技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甾體藥物中間體的制備方法，特別涉及一種孕甾藥物中間體孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基的制備方法。
背景技術(shù)：
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糖皮質(zhì)激素是腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇化合物，其生理性作用表現(xiàn)在對(duì)糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)的影響。它能抑制緩激肽、前列腺素e2、5-羥色胺、組胺等炎性介質(zhì)的合成與釋放，降低血管通透性、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制吞噬作用。對(duì)各種原因引起的炎癥都有很強(qiáng)的抗炎作用，可以減輕炎癥早期的滲出、水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤(rùn)及吞噬反應(yīng)，可抑制炎癥后期毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞增生，抑制免疫反應(yīng)產(chǎn)生的病理變化，解除該疾病的癥狀。
孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基是孕甾藥物重要中間體，可以制備糖皮質(zhì)激素，例如cn200710061254.4中就介紹了以孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮為底物制備倍他米松及其系列產(chǎn)品的方法。
為了更好地制備孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮，研究人員采取了多種方法。
cn201010278556.9由霉菌脫氫物制備甲基四烯物分為兩步反應(yīng)：第一步脫水得甲基脫水物，第二步經(jīng)還原得甲基四烯物(5st)。
cn201510090371.8公開了以雄甾-4-烯-3，17-雙酮-9α-羥基為底物，經(jīng)過脫水、醚化、接側(cè)鏈、生物脫氫得到孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及甾體藥物中間體的制備方法，特別涉及一種孕甾藥物中間體孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基的制備方法。
我們經(jīng)過不斷的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化反應(yīng)路線，調(diào)整工藝，可以雄甾-4-烯-3，17-雙酮為底物，經(jīng)過氰化、縮酮、格氏、生物氧化、脫水應(yīng)得到孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基，再經(jīng)過生物脫氫、脫水反應(yīng)，得到孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮。
一種式2化合物的制備方法，其特征是：
步驟1：
將1-4個(gè)碳的醇和無機(jī)堿水溶液攪拌均勻，將式3化合物投入到其中，攪拌均勻。再加入2倍摩爾比以上的丙酮氰醇，控制溫度在25-40℃之間攪拌反應(yīng)直至無原料。再將反應(yīng)液稀釋入水中，用無機(jī)酸中和稀釋液至ph值中性；過濾得到式4化合物；
步驟2：
將式4化合物投入到乙二醇中，再依次加入對(duì)甲苯磺酸、原甲酸三乙酯，升溫至30-60℃反應(yīng)直至無原料，再加入適量的有機(jī)堿中和，然后將反應(yīng)液稀釋入水中，過濾，得到縮酮物式5化合物；
步驟3：
將干燥的式5化合物和乙烯基正丁醚投入到含有甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體；再滴加入格氏試劑-甲基氯化鎂/ 四氫呋喃，滴加完成后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格式試劑，然后用無機(jī)酸調(diào)反應(yīng)液的ph值小于3。加熱反應(yīng)液至40-70℃保溫2小時(shí)，后降溫至5-10℃，用無機(jī)堿水溶液調(diào)ph至中性，濃縮、稀釋，過濾，得到式6化合物；
步驟4
將式6化合物粉碎或以1-4個(gè)碳的醇溶解，投入含有霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行生物發(fā)酵，得到式8化合物。
步驟5
在2-6個(gè)碳的醚、乙腈中的一種或幾種有機(jī)溶劑中加入式8化合物，降溫至-90至-50℃與三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷中的一種或幾種反應(yīng)，反應(yīng)至原料少于5％以后，稀釋到與水中，用無機(jī)堿調(diào)節(jié)ph值至中性，過濾得到式1化合物。
步驟6
將式1化合物粉碎或以1-4個(gè)碳的醇溶解，投入已培養(yǎng)好簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到化合物7。
步驟7：
將化合物7投入到醋酸中，再加入的鹽酸氨基脲水溶液，升溫反應(yīng)直至無原料，降溫至室溫，稀釋入水中，過濾，得化合物2；
化合物8中的
式5化合物中4、5位和5、6位的虛線表示4、5位或5、6位存在雙鍵。
一種式1化合物的制備方法，其特征是：
步驟1：
將1-4個(gè)碳的醇和無機(jī)堿水溶液攪拌均勻，將式3化合物投入到其中，攪拌均勻。再加入2倍摩爾比以上的丙酮氰醇，控制溫度在25-40℃之間攪拌反應(yīng)直至無原料。再將反應(yīng)液稀釋入水中，用無機(jī)酸中和稀釋液至ph值中性；過濾得到式4化合物；
步驟2：
將式4化合物投入到乙二醇中，再依次加入對(duì)甲苯磺酸、原甲酸三乙酯，升溫至30-60℃反應(yīng)直至無原料，再加入適量的有機(jī)堿中和，然后將反應(yīng)液稀釋入水中，過濾，得到縮酮物式5化合物；
步驟3：
