本發(fā)明涉及一種甾體類化合物及其用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

心衰(heartfailure，hf)是指心臟功能異常導(dǎo)致心臟泵血量不能滿足組織代謝需要的一種病理生理狀態(tài)([j].circulation,2008,117(4):e25-e146)。心衰是各種心臟病最終進(jìn)展的復(fù)雜臨床表現(xiàn)，體循環(huán)與肺循環(huán)游血以及人體組織低灌注是其主要特點(diǎn)，其主要的病理生理機(jī)制是左心室和或右心室功能障礙及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的失常，從而導(dǎo)致液體潴留、運(yùn)動(dòng)耐量減低和存活時(shí)間明顯縮短([m].人民衛(wèi)生出版社,2009:129.)。目前認(rèn)為心衰的發(fā)病與心肌病理性重構(gòu)有關(guān)，其有兩個(gè)關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，一是急性心肌梗死、重癥心肌炎等疾病導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的死亡(包括細(xì)胞的凋亡、壞死與自我吞唆)；二是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(mas)激活([j],lancet,2011,378:704-712.)，其中后者所起到的作用更為重要，防治心衰需有效切斷以上兩個(gè)環(huán)節(jié)方可([j].nengljmed,2010,362:228-238.)。中醫(yī)藥辨證治療心衰在控制癥狀、改善預(yù)后、減少具有副反應(yīng)的西藥、以及調(diào)整患者機(jī)體的免疫功能、減少心衰復(fù)發(fā)、提高患者生存質(zhì)量等方面具有獨(dú)特的療效和優(yōu)勢([j].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28(12):1124-1126.)。

隨著心衰病人的不斷增多，治療難度很難取得新的突破，除了遵循以往的治療思路和理念外，我們還應(yīng)該努力發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，采用中西醫(yī)結(jié)合的方法對(duì)心衰進(jìn)行控制。而補(bǔ)益心氣中藥在改善心肌能量代謝、防治心衰上具有一定的優(yōu)勢。中藥是我國特有的天然寶庫，已經(jīng)有不少中藥的活性成分被證實(shí)對(duì)急性心衰具有治療作用。

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍(bofobufoandrewsischmidt)或黑眶蟾蜍(bufomelanostitusschneider)的干燥分泌物，是名貴中藥，性辛、溫，有毒，具有解毒、消腫、醒神、開竅、強(qiáng)心和止痛等作用。蟾酥中主要的強(qiáng)心主要活性成分為蟾毒配基類化合物，蟾毒配基類化合物屬于強(qiáng)心甾體類化合物，目前已經(jīng)有大量的蟾毒配基類化合物被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，例如蟾毒靈、脂蟾毒配基、華蟾毒它靈、華蟾毒精等。這些化合物雖然具有很好地強(qiáng)心活性，但大多也具有較強(qiáng)的心臟毒性和細(xì)胞毒性，嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)出一種高效低毒的甾體類化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種高效低毒的具有強(qiáng)心作用的甾體類化合物及其用途，以促進(jìn)該類化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明所述的甾體類化合物是具有式ⅰ結(jié)構(gòu)的化合物或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、前體化合物、水合物或溶劑化物：

其中：r1選自oh、ocora、ocoora、oconrarb、oso2ra、oso3ra、oco(ch2)ncooh、oco(ch2)ncoarg.oh中的任意一種，或r1與其所連接的碳形成羰基；r2選自h、oh、ocora、ocoora、oconrarb、oso2ra、oso3ra中的任意一種，或r2與其所連接的碳形成羰基；ra、rb選自氫、取代或未取代的c1～c12烷基、取代或未取代的c2～c12烯基、取代或未取代的c2～c12炔基、取代或未取代的c6～c30芳基、取代或未取代的c1～c30雜芳基中的任意一種，n為1到10的任意整數(shù)。其中，arg.oh是精氨酸的縮寫。

