本發(fā)明涉及一種植物甾醛類(lèi)物質(zhì)的分離精制方法，尤其涉及用大孔吸附樹(shù)脂色譜分離和低溫結(jié)晶法，從植物甾醇發(fā)酵液的結(jié)晶母液濃縮浸膏中，分離精制植物甾醛類(lèi)物質(zhì)的工藝。屬植物甾醇發(fā)酵液中生化分離甾醛類(lèi)物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物甾醇發(fā)酵得到雄烯二酮（簡(jiǎn)稱(chēng)4ad）的過(guò)程中，會(huì)有一些有用的副產(chǎn)物的產(chǎn)生；發(fā)酵液在分離主要產(chǎn)品雄烯二酮之后，結(jié)晶母液中還含有某些具有很高應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)物，如植物甾醛類(lèi)化合物（簡(jiǎn)稱(chēng)ba），約含19%（見(jiàn)附圖1），如直接舍棄，不僅是對(duì)資源的浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

ba全稱(chēng)bisnorcholenaldehyde，目前暫無(wú)公認(rèn)的中文譯名，其結(jié)構(gòu)如下式所示，因其結(jié)構(gòu)含有甾核和醛基，所以將其歸為植物甾醛類(lèi)化合物。

ba是合成黃體酮過(guò)程中一種重要中間體，近年來(lái)有專(zhuān)利提出ba在1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯，水合醋酸銅和2，2’-聯(lián)吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)制備黃體酮，具有產(chǎn)品收率高，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。而此工藝的快速發(fā)展將促使ba的需求量急劇增長(zhǎng)。

ba是合成黃體酮過(guò)程中一種重要中間體，黃體酮在臨床上具有非常重要的用途，可以治療由于黃體功能不全引起的先兆性流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)等癥。此外，黃體酮還是皮質(zhì)激素、雄激素和雌激素的前體，是合成一切類(lèi)固醇激素的中間產(chǎn)物，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的黃體酮有機(jī)合成方法步驟多、收率低、成本高；因此，黃體酮的價(jià)格一直居高不下，而ba作為合成黃體酮過(guò)程中一種重要中間體，高純度ba的價(jià)格也很高。

目前有學(xué)者提出以植物甾醇發(fā)酵產(chǎn)物（20s）-20-羥甲基孕-4-烯-3-酮為原料合成黃體酮的工藝，此方法不僅要先從植物發(fā)酵產(chǎn)物中提取高純度（20s）-20-羥甲基孕-4-烯-3-酮，而且要用二甲基硫醚和n-氯代丁二酰亞胺的混合物將其氧化得到ba，然后在1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯，水合醋酸銅和2，2’-聯(lián)吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)制備黃體酮。此工藝中獲得ba的純度和收率都會(huì)降低，得到的ba的結(jié)構(gòu)也有可能發(fā)生改變。因此，從發(fā)酵液中直接提取ba做為黃體酮的合成原料更加經(jīng)濟(jì)可行。在上個(gè)世紀(jì)80年代中期，就有日本學(xué)者提出用酸性亞硫酸鹽處理植物甾醛類(lèi)物質(zhì)，然后用離子交換樹(shù)脂分離得到高純度的植物甾醛類(lèi)化合物單體，純度可以達(dá)到95%。該工藝的主要不足在于：1.植物甾醛類(lèi)化合物在經(jīng)過(guò)衍生化和還原之后，化學(xué)結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生較大的改變；2.純度不夠高，無(wú)法達(dá)到工業(yè)合成的純度需求，同時(shí)也加重了后續(xù)分離純化工藝的壓力。傳統(tǒng)可用于非極性化合物（植物甾醛類(lèi)化合物也屬于非極性化合物）的分離方法還有硅膠層析，但硅膠分離工藝存在一些明顯的不足之處：1.使用大量有機(jī)溶劑，易對(duì)環(huán)境會(huì)造成污染；2.硅膠可重復(fù)使用性不高，增加生產(chǎn)成本；3.結(jié)晶母液濃縮浸膏含量較低，使用硅膠分離處理量少；4.硅膠層析工藝條件波動(dòng)較大，難以控制。

甾體類(lèi)激素作為僅次于抗生素的第二大藥物，一直以來(lái)由于生產(chǎn)成本及提取工藝等問(wèn)題制約，市場(chǎng)需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：提供一種工藝路線簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉、符合環(huán)保要求；所得產(chǎn)品純度高，符合醫(yī)藥行業(yè)黃體酮合成需求的ba純化精制技術(shù)方案。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：以ba含量約為19%的植物甾醇發(fā)酵液結(jié)晶母液濃縮浸膏為生產(chǎn)原料，經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂層析初步純化后，洗脫液洗脫、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥、再冷卻結(jié)晶，獲得純度大于98.5%的ba的工藝路線。

一種植物甾醛類(lèi)化合物的分離提純方法，包括對(duì)植物甾醇發(fā)酵液的結(jié)晶母液濃縮浸膏，用大孔吸附樹(shù)脂色譜分離和低溫結(jié)晶法提純，其特征在于：依次包括下述步驟：

1）取骨架結(jié)構(gòu)為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂，大部濕法裝柱；

2）以植物甾醇發(fā)酵液的結(jié)晶母液濃縮液浸膏為原料，用少量低碳醇完全溶解，過(guò)濾去雜；濾液中再加入步驟1）預(yù)留的少量大孔吸附樹(shù)脂，拌勻并旋去溶劑后小心加到步驟1）所述大孔吸附樹(shù)脂柱的頂層，干法上樣；