將干燥的式5化合物和乙烯基正丁醚投入到含有甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體；再滴加入格氏試劑-甲基氯化鎂/四氫呋喃，滴加完成后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格式試劑，然后用無機(jī)酸調(diào)反應(yīng)液的ph值小于3。加熱反應(yīng)液至40-70℃保溫2小時(shí)，后降溫至5-10℃，用無機(jī)堿水溶液調(diào)ph至中性，濃縮、 稀釋，過濾，得到式6化合物；
步驟4
將式6化合物粉碎或以1-4個(gè)碳的醇溶解，投入含有霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行生物發(fā)酵，得到式8化合物。
步驟5
在2-6個(gè)碳的醚、乙腈中的一種或幾種有機(jī)溶劑中加入式8化合物，降溫至-90至-50℃與三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷中的一種或幾種反應(yīng)，反應(yīng)至原料少于5％以后，稀釋到與水中，用無機(jī)堿調(diào)節(jié)ph值至中性，過濾得到式1化合物，
式5化合物中4、5位和5、6位的虛線表示4、5位或5、6位存在雙鍵，化合物8中的
如上所述的制備方法，其特征是所述1-4個(gè)碳的醇為甲醇或乙醇。
如上所述的制備方法，其特征是所述步驟1中無機(jī)堿為naoh、koh中的一種或幾種，無機(jī)堿水溶液濃度為30-60％，式4化合物與無機(jī)堿水溶液的重量體積比為1:0.01-0.1。
如上所述的制備方法，，其特征是所述步驟2中對(duì)甲苯磺酸為催化劑量，式5化合物與原甲酸三乙酯的重量體積比為1:0.7-2，有機(jī)堿未吡啶或三乙胺中的一種。
如上所述的制備方法，，其特征是所述步驟3中式6化合物與乙烯基正丁醚 的重量體積比為1:0.5-1，甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液濃度為0.01-1％，2-6個(gè)碳的醚為乙醚、四氫呋喃、1,2-二氧六環(huán)、甲乙醚、二甲醚，無機(jī)酸為鹽酸，無機(jī)堿為naoh、koh、na2co3、nahco3、k2co3、khco3中的一種或幾種。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟4中霉菌為黑根霉菌、綠僵霉菌、木霉菌、赭曲霉菌、黃曲霉菌中的一種或幾種。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟4中霉菌為黑根霉菌。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟4中霉菌為中國普通微生物菌種保藏管理中心cgmcc編號(hào)3.235,3.904的黑根霉菌。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟4中斜面培養(yǎng)基中g(shù)/l重量體積比為磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.05，檸檬酸鐵銨0.005，檸檬酸2，硝酸銨2，碳酸鈣10，甘油20，葡萄糖5，瓊脂15。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟4中發(fā)酵培養(yǎng)基中g(shù)/l重量體積比為玉米粉3～8，葡萄糖10～25，氯化鉀0.02～0.15，硝酸鉀0.5～3.0，磷酸二氫鉀0.5～2.5，磷酸氫二鉀1.0～4.0，硼酸鹽0.1～10。
如上所述的制備方法，，其特征是步驟5中式8化合物與三氯化磷、五氯化磷或三氯氧磷的重量比為1:0.8-2。
如上所述式2化合物的制備方法，其特征是步驟6中溶解式1化合物的溶劑選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)、n，n-二甲基甲酰胺中的一種或幾種，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的為as1.754、as1.94*。
如上所述式2化合物的制備方法，其特征是步驟6生物轉(zhuǎn)化中斜面培養(yǎng)基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
如上所述式2化合物的制備方法，其特征是步驟6生物轉(zhuǎn)化中斜面培養(yǎng)基采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來水配制，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
如上所述式2化合物的制備方法，其特征是步驟6生物轉(zhuǎn)化中發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，kh2po40.25％，玉米漿0.1％，以及余量的蒸餾水，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph7.0-7.2。
如上所述式2化合物的制備方法，其特征是步驟7中鹽酸氨基脲水溶液含量為3-10％，升溫反應(yīng)溫度為60℃以上。
所述的生物發(fā)酵工藝還可采用任何公知的生物發(fā)酵工藝方法，如參考《生物合成藥物學(xué)》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年出版，褚志義主編；666～675頁)中公開的生物發(fā)酵工藝。
在步驟4、6中底物的投料濃度為≤4％(相對(duì)于發(fā)酵液容積)；優(yōu)選投料濃度 為1％～3％，發(fā)酵溫度30～34℃，優(yōu)選促溶劑加入量為2～5％(v/v)。生物脫氫反應(yīng)時(shí)間30～72小時(shí)。
所述的生物反應(yīng)可以采用以下發(fā)酵工藝：
斜面培養(yǎng)—一級(jí)培養(yǎng)—一級(jí)培養(yǎng)—加入化合物(1)發(fā)酵進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)—終止反應(yīng)。
步驟4、6生物反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，優(yōu)選采用將發(fā)酵液升溫至70～90℃而使菌體滅活的方法，終止反應(yīng)后用優(yōu)選采用溶媒萃取發(fā)酵液的形式提取脫氫產(chǎn)物。所述萃取用溶媒優(yōu)選乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿。
所述步驟4生物氧化使用的霉菌為黑根霉菌(rhizopusnigricans)、綠僵霉菌、木霉菌、赭曲霉菌、黃曲霉菌。黑根霉菌優(yōu)選中國普通微生物菌種保藏管理中心cgmcc編號(hào)3.235,3.904。