作為優(yōu)選方案，r1選自oh、ocora、oco(ch2)ncooh、oco(ch2)ncoarg.oh中的任意一種，或r1與其所連接的碳形成羰基；r2選自h、oh、ocora中的任意一種，或r2與其所連接的碳形成羰基；ra選自氫、c1～c5烷基、c2～c5烯基中的任意一種，n為4、5或6。

作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，r1選自oh、ococh3、oco(ch2)ncooh、oco(ch2)ncoarg.oh中的任意一種，r2選自h、oh、ococh3中的任意一種，n為4、5或6。

作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述甾體類化合物選自如下化合物或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、前體化合物、水合物或溶劑化物：

本發(fā)明所述的甾體類化合物可通過化學(xué)合成或/和從天然藥物中提取得到，例如：從蟾酥中分離獲得，或者從蟾酥中分離部分化合物后對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾。

當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)具體化學(xué)結(jié)構(gòu)式，利用本領(lǐng)域的熟知手段進(jìn)行人工合成制備本發(fā)明所述的甾體類化合物。

具體說，從蟾酥中分離制備所述結(jié)構(gòu)式為式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ化合物的方法，包括如下步驟：

a)以蟾酥干漿為原料，加甲醇水溶液，進(jìn)行回流提取1～3次，每次1～6小時(shí)；合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得流浸膏；將所得流浸膏混懸于水中，以二氯甲烷萃取至萃取液無色；合并萃取液，減壓濃縮至浸膏，得到粗提物；

b)將粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，以體積比為10:10:1～1:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每份洗脫液減壓蒸發(fā)后經(jīng)tlc薄層分析，按洗脫順序得到八個(gè)組分；

c)對(duì)第二組分進(jìn)行制備液相色譜柱分離，tlc薄層分析，收集含有化合物的流份，濃縮，即分別可得式ⅱ、式ⅲ、式ⅳ化合物。

步驟a)中所述甲醇水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50～95％，每次提取所加入的甲醇水溶液的重量為原料重量的6～10倍。

步驟c)中制備液相色譜柱分離時(shí)，采用體積比為50:50的乙腈-水進(jìn)行洗脫。

本發(fā)明所述的甾體類化合物可作為活性成分用于制備預(yù)防和/或治療急性心衰的藥物。

本發(fā)明所述藥物的劑型不限，只要是能夠使活性成分有效地到達(dá)體內(nèi)的劑型都可以，例如可選自：片劑、膠囊劑、粉末、顆粒劑、糖漿、溶液、懸浮液、注射劑、酊劑、口服液、氣霧劑、口含劑、沖劑、丸劑、散劑等常見劑型或納米制劑等緩釋劑型。

本發(fā)明所述藥物中，除了含有主要活性成分之外，還可含有少量的且不影響有效成分的次要成分和/或藥學(xué)上可接受的載體，例如：可以含有甜味劑以改善口味、抗氧化劑以防止氧化，以及各種制劑所必要的輔料等。

本發(fā)明所述活性成分的有效施用劑量可隨所用的組合物、給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。

本發(fā)明中所述術(shù)語的定義如下：

術(shù)語“c1-c12烷基”是指具有1-12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或環(huán)烷基，例如：甲基、亞甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基，或類似基團(tuán)。

術(shù)語“c2-c12烯基”是指具有2-6個(gè)碳原子的、具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈的烯基或環(huán)烯基，例如：乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、1,3-環(huán)己二烯基、1,4-環(huán)己二烯基、或類似基團(tuán)。

術(shù)語“c2-c12炔基”是指具有2-12個(gè)碳原子的、具有一個(gè)或多個(gè)三鍵的直鏈或支鏈的炔基，例如：乙炔基、丙炔基、或類似基團(tuán)。

