本發(fā)明屬于生物分子醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種可注射水凝膠及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：水凝膠是由高分子交聯(lián)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域如藥物釋放、組織工程和生物傳感等有著廣泛的應(yīng)用。在微創(chuàng)醫(yī)療和可注射組織工程中，可注射原位凝膠體系受到了廣泛的關(guān)注。凝膠基體在注射前將生物分子或者細(xì)胞混合在溶液中，經(jīng)注射可以將負(fù)載了生物分子或細(xì)胞的支架材料植入到需要部位，凝膠化后，便成為藥物制劑中的藥物釋放基點(diǎn)或組織再生的細(xì)胞生長(zhǎng)基點(diǎn)，避免了手術(shù)植入的痛苦和繁瑣，且原位細(xì)胞固定也有利于填充一個(gè)不規(guī)則的組織缺陷。目前，制備原位凝膠體系的方法有化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)包括自由基聚合和邁克爾加成等，通常需要加入引發(fā)劑或生成小分子副產(chǎn)物，物理交聯(lián)通過(guò)物理變化包括ph值、溫度和離子強(qiáng)度等變化實(shí)現(xiàn)。使用動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵構(gòu)筑的水凝膠(即動(dòng)態(tài)鍵凝膠)具有較高機(jī)械強(qiáng)度和可注射性，且由于敏感基團(tuán)是化學(xué)鍵，從而極大的拓寬了可選擇高分子材料的范圍，可構(gòu)筑具有多重響應(yīng)性的水凝膠。楊等使用苯甲酰亞胺鍵可構(gòu)筑ph/溫度雙敏感的可注射殼聚糖基質(zhì)水凝膠，苯甲酰亞胺鍵具有生理ph響應(yīng)性，可通過(guò)調(diào)節(jié)ph值觸發(fā)凝膠的形成與破壞，不需要引發(fā)劑，且該反應(yīng)的小分子產(chǎn)物為水，避免了凝膠過(guò)程中雜質(zhì)的引入；形成的水凝膠具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，在高分子含量較低(5.0wt％)時(shí)其彈性模量可達(dá)103-104pa，該水凝膠可用于抗腫瘤藥物的長(zhǎng)效可控釋放，并取得了較好的腫瘤治療效果(duallyresponsiveinjectablehydrogelpreparedbyinsitucross-linkingofglycolchitosanandbenzaldehyde-cappedpeo-ppo-peo,biomacromolecules2010,11,1043-1051)。苯硼酸酯由苯硼酸衍生物和多羥基化合物反應(yīng)形成，反應(yīng)不需要引發(fā)劑，不產(chǎn)生除水以外的其它副產(chǎn)物，與葡萄糖氧化酶(gox)、凝集素是構(gòu)筑葡萄糖響應(yīng)體系的三大體系。葡萄糖氧化酶和凝集素為蛋白類化合物，對(duì)環(huán)境要求比較苛刻，外界環(huán)境的變化可能會(huì)導(dǎo)致其失活，限制了其應(yīng)用。而亞胺鍵由于其設(shè)計(jì)的多樣性和更好的穩(wěn)定性，在發(fā)展葡萄糖響應(yīng)體系方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，引起了研究者們更為廣泛的關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道由苯硼酸和聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipam)組成的凝膠和微凝膠，在葡萄糖存在時(shí)能夠溶脹并釋放出胰島素，但這些材料只有在高于苯硼酸pka值(ph9)和較高的葡萄糖濃度(20g/l)下才具有葡萄糖響應(yīng)性，限制了其在生理?xiàng)l件下(ph7.4，葡萄糖濃度1-3g/l)的應(yīng)用(synthesisandvolumephasetransitionsofglucose-sensitivemicrogels,biomacromolecules2006,7,3196-3201,phenylboronicacid-basedglucose-responsivepolymericnanoparticles:synthesisandapplicationsindrugdelivery,polym.chem.,2014,5,1503-1518)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種安全無(wú)毒可生物降解的可注射水凝膠，主要利用特定結(jié)構(gòu)四臂端氨基修飾的聚乙二醇的氨基與丁醛-聚乙二醇-丁醛的醛基形成的亞胺動(dòng)態(tài)鍵得到可注射性水凝膠。本發(fā)明還提供了所述可注射水凝膠的制備方法，具有制備過(guò)程簡(jiǎn)便、快速，易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案如下：一種可注射水凝膠，由原料a、原料b和成膠液構(gòu)成；所述原料a和原料b的質(zhì)量之和在水凝膠中的質(zhì)量百分比為5％-50％，其中原料a為丁醛-聚乙二醇-丁醛，原料b為四臂端氨基修飾的聚乙二醇；所述丁醛-聚乙二醇-丁醛的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：式ⅰ，式ⅰ中m為10-16000的整數(shù)；所述四臂端氨基修飾的聚乙二醇的結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示：式ⅱ，式ⅱ中n為565-5700的整數(shù)。