酶(該酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶替換)；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖2為利用HPLC檢測(cè)以可溶性淀粉為底物，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示塔格糖的特征峰；圖3為轉(zhuǎn)化纖維素生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，Cellulase，纖維素酶；CDP，纖維多糖磷酸化酶；CBP，纖維二糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖4為轉(zhuǎn)化蔗糖生成塔格糖的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；GI，葡萄糖異構(gòu)酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；PGI，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；T6E，6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶；T6P，6-磷酸塔格糖磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；圖5為用HPLC檢測(cè)以蔗糖為底物，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示塔格糖的特征峰。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。1、實(shí)驗(yàn)材料可溶性淀粉，solublestarch，ACROS公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)：424490020；麥芽糊精，ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)419672；pET20b載體，Novagen，Madison，WI；大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；本發(fā)明中的大部分酶(除了塔格糖-6-磷酸差向異構(gòu)酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶，聚磷酸葡萄糖激酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶)能在Sigma公司購(gòu)買(mǎi)得到；但是都可以按照基因工程方法通過(guò)原核表達(dá)獲得；纖維素酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為M8284；α淀粉酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為10065；Avicel，微晶形纖維素，從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為11365。實(shí)驗(yàn)例1體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖通過(guò)一個(gè)體外多酶催化體系將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖(圖1)。這些關(guān)鍵酶包括：(1)α-葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC2.4.1.1)，從淀粉的非還原端加上1個(gè)磷酸鹽釋放出1-磷酸葡萄糖；(2)葡萄糖磷酸變位酶(PGM，EC5.4.2.2)，催化1-磷酸葡萄糖到6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖；(4)6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖-6-磷酸；(5)6-磷酸塔格糖磷酸酶將塔格糖-6-磷酸脫磷轉(zhuǎn)化為塔格糖和磷酸。在本發(fā)明中，α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的編號(hào)為T(mén)M1168；葡萄糖磷酸變位酶也來(lái)源于Thermotogamaritima，基因在KEGG上的編號(hào)為T(mén)M0769；葡萄糖磷酸異構(gòu)酶來(lái)源于Clostridiumthermocellum，基因在KEGG上的編號(hào)為Cthe0217；6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶來(lái)自于Agrobacteriumfabrum，基因在KEGG上的編號(hào)為Atu3167；6-磷酸塔格糖磷酸酶來(lái)源于Archaeoglobusfulgidus，基因在KEGG上的編號(hào)為AF_0444，這些基因組DNA都可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這五個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體((Novagen,Madison,WI)中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-TmαGP、pET20b-TmPGM、pET20b-CtPGI、pET20b-AtaT6E和pET20b-AfT6P。這五個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)24個(gè)小時(shí)。根據(jù)保持時(shí)間的不同，HPLC可以用來(lái)區(qū)分反應(yīng)液中的塔格糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖或6-磷酸葡萄糖；并且可以對(duì)塔格糖進(jìn)行定量，塔格糖的濃度與HPLC中塔格糖特征峰的強(qiáng)度是成正比的；HPLC的流動(dòng)相為5mM的稀硫酸。反應(yīng)結(jié)束后，最終塔格糖(圖2)的終濃度是37g/L，轉(zhuǎn)化率為37％。實(shí)驗(yàn)例2體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在20℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)24個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，最終塔格糖的終濃度是16g/L，轉(zhuǎn)化率為16％。實(shí)驗(yàn)例3體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，100g/L的可溶性淀粉，在50℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)24個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，最終塔格糖的終濃度是8g/L，轉(zhuǎn)化率為8％。實(shí)驗(yàn)例4通過(guò)過(guò)程優(yōu)化和添加促進(jìn)淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖由于淀粉是有分支鏈，單純采用α-葡聚糖磷酸化酶并不能完全將淀粉水解，因?yàn)棣?葡聚糖磷酸化酶只會(huì)作用于α-1，4糖苷鍵，而分支鏈?zhǔn)且驭?1，6糖苷鍵與主鏈連接的。這需要加入異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)水解α-1，6糖苷鍵。最后，淀粉被這兩種酶水解的最終產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖，為了將這些最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖，還需要加入麥芽糖磷酸化酶(maltosephosphorylase，EC2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphateglucokinase，EC2.7.1.63)。在本發(fā)明中，異淀粉酶來(lái)源于Sulfolobustokodaii，基因在KEGG上的編號(hào)為ST0928，該菌株的基因組DNA是德國(guó)Albert-Ludwigs-Freiburg的GeorgFuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶來(lái)源于Thermobifidafusca，基因在KEGG上的編號(hào)為T(mén)fu1811，該菌株的基因組DNA是美國(guó)康奈爾大學(xué)的DavidWilson教授友情提供。葡聚糖轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于Thermococcuslitoralis，基因在KEGG上的編號(hào)為OCC_10078，該菌株的基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這三個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Ti4GT，這三個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化。α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為M8284。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖(圖2)的終濃度為72g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了72％。實(shí)驗(yàn)例5通過(guò)過(guò)程優(yōu)化和添加促進(jìn)淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4，普魯蘭酶(pullulanase，EC3.2.1.41)從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為P1067；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為M8284。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的普魯蘭酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的可溶性淀粉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖的終濃度為73g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了73％。隨后在反應(yīng)體系中加入少量的α淀粉酶促進(jìn)殘?jiān)矸鄣乃?，提高塔格糖的產(chǎn)量，α淀粉酶的用量為0.1U/ml，繼續(xù)在37℃反應(yīng)24小時(shí)，最終塔格糖(圖2)的終濃度為88g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88％。