術(shù)語“c6～c30芳基”是指具有6～30個(gè)碳原子的芳基，包括單環(huán)或二環(huán)芳基，例如：苯基、萘基、或類似基團(tuán)。

術(shù)語“c1～c30雜芳基”是指具有1～30個(gè)碳原子的雜芳基，例如：吡咯基、吡啶基、呋喃基、或類似基團(tuán)。

術(shù)語“取代”是指基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)氫原子被選自下組的取代基取代：c1～c10烷基、c3～c10環(huán)烷基、c1～c10烷氧基、鹵素、羥基、羧基(-cooh)、c1～c10醛基、c2～c10?；2～c10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3個(gè)取代基的取代苯基，所述的取代基選自鹵素、c1-c10烷基、氰基、oh、硝基、c3～c10環(huán)烷基、c1～c10烷氧基或氨基。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指所述化合物與藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸所形成的鹽，所述的無機(jī)酸包括：鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有機(jī)酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亞細(xì)亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。

術(shù)語“互變異構(gòu)體”是指因分子中某一原子在兩個(gè)位置迅速移動(dòng)而產(chǎn)生的官能團(tuán)異構(gòu)體，例如：烯醇與相應(yīng)的酮。

術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體，例如：順反異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體等。

術(shù)語“前體化合物”是指在體外無活性，但能夠在生物體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的活性成分，從而發(fā)揮其藥理作用的化合物。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指適用于人而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果：

本發(fā)明的研究結(jié)果顯示：本發(fā)明所述的具有通式ⅰ結(jié)構(gòu)的甾體類化合物c10上的h被過氧化氫基團(tuán)取代，可顯著增加蛙心的心肌張力，具有顯著的強(qiáng)心作用，并且細(xì)胞毒性較弱，高效低毒，可望作為活性成分用于制備預(yù)防和/或治療急性心衰的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實(shí)施例4中各化合物對(duì)蛙心張力的影響效果圖；

圖2是實(shí)施例5中各化合物對(duì)正常人體肝細(xì)胞毒性的影響效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1：式ⅱ化合物的制備

a)以蟾酥干漿2kg為原料，加8倍量95wt％甲醇水溶液，進(jìn)行回流提取3次，每次2小時(shí)；合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得流浸膏；將所得流浸膏混懸于水中，以二氯甲烷萃取至萃取液無色；合并萃取液，減壓濃縮至浸膏，得到粗提物；

b)將粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，依次以體積比為10:10:1、8:8:1、6:6:1、4:4:1、2:2:1、1:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每份洗脫液減壓蒸發(fā)后經(jīng)tlc薄層分析，按洗脫順序得到八個(gè)組分，記為fr.e1～e8；

c)對(duì)第二組分fr.e2進(jìn)行制備液相色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈：水＝50:50，流速為40ml/min，tlc薄層分析，收集收集保留時(shí)間為7min的峰，濃縮，得到白色粉末狀化合物。

所得化合物的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

hr-ei-msm/z:402.2124[m]⁺,(calcdforc23h30o6,402.2115)；

uv(meoh)λmaxnm:299；

¹hnmr(600mhz,meod)δh:7.89(1h,dd,j＝9.7,2.3hz,h-22)，7.43(1h,d,j＝2.3hz,h-21)，6.25(1h,d,j＝9.7hz,h-23)，3.99(1h,s,h-3)，3.57(1h,brs,h-15)，2.58(1h,m,h-5)，2.56(1h,m,h-17)，2.39(1h,m,h-16)，2.26(2h,m,h-1)，2.14(1h,m,h-8)，1.98(1h,m,h-6)，1.91(1h,s,h-16)，1.88(1h,t,j＝5.3hz,h-4),1.83(1h,m,h-9)，1.70(1h,m,h-2)，1.66(1h,m,h-12)，1.61(1h,m,h-11)，1.61(1h,m,h-7)，1.54(1h,m,h-11)，1.53(1h,m,h-4)，1.46(1h,m,h-12)，1.28(1h,m,h-2)，1.15(1h,m,h-6)，1.04(1h,m,h-7)，0.76(1h,s,h-18)；