所述步驟4的生物氧化所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比：
步驟4中斜面培養(yǎng)基中g(shù)/l重量體積比為磷酸氫二鉀0.05，硫酸鎂0.05，檸檬酸鐵銨0.005，檸檬酸2，硝酸銨2，碳酸鈣10，甘油20，葡萄糖5，瓊脂15。
步驟4中發(fā)酵培養(yǎng)基中g(shù)/l重量體積比為玉米粉3～8，葡萄糖10～25，氯化鉀0.02～0.15，硝酸鉀0.5～3.0，磷酸二氫鉀0.5～2.5，磷酸氫二鉀1.0～4.0，硼酸鹽0.1～10。
所述步驟6生物脫氫所使用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)優(yōu)選以下幾種菌株：as1.754、as1.94*(均由中國科學(xué)院微生物研究所提供)。
所述步驟6的生物脫氫所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比：
斜面培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.3，酵母膏1.3，瓊脂2.0，以及余量的蒸餾水，ph7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.0，酵母膏0.16，kh2po40.25，玉米漿0.1，以及余量的蒸餾水，ph7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物脫氫反應(yīng)中。
具體實(shí)施方式
hplc：高效液相色譜
實(shí)施例1
實(shí)施例1-1
將10g式3化合物投入到30ml甲醇和1ml60％koh水溶液中，攪拌均勻。再加入8ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入150ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌。烤干，得到式4化合物9.7g。
實(shí)施例1-2
將10g式3化合物投入到20ml甲醇和0.5ml50％koh水溶液中，攪拌均勻。再加入15ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入300ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式4化合物10.4g。
實(shí)施例1-3
將10g式3化合物投入到15ml甲醇和0.2ml40％氫氧化鈉水溶液中，攪拌均勻。再加入20ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入300ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式4化合物10.3g。
實(shí)施例1-4
將10g式3化合物投入到10ml甲醇和0.1ml30％氫氧化鈉水溶液中，攪拌均勻。再加入25ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式4化合物10.1g。
實(shí)施例2
實(shí)施例2-1(本步反應(yīng)收率偏低，可設(shè)定為105％-110％)
將10g式4化合物投入到15ml乙二醇中，再依次加入0.1g對(duì)甲苯磺酸、20ml原甲酸三乙酯，升溫至55-60℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入100ml水中，過濾，洗滌。烤干，得到式5化合物10.4g。
實(shí)施例2-2
將10g式4化合物投入到20ml乙二醇中，再依次加入0.2g對(duì)甲苯磺酸、15ml原甲酸三乙酯，升溫至50-55℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入150ml水中，過濾，洗滌。烤干，得到式5化合物10.5g。
實(shí)施例2-3
將10g式4化合物投入到25ml乙二醇中，再依次加入0.2g對(duì)甲苯磺酸、10ml原甲酸三乙酯，升溫至40-45℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，過濾，洗滌。烤干，得到式5化合物10.8g。
實(shí)施例2-4
將10g式4化合物投入到30ml乙二醇中，再依次加入0.3g對(duì)甲苯磺酸、20ml原甲酸三乙酯，升溫至30-35℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物10.7g。
實(shí)施例3
實(shí)施例3-1
將式5化合物10g和5ml的乙烯基正丁醚投入到50ml含有0.01％對(duì)甲苯磺酸的四氫呋喃溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。
再滴加入30ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至60-70℃保溫1小時(shí)，再降溫至15-20℃，用10％氫氧化鈉水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘夜稀釋入100ml水中。過濾，洗滌?！婵靖?，得到式6化合物8.3g。
實(shí)施例3-2
將式5化合物10g和7.5ml的乙烯基正丁醚投入到40ml含有0.1％對(duì)甲苯磺酸的乙醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。
再滴加入35ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至50-60℃保溫2小時(shí)，再降溫至10-15℃，用20％碳酸鉀水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘液稀釋入150ml水中。過濾，洗滌?！婵靖桑玫绞?化合物8.6g。
實(shí)施例3-3
將式5化合物10g和9ml的乙烯基正丁醚投入到30ml含有0.1％對(duì)甲苯磺酸的1,2-二氧六環(huán)溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。
再滴加入40ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至45-55℃保溫4小時(shí)，再降溫至15-20℃，用30％碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘夜稀釋入200ml水中。過濾，洗滌。℃烤干，得到式6化合物8.4g。
實(shí)施例4