實(shí)驗(yàn)例6體外多酶催化將麥芽糊精轉(zhuǎn)化為塔格糖α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；異淀粉酶、聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4，麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)品編號(hào)為M8284。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.0)，5mM的二價(jià)鎂離子，所述α-葡聚糖磷酸化酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為10U/mL，所述葡萄糖磷酸異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶的用量為10U/mL，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量為10U/mL，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖轉(zhuǎn)移酶，10mM聚磷酸鈉，100g/L的麥芽糊精(ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)419672)，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖的終濃度為78g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了78％。實(shí)驗(yàn)例7體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖通過(guò)一個(gè)體外多酶催化體系將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖的示意圖見(jiàn)圖3。纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。纖維多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纖維二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是來(lái)源于Clostridiumthermocellum。這兩個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA(基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org/)上獲得)中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)SimpleCloning(You,C.,etal.(2012)."SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。這兩個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化。本實(shí)驗(yàn)采用微晶形纖維素(Avicel)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(10U/ml)和纖維素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價(jià)鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖的終濃度是14g/L，轉(zhuǎn)化率為14％。實(shí)驗(yàn)例8體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。本實(shí)驗(yàn)采用重生的非晶形的纖維素(RegeneratedAmorphouscellulose(RAC)，這是Avicel經(jīng)過(guò)濃磷酸處理后的產(chǎn)物)(Zhang,Y.H.P.,etal.(2006)."ATransitionfromCelluloseSwellingtoCelluloseDissolutionbyo-PhosphoricAcid:EvidencefromEnzymaticHydrolysisandSupramolecularStructure."Biomacromolecules7(2):644-648.)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(10U/ml)和該纖維素(100g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價(jià)鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖的終濃度是35g/L，轉(zhuǎn)化率為35％。實(shí)驗(yàn)例9體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價(jià)鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在25℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)24個(gè)小時(shí)。最終塔格糖的終濃度是29g/L，轉(zhuǎn)化率為29％。實(shí)驗(yàn)例10體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價(jià)鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)24個(gè)小時(shí)。最終塔格糖的終濃度是9g/L，轉(zhuǎn)化率為9％。實(shí)驗(yàn)例11體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為塔格糖由于纖維素水解后的最終產(chǎn)物為葡萄糖，為了將其轉(zhuǎn)化為塔格糖，還需要加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸。纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4；纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，5mM的二價(jià)鎂離子，10U/mL的纖維多糖磷酸化酶，10U/mL纖維二糖磷酸化酶，10U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，10U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，10U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，100g/L的實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，5U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。塔格糖的檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，最終塔格糖的終濃度為68g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了68％。實(shí)驗(yàn)例12體外多酶催化將蔗糖轉(zhuǎn)化為塔格糖通過(guò)一個(gè)體外多酶催化體系將蔗糖轉(zhuǎn)化為塔格糖的示意圖見(jiàn)圖4。蔗糖磷酸化酶是來(lái)源于ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticumJW/SL-YS485，該基因所編碼的酶在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)是WP_015312040.1。這個(gè)基因用引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)SimpleCloning(You,C.,etal.(2012),"SimpleCloningviaDirectTransformationofPCRProduct(DNAMultimer)toEscherichiacoliandBacillussubtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-SP。這個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(QiP,YouC,ZhangYHP:One-PotEnzymaticConversionofSucrosetoSyntheticAmylosebyusingEnzymeCascades.ACSCatal.2014,4:1311-1317.)葡萄糖異構(gòu)酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為G4166；葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。聚磷酸葡萄糖激酶來(lái)源于ThermobifidafuscaYX，基因在KEGG上的編號(hào)為T(mén)fu1811；這個(gè)基因用引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，這個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并通過(guò)SimpleCloning(You,C.,etal.(2012))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體。這個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(LiaoHH,MyungS,ZhangY-HP.2012.One-steppurificationandimmobilizationofthermophilicpolyphosphateglucokinasefromThermobifidafuscaYX:glucose-6-phosphategenerationwithoutATPAppl.Microbiol.Biotechnol.93:1109-1117)。葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶、6-磷酸塔格糖磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有30mM的磷酸緩沖液(pH7.2)，300g/L蔗糖，5mM的二價(jià)鎂離子，30U/mL的蔗糖磷酸化酶，30U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，30U/mL的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖差向異構(gòu)酶，30U/mL的6-磷酸塔格糖磷酸酶，30U/mL的葡萄糖異構(gòu)酶，150U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，300mM聚磷酸鈉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終塔格糖的終濃度為188g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了63％，HPLC圖如5所示。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3