¹³cnmr(126mhz,meod)δc:164.48(c-24)，151.74(c-21)，149.58(c-22)，124.52(c-20)，115.35(c-23)，85.08(c-10)，75.62(c-14)，66.65(c-3)，61.13(c-15)，48.54(c-17),46.12(c-13)，41.54(c-9)，39.95(c-12)，35.89(c-4)，34.49(c-8)，33.23(c-16)，31.09(c-5)，30.46(c-2)，26.31(c-6)，24.16(c-1)，21.45(c-7)，21.45(c-11)，17.01(c-18)；

根據(jù)上述數(shù)據(jù)可確定所得化合物即為式ⅱ化合物。

實(shí)施例2：式?；衔锏闹苽?/p>

a)以蟾酥干漿2kg為原料，加8倍量60wt％甲醇水溶液，進(jìn)行回流提取3次，每次2小時(shí)；合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得流浸膏；將所得流浸膏混懸于水中，以二氯甲烷萃取至萃取液無色；合并萃取液，減壓濃縮至浸膏，得到粗提物；

b)將粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，依次以體積比為10:10:1、8:8:1、6:6:1、4:4:1、2:2:1、1:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每份洗脫液減壓蒸發(fā)后經(jīng)tlc薄層分析，按洗脫順序得到八個(gè)組分，記為fr.e1～e8；

c)對(duì)第二組分fr.e2進(jìn)行制備液相色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈：水＝50:50，流速為40ml/min，tlc薄層分析，收集收集保留時(shí)間為4min的峰，濃縮，得到白色粉末狀化合物。

所得化合物的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

hr-ei-msm/z:418.1992[m]⁺,(calcdforc23h30o7,418.1988)；

uv(meoh)λmaxnm:299；

¹hnmr(600mhz,meod)δh:8.12(1h,dd,j＝9.7,2.3hz,h-22)，7.43(1h,d,j＝2.3hz,h-21)，6.18(1h,d,j＝9.7hz,h-23)，4.51(brs,1h,h-16)，4.05(1h,s,h-3)，3.57(1h,brs,h-15)，2.74(1h,m,h-17)，2.60(1h,m,h-5)，2.26(1h,m,h-1)，1.91(1h,m,h-2)，1.89(1h,m,h-4)，1.88(1h,m,h-6)，1.84(1h,m,h-7)，1.83(1h,m,h-9)，1.73(1h,m,h-1)，1.70(1h,m,h-2)，1.70(1h,m,h-4)，1.63(1h,m,h-6)，1.61(1h,m,h-11)，1.58(1h,m,h-8)，1.54(1h,m,h-11)，1.36(1h,m,h-12)，1.31(1h,m,h-7)，1.06(1h,m,h-12)，0.77(1h,s,h-18)；

¹³cnmr(126mhz,meod)δc:165.10(c-24)，152.93(c-21)，151.74(c-22)，120.50(c-20)，112.86(c-23)，85.42(c-10)，75.61(c-14),73.42(c-16)，66.65(c-3)，61.11(c-15)，59.54(c-17)，50.42(c-13)，42.94(c-8)，41.54(c-9)，37.43(c-12)，35.89(c-4)，34.70(c-5)，30.78(c-2)，28.53(c-6)，27.85(c-1)，21.45(c-7)，22.,34(c-11)，17.31(c-18)；

根據(jù)上述數(shù)據(jù)可確定所得化合物即為式ⅲ化合物。

實(shí)施例3：式ⅳ化合物的制備

a)以蟾酥干漿2kg為原料，加8倍量60wt％甲醇水溶液，進(jìn)行回流提取3次，每次2小時(shí)；合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得流浸膏；將所得流浸膏混懸于水中，以二氯甲烷萃取至萃取液無色；合并萃取液，減壓濃縮至浸膏，得到粗提物；

b)將粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，依次以體積比為10:10:1、8:8:1、6:6:1、4:4:1、2:2:1、1:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每份洗脫液減壓蒸發(fā)后經(jīng)tlc薄層分析，按洗脫順序得到八個(gè)組分，記為fr.e1～e8；

c)對(duì)第二組分fr.e2進(jìn)行制備液相色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈：水＝50:50，流速為40ml/min，tlc薄層分析，收集收集保留時(shí)間為9min的峰，濃縮，得到白色粉末狀化合物。