實(shí)施例4-1
將黑根霉菌(cgmcc編號(hào)3.235)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27-30℃，將20g式6化合物溶于20ml四氫呋喃投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為2％，反應(yīng)溫度為28-31℃。直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式8化合物19.2g。
實(shí)施例4-2
將黑根霉菌(cgmcc編號(hào)3.904)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27-30℃，將20g式6化合物溶于30ml甲醇投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為3％，反應(yīng)溫度為29-32℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用氯仿萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式8化合物20.1g。
實(shí)施例4-3
將黑根霉菌(cgmcc編號(hào)3.904)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27-30℃，將20g式6化合物溶于40mln，n-二甲基甲酰胺投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為4％，反應(yīng)溫度為26-29℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用二氯甲烷萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物18.4g。
實(shí)施例5
實(shí)施例5-1
將式8化合物10g投入到50ml乙醚中，降溫至-90℃，加入8g三氯化磷，攪拌反應(yīng)至原料少于5％以后，稀釋到與水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至中性，過濾得到式1化合物8.4g。
實(shí)施例5-2
將式8化合物10g投入到50ml四氫呋喃中，降溫至-70℃，加入10g五氯化磷，攪拌反應(yīng)至原料少于5％以后，稀釋到與水中，用碳酸氫鉀調(diào)節(jié)ph值至中性，過濾得到式1化合物9.1g。
實(shí)施例5-3
將式8化合物10g投入到50ml乙腈中，降溫至-50℃，加入10g三氯氧磷，攪拌反應(yīng)至原料少于5％以后，稀釋到與水中，用碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值至中性，過濾得到式1化合物8.2g。
實(shí)施例6
實(shí)施例6-1
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(as1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為31-33℃，將20g式6化合物溶于20ml四氫呋喃投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為2％，反應(yīng)溫度為31℃。直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物17.4g。
實(shí)施例6-2
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(as1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將20g式6化合物溶于30ml甲醇投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為3％，反應(yīng)溫度為32℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用氯仿萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物18.3g。
實(shí)施例6-3
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(as1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30-32℃，將20g式6化合物溶于40mln，n-二甲基甲酰胺投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為4％，反應(yīng)溫度為32℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用二氯甲烷萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物18.5g。
實(shí)施例7
實(shí)施例7-1
將10g式7化合物投入到50ml醋酸中，再加入10％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至60-65℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入200ml水中，過濾，得到8.9g式2化合物。
實(shí)施例7-2
將10g式7化合物投入到100ml醋酸中，再加入8％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至70-75℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入400ml水中，過濾，得到9.1g式2化合物。
實(shí)施例7-3
將10g式7化合物投入到100ml醋酸中，再加入5％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至80-85℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入400ml水中，過濾，得到9.2g式2化合物。
實(shí)施例7-4
將10g式7化合物投入到150ml醋酸中，再加入3％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至85-90℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入500ml水中，過濾，得到9.2g式2化合物。