本發(fā)明可注射水凝膠，采用式ⅰ所示丁醛-聚乙二醇-丁醛和式ⅱ所示四臂端氨基修飾的聚乙二醇，兩者的結(jié)構(gòu)均為具有良好水溶性的大分子，四臂端氨基修飾的聚乙二醇中的四臂結(jié)構(gòu)能夠?yàn)樗z提供具有親水性的柔性鏈段的網(wǎng)狀支架，丁醛-聚乙二醇-丁醛的直鏈結(jié)構(gòu)也可充當(dāng)柔性鏈段，這兩種特有的結(jié)構(gòu)在水溶液中能夠保證形成的水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，得到的水凝膠具有優(yōu)良的柔軟性和彈性，緩釋效果可控；同時(shí)，四臂端氨基修飾的聚乙二醇的氨基與丁醛-聚乙二醇-丁醛的醛基形成的亞胺動(dòng)態(tài)鍵對(duì)ph具有響應(yīng)性，能夠原位形成呈現(xiàn)均勻狀態(tài)的凝膠，可通過(guò)注射方式植入體內(nèi)?？紤]原料a和原料b特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，優(yōu)選：所述原料a和原料b的質(zhì)量比為(0.5-25)：1，能夠增強(qiáng)水凝膠的穩(wěn)定性和可注射性。所述原料a和原料b的質(zhì)量之和在水凝膠中的質(zhì)量百分比為5％-30％，進(jìn)一步優(yōu)選為5％-20％，最優(yōu)選5％-15％。原料a和原料b的總質(zhì)量百分濃度為5％-20％時(shí)，注射性更加優(yōu)良；原料a和原料b的總質(zhì)量百分濃度大于20％且小于等于50％時(shí)，凝膠的穩(wěn)定性更好。原料a和原料b的總質(zhì)量百分濃度為5％-15％時(shí)，不僅注射性優(yōu)良，而且更適宜在人體正常體溫范圍(一般36.0℃-37.5℃)和正常生理ph7.4條件下快速凝膠化。本發(fā)明可根據(jù)水凝膠的應(yīng)用領(lǐng)域不同，選擇合適的原料a和原料b的總質(zhì)量百分濃度范圍。所述成膠液選用去離子水或者ph值在6-8的緩沖溶液，為水凝膠提供成膠環(huán)境。所述緩沖溶液可采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(tris-hcl緩沖液)、硼酸-硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液等緩沖溶液中的一種或者多種。根據(jù)其應(yīng)用領(lǐng)域的要求，所述成膠液均可選用無(wú)菌成膠液。所述可注射水凝膠的制備方法，包括步驟：將原料a和原料b加成膠液混合均勻，得到可注射水凝膠。所述可注射水凝膠的形成溫度在20℃-38℃。本發(fā)明所用的原料均可采用市售產(chǎn)品或者采用現(xiàn)有制備方法制備得到。所述可注射水凝膠，具有ph響應(yīng)性及可注射性，可作為藥物載體、栓塞材料或者組織工程材料等應(yīng)用。所述可注射水凝膠采用特定結(jié)構(gòu)和分子量范圍的原料a和原料b，尤其利于作為負(fù)載小分子藥物例如阿霉素(dox)的藥物載體，藥物釋放速率可調(diào)節(jié)。本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明水凝膠的原料采用具有良好水溶性的大分子，原料本身安全無(wú)毒可生物降解，凝膠的形成過(guò)程無(wú)需使用有機(jī)溶劑，克服了水凝膠體內(nèi)使用時(shí)的安全隱患。原料a和原料b均為現(xiàn)有高分子化合物，其來(lái)源為化學(xué)合成，相較于目前水凝膠大量采用的來(lái)自于植物和動(dòng)物體內(nèi)的高分子化合物，化學(xué)合成的原料具有結(jié)構(gòu)可控制，更容易調(diào)節(jié)水凝膠的強(qiáng)度、降解速度、藥物釋放速度等優(yōu)勢(shì)。(2)本發(fā)明水凝膠主要是特定結(jié)構(gòu)大分子上的氨基和另一特定結(jié)構(gòu)大分子上的醛基反應(yīng)形成亞胺鍵，在人體正常體溫范圍和正常生理ph值下比較穩(wěn)定，弱酸性條件下會(huì)逐漸水解形成溶液。由于亞胺鍵在正常生理?xiàng)l件下較穩(wěn)定，在弱酸性條件下易發(fā)生水解，本發(fā)明可以通過(guò)調(diào)節(jié)兩種原料的比例，控制生成亞胺鍵的比例，從而智能的控制凝膠的形成時(shí)間、凝膠的致密程度、藥物的釋放以及凝膠的降解速率。(3)本發(fā)明水凝膠有一定的強(qiáng)度和韌性，由于在形成凝膠的過(guò)程中生成了亞胺鍵，具有自修復(fù)性，可通過(guò)原料的分子量和原料的比例調(diào)控凝膠性能，進(jìn)一步提高了凝膠的生物相容性；本發(fā)明制備的凝膠具有生物降解性能，能被人體代謝；具有ph響應(yīng)性及可注射性，可用作藥物載體、栓塞材料以及組織工程材料等。(4)本發(fā)明可注射水凝膠的制備方法，具有制備過(guò)程簡(jiǎn)便、快速，易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中可注射水凝膠的電鏡掃描圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中可注射水凝膠的流變圖；其中g(shù)′表示儲(chǔ)能模量，g″表示損耗模量；圖3為本發(fā)明應(yīng)用例3中載藥可注射水凝膠在兩種ph環(huán)境中下的藥物累積釋放曲線圖；圖4為本發(fā)明應(yīng)用例1中載藥可注射水凝膠的在ph7.4環(huán)境中藥物累積釋放曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的描述。