所得化合物的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

hr-ei-msm/z:460.2090[m]⁺,(calcdforc25h32o8,460.2085)；

uv(meoh)λmaxnm:299；

¹hnmr(600mhz,meod)δh:8.02(1h,dd,j＝9.7,2.3hz,h-22)，7.36(1h,d,j＝2.3hz,h-21)，6.23(1h,d,j＝9.7hz,h-23)，5.48(dd,j＝9.3,1.1hz,1h,h-16)，4.05(1h,brs,h-3)，3.73(1h,brs,h-15)，2.91(1h,m,h-17)，2.82(1h,m,h-5)，2.05(1h,m,h-1)，1.99(1h,m,h-2)，1.91(1h,m,h-4)，1.81(1h,m,h-6)，1.77(1h,m,h-7)，1.74(1h,m,h-11)，1.63(1h,m,h-12)，1.58(1h,m,h-1)，1.55(1h,m,h-2),1.52(1h,m,h-4)，1.,50(1h,m,h-6)，1.50(1h,m,h-7)，1.36(1h,m,h-11)，1.30(1h,m,h-8)，1.07(1h,m,h-12)，1.85(1h,s,h-26)，0.77(1h,s,h-18)；

¹³cnmr(126mhz,meod)δc:171.61(c-25)，164.07(c-24)，153.53(c-21)，150.94(c-22)，118.40(c-20)，114.08(c-23)，85.42(c-10)，76.61(c-14),73.47(c-16)，67.61(c-3)，60.81(c-15)，51.43(c-17)，46.36(c-13)，40.69(c-12)，40.28(c-8)，37.43(c-9)，36.52(c-5)，34.51(c-4)，30.67(c-2)，28.48(c-6)，26.94(c-1)，22.09(c-11)，21.62(c-7)，20.36(c-26)，17.50(c-18)；

根據(jù)上述數(shù)據(jù)可確定所得化合物即為式ⅳ化合物。

實(shí)施例4：考察本發(fā)明所述甾體類化合物對(duì)離體蛙心灌流模型心肌張力的藥效

4.1實(shí)驗(yàn)儀器：

rm6240多道信號(hào)采集處理系統(tǒng)：成都儀器廠；蛙類手術(shù)器械1套(粗剪刀、直剪刀、和眼科剪刀各一把，大小鑷子各一把，玻璃分針2根，探針1個(gè))；蛙板1塊，大小燒杯各1個(gè)，滴管2個(gè)，蛙心套管1個(gè)，0號(hào)手術(shù)線；蛙心夾：上海中醫(yī)藥大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供。

4.2實(shí)驗(yàn)方法：

中華大蟾蜍共40只，采用動(dòng)脈插管法(又名straub插管法)制備蛙心標(biāo)本，取蟾蜍1只，破壞腦和脊髓，以四肢軟癱為度；仰臥位固定于蛙板上，用剪刀暴露心臟；用玻璃分針撥動(dòng)心臟，改變其位置，認(rèn)真識(shí)別左、右心房、心室(蟾餘一個(gè)心室)、動(dòng)脈圓錐、腹側(cè)主動(dòng)脈干及其左右分支、靜脈竇、前后靜脈等主要組織結(jié)構(gòu)，觀察心室在收縮時(shí)容積的變化；將插管內(nèi)充入任氏液，進(jìn)行插管：將插管插入動(dòng)脈球，插管中的液面隨蛙心搏動(dòng)而上下波動(dòng)；蛙心插管進(jìn)入心室后，用預(yù)先準(zhǔn)備好的松結(jié)扎緊，扎線套在蛙心插管的側(cè)鉤上打結(jié)并固定；剪斷主動(dòng)脈左右分支，立即用吸管吸去管中的血液換成任氏液以免凝血；用新鮮任氏液反復(fù)換洗蛙心插管內(nèi)含血的任氏液，直至蛙心插管內(nèi)無血液殘留為止，此時(shí)離體蛙心己制備成功可供實(shí)驗(yàn)；將蛙心插管固定在鐵支架上，用蛙心夾在心室舒張期夾住心尖，并將蛙心夾的線頭通過滑輪連至張力換能器的應(yīng)變梁上，調(diào)節(jié)此線張力至1g，插管內(nèi)加灌流約1-1.5ml，并在插管上標(biāo)記灌流的高度，在此后的實(shí)驗(yàn)過程中，灌流液恒定于該高度；將制備好的蛙心與張力換能器一端連接，另一端張力換能器連接輸出線接微機(jī)生物信號(hào)處理系統(tǒng)第1通道，微機(jī)生物信號(hào)處理系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置:rm6240系統(tǒng):點(diǎn)擊“實(shí)驗(yàn)”菜單，選擇“生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)中”的“蛙心灌流”項(xiàng)目，系統(tǒng)進(jìn)入該實(shí)驗(yàn)信號(hào)記錄狀態(tài)；計(jì)算加藥前后收縮幅度(g)比值(加藥后收縮幅度基/礎(chǔ)收縮幅度)，用d/f表示。

4.3藥物處理：

鹽酸腎上腺素陽性藥對(duì)照組：將腎上腺素藥物1mg/ml取10μl溶解于200μl的任氏液中，使其在插管中的終濃度為5μg/ml。

式ⅱ化合物組：將實(shí)施例1制備的式ⅱ化合物溶解于dmso中，取10μl含dmso的含藥液用任氏液稀釋，并至其在插管中的終濃度，分別為1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml。

蟾毒靈陰性對(duì)照組：將一定量已知化合物蟾毒靈溶解于dmso中，取10μl含dmso的含藥液用任氏液稀釋，并至其在插管中的終濃度分別為低、中、高三個(gè)濃度。

華蟾毒它靈組：將一定量已知化合物蟾毒靈溶解于dmso中，取10μl含dmso的含藥液用任氏液稀釋，并至其在插管中的終濃度分別為低、中、高三個(gè)濃度。

脂蟾毒配基組：將一定量已知化合物蟾毒靈溶解于dmso中，取10μl含dmso的含藥液用任氏液稀釋，并至其在插管中的終濃度分別為低、中、高三個(gè)濃度。

空白對(duì)照組：在插管中給予與含藥液相等的任氏液。

4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示。

表1各化合物對(duì)蛙心張力的影響(n＝9,x±s)

圖1是本實(shí)施例中各化合物對(duì)蛙心張力的影響效果圖，圖中：control是指空白對(duì)照組，dl-1是指1μg/ml劑量組的蟾毒靈，dl-2是指2μg/ml劑量組的蟾毒靈，dl-3是指3μg/ml劑量組的蟾毒靈，zc-1是指1μg/ml劑量組的脂蟾毒配基，zc-2是指2μg/ml劑量組的脂蟾毒配基，zc-3是指3μg/ml劑量組的脂蟾毒配基，htl-1是指1μg/ml劑量組的華蟾毒它靈，htl-2是指2μg/ml劑量組的華蟾毒它靈，htl-3是指3μg/ml劑量組的華蟾毒它靈，式-1是指1μg/ml劑量組的式ⅱ化合物，式-2是指2μg/ml劑量組的式ⅱ化合物，式-3是指3μg/ml劑量組的式ⅱ化合物。

從表1和圖1可見，本發(fā)明的式ⅱ化合物高劑量組(3μg/ml)可以顯著增加蛙心的心肌張力(****p<0.0001，具有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，具有顯著的強(qiáng)心作用，可望作為活性成分用于制備預(yù)防和/或治療急性心衰的藥物，并且其作用效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的用來治療心力衰竭的藥物：蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基，這說明，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)取得了顯著性進(jìn)步和出乎意料的效果。