本具體實(shí)施方式并非對(duì)其保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1將0.5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝100)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝1000，laysan)加28.5g無(wú)菌去離子水，37℃迅速震蕩混合均勻，35秒后得到30g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。該可注射水凝膠的電鏡掃描圖見(jiàn)圖1，顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.4mm。實(shí)施例2將5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝16000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5000，laysan)加34g磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ph＝6.5)，37℃迅速震蕩混合均勻，30秒后得到40g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.3mm。實(shí)施例3將14g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5700，laysan)加85g磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(ph＝7.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，25秒后得到100g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.3mm。實(shí)施例4將25g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝565，laysan)加234g巴比妥鈉-鹽酸緩沖液(ph＝6)，38℃迅速震蕩混合均勻，32秒后得到260g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.3mm。實(shí)施例5將20g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝5000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝2500，laysan)加84gtris-hcl緩沖液(ph＝6.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，22秒后得到105g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.2mm。實(shí)施例6將25g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝8000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝4000，laysan)加61g甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(ph＝7.6)，20℃迅速震蕩混合均勻，18秒后得到87g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.3mm。實(shí)施例7將10g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝13000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝3200，laysan)加11g硼酸-硼砂緩沖液(ph＝8)，30℃迅速震蕩混合均勻，12秒后得到22g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結(jié)構(gòu)，孔徑在0.1mm-0.3mm。以阿霉素作為模型藥物探索了本發(fā)明水凝膠控制藥物釋放的性質(zhì)：應(yīng)用例1將阿霉素500mg、0.5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝100)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝1000，laysan)加28.4g無(wú)菌去離子水，37℃迅速震蕩混合均勻，35秒后得到30g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射載藥水凝膠，包封率85％，載藥量1.42％。應(yīng)用例2將阿霉素700mg、5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝16000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5000，laysan)加33.9g磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ph＝6.5)，37℃迅速震蕩混合均勻，30秒后得到40g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射載藥水凝膠，包封率90％，載藥量1.58％。應(yīng)用例3將阿霉素1.5g、14g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10000)和1g端四臂氨基修飾的聚乙二醇(n＝5700，laysan)加84.9g磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(ph＝7.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，25秒后得到100g呈透明、均勻狀態(tài)的可注射載藥水凝膠，包封率92％，載藥量1.38％。本發(fā)明水凝膠，隨著聚合物濃度的增加成膠時(shí)間縮短，水凝膠的成膠時(shí)間可以方便的控制在12秒-35秒。本發(fā)明水凝膠成膠時(shí)間較短，可以在原位注射時(shí)避免各原料和溶液混合后凝膠分子濃度瞬間被體液等稀釋而影響水凝膠的形成，具有可注射性，能夠原位成膠。將實(shí)施例1-6中的可注射水凝膠采用rs6000流變儀(thermo-fisher)在37℃的測(cè)試平臺(tái)上進(jìn)行流變分析測(cè)試，以實(shí)施例3中可注射水凝膠的流變圖(如圖2所示)為例，流變結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的增加儲(chǔ)能模量g′與損耗模量g″逐漸增強(qiáng)，相同時(shí)間條件儲(chǔ)能模量g′明顯大于損耗模量g″，表明本發(fā)明水凝膠為彈性網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。應(yīng)用例1-3中水凝膠負(fù)載藥物后，水凝膠的成膠時(shí)間沒(méi)有變化，表明本發(fā)明水凝膠負(fù)載藥物前后均可以快速形成凝膠狀，均具有良好的可注射性。將應(yīng)用例1-3中的所得載藥水凝膠置于10ml的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液(pbs溶液)或者ph＝6.5的pbs溶液中，37℃，40rpm恒溫振蕩器中進(jìn)行體外藥物釋放，分別于多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(t)取1ml上清液，每次取上清液后及時(shí)補(bǔ)入1ml的新鮮pbs溶液，采用hplc法檢測(cè)各時(shí)段上清液(樣品)中阿霉素含量，計(jì)算藥物累積釋放率(％)。hplc檢測(cè)條件：用0.5ml流動(dòng)相再次溶解，用反相高效液相色譜(rp-hplc，agilent1200，agilenttechnologiesinc.，usa)檢測(cè)其濃度。將20μl樣品注射到zorbaxeclipseplusc18色譜柱(150mm×4.6mm)，5.0μm，agilentcorp.，usa)中，以1ml/min的淋洗速度洗脫，流動(dòng)相組成為乙腈/水/甲醇(48/41/11,v/v/v)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm。釋放液中dox的含量用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為485nm。釋放結(jié)果以三次重復(fù)測(cè)試的平均值繪圖。藥物累積釋放率＝(t時(shí)間藥物釋放總質(zhì)量÷實(shí)際負(fù)載藥物質(zhì)量)×100％。應(yīng)用例3的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放曲線圖見(jiàn)圖3，不同ph值條件下，藥物釋放速度不同，表明本發(fā)明可注射水凝膠具有ph響應(yīng)性，在ph7.4的時(shí)候，藥物釋放速度較慢，在弱酸性條件下(如ph6.5時(shí))，由于亞胺鍵的不穩(wěn)定，凝膠交聯(lián)點(diǎn)減少，藥物釋放速度加快。應(yīng)用例1的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放曲線圖見(jiàn)圖4，應(yīng)用例2的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放結(jié)果與應(yīng)用例1的藥物累積釋放結(jié)果基本相同，其藥物釋放曲線圖中顯示，本發(fā)明水凝膠中的阿霉素能夠緩釋，并且其能夠有效緩釋長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)。本發(fā)明載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放結(jié)果表明此凝膠釋放體系在作為化療藥物緩釋載體中有應(yīng)用價(jià)值。另外由于本發(fā)明水凝膠具有降解性，在植入體內(nèi)的材料，如栓塞材料或者組織工程材料等領(lǐng)域有應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12