實(shí)施例5：考察本發(fā)明所述甾體類化合物對(duì)人肝細(xì)胞l02毒性的影響

4.1肝細(xì)胞培養(yǎng)：

將購自中科院細(xì)胞庫的l02細(xì)胞置于ph7.2～7.4的含10％新生牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長，待細(xì)胞鋪滿瓶底的70％～80％時(shí)用0.25％胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代；液氮凍存；取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

5.2mtt比色法測細(xì)胞抑制率：

將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，經(jīng)1000r/min離心5min后傾去消化液，加入培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml；在96孔板上每孔加入100μl細(xì)胞懸液，再加入培養(yǎng)液使每孔體積為200μl；將培養(yǎng)板放回孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；24h后觀察到細(xì)胞貼壁即倒掉舊培養(yǎng)液，加入含本化合物的培養(yǎng)液；調(diào)整藥物劑量使實(shí)驗(yàn)組藥物終濃度分別為3、6、12.5、25、50mmol/l，陽性組中加cisplatin(順鉑)10μm；另外設(shè)立空白組(僅有培養(yǎng)液，無細(xì)胞)，模型組(不加藥與給藥組等量的dmso)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；分別于加入藥物后72h終止培養(yǎng)，加入20μl濃度為5mg/ml的mtt溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)；每孔中加入150μldmso振蕩后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570nm波長時(shí)各孔吸光度(absorbance,a)值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率(inhibitoryrate,ir):ir＝(對(duì)照孔a值-實(shí)驗(yàn)孔a值)/對(duì)照孔a值×100％。

5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖2所示。

表2各化合物對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞生長抑制率

由表2可見：本發(fā)明的式ⅱ化合物對(duì)正常人體肝細(xì)胞的抑制率要明顯低于傳統(tǒng)的用來治療心力衰竭的藥物：蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基，進(jìn)而說明本發(fā)明的式ⅱ化合物對(duì)正常人體肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性要低于傳統(tǒng)的用來治療心力衰竭的藥物：蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基。

圖2是本實(shí)施例中各化合物對(duì)正常人體肝細(xì)胞毒性的影響效果圖，圖中，control是指空白對(duì)照組，dl-1是指3mmol/l濃度組的蟾毒靈，dl-1右面的四個(gè)柱狀圖從左到右依次是6、12.5、25、50mmol/l濃度組的蟾毒靈，zc-1是指3mmol/l濃度組的脂蟾毒配基，zc-1右面的四個(gè)柱狀圖從左到右依次是6、12.5、25、50mmol/l濃度組的脂蟾毒配基，htl-1是指3mmol/l濃度組的華蟾毒它靈，htl-1右面的四個(gè)柱狀圖從左到右依次是6、12.5、25、50mmol/l濃度組的華蟾毒它靈，式-1是指3mmol/l濃度組的式ⅱ化合物，式-1右面的四個(gè)柱狀圖從左到右依次是6、12.5、25、50mmol/l濃度組的式ⅱ化合物。

由圖2可見，與對(duì)照組蟾毒靈、順鉑相比，本發(fā)明的式ⅱ化合物細(xì)胞毒性弱，尤其是高濃度(50mmol/l)時(shí)，式ⅱ化合物對(duì)正常人體肝細(xì)胞毒性要明顯低于蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基。

綜上所述，本發(fā)明的甾體類化合物可以顯著促進(jìn)蛙心張力，具有顯著的強(qiáng)心作用，作用效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的用來治療心力衰竭的藥物：蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基，同時(shí)其對(duì)正常人體肝細(xì)胞毒性要明顯低于蟾毒靈、華蟾毒它靈、脂蟾毒配基，高效低毒，可望作為活性成分用于制備預(yù)防和/或治療急性心衰的藥物。

最后需要在此指出的是：以上僅是本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施例，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。