所述低碳醇為甲醇、乙醇或異丙醇；

3）大孔吸附樹(shù)脂柱層析，先以低濃度的乙醇水溶液淋冼除雜，再用高濃度乙醇水溶液洗脫；所述低濃度乙醇水溶液的體積百分比濃度為40%～60%，所述高濃度乙醇水溶液的體積百分比濃度為70%～100%；

4）步驟3）所述洗脫液在65℃以下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)溶劑，再由乙腈、甲醇、水混合液溶解，置于-15～5℃低溫下冷卻結(jié)晶；所述的乙腈、甲醇、水混合液的比例為（15～20）︰3︰1

進(jìn)一步的，所述的大孔吸附樹(shù)脂是苯乙烯-二乙烯苯骨架結(jié)構(gòu)的hz-816、hz-818、hz-826、hz801。

進(jìn)一步的，所述的大孔吸附樹(shù)脂，其規(guī)格為50～80目或80～120目。

本發(fā)明的積極效果是：1.工藝路線簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化放大；2.所得產(chǎn)品純度高，達(dá)98.5%以上，符合醫(yī)藥行業(yè)需求；3.由于大孔吸附樹(shù)脂可以再生使用，過(guò)程中使用的溶劑主要為低碳醇和水溶液，所以生產(chǎn)成本低廉；4.ba的市場(chǎng)價(jià)值較高，而原料為植物甾醇提取4ad后廢棄的結(jié)晶母液濃縮浸膏，使得資源再利用，同時(shí)提高企業(yè)利潤(rùn)；5.工藝過(guò)程無(wú)污染，無(wú)廢水，符合環(huán)保要求。本發(fā)明的實(shí)施對(duì)于甾體類(lèi)藥物的生產(chǎn)發(fā)展具有推動(dòng)作用，對(duì)企業(yè)擁有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)社會(huì)醫(yī)療保障具有很大的積極意義。

附圖說(shuō)明

圖1為結(jié)晶母液濃縮浸膏高效液相色譜圖；

圖2為純化后產(chǎn)品的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所用的原料為植物甾醇經(jīng)分歧桿菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液，再經(jīng)萃取、結(jié)晶等步驟提取雄烯二酮（簡(jiǎn)稱(chēng)4ad）之后的結(jié)晶母液濃縮浸膏，其高效液相色譜圖圖1。由圖可見(jiàn)發(fā)酵液在分離主要產(chǎn)品雄烯二酮之后，結(jié)晶母液中還含有某些具有很高應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)物，如植物甾醛類(lèi)化合物（簡(jiǎn)稱(chēng)ba），約含19%。如直接舍棄，不僅是對(duì)資源的浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。實(shí)施例中所用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型號(hào)為bc-r205c，所用的高效液相為agilent1100，檢測(cè)條件如下：柱溫箱溫度為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；色譜柱為安捷倫c184.6×100mm，3.5μm色譜柱；流動(dòng)相為甲醇∶水（65:35），流速為1ml/min。實(shí)施例中釆用的大孔吸附樹(shù)脂是指上海華震科技有限公司產(chǎn)品hz-816、hz-818、hz-826、或hz801，規(guī)格為50～80目或80～120目。

實(shí)施例1：

取30ml50目-80目的hz-816型大孔吸附樹(shù)脂，預(yù)留4ml樹(shù)脂，其余采用濕法裝柱，倒入樹(shù)脂柱中。取1.5g濃縮浸膏，使用少量無(wú)水乙醇（5ml）溶解至完全，過(guò)濾，加入預(yù)留的4ml樹(shù)脂，揮發(fā)溶劑后采用干法上樣。使用14倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脫除去雜質(zhì)，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脫得到含ba的洗脫液。將洗脫液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁熱過(guò)濾，置于0℃條件下濃縮結(jié)晶。過(guò)濾，用冷的結(jié)晶體系清洗2-3次。得到0.15g高純度純品，經(jīng)高效液相測(cè)定其含量為98.6%。

實(shí)施例2：

取30ml80目-120目的hz-826型大孔吸附樹(shù)脂，預(yù)留3ml樹(shù)脂，其余采用濕法裝柱倒入樹(shù)脂柱中。取1.5g濃縮浸膏，使用少量無(wú)水乙醇（5ml）溶解至完全，過(guò)濾，加入剩余的3ml樹(shù)脂，揮發(fā)溶劑后采用干法上樣。使用13倍50%乙醇溶液，以1ml/min的流速洗脫除去雜質(zhì)，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脫得到含ba的洗脫液。將洗脫液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙腈-甲醇-水（15:3:1）溶解，趁熱過(guò)濾，置于4℃條件下濃縮結(jié)晶。過(guò)濾，用冷的結(jié)晶體系清洗2-3次。得到0.16g高純度純品，經(jīng)高效液相測(cè)定其含量為98.8%。

實(shí)施例3：

取50ml50目-80目的hz-826大孔吸附樹(shù)脂，采用濕法裝柱，剩余5ml樹(shù)脂，其余倒入樹(shù)脂柱中。取2.5g濃縮浸膏，使用少量無(wú)水乙醇（5ml）溶解至完全，過(guò)濾，加入剩余的5ml樹(shù)脂，揮發(fā)溶劑后采用干法上樣。使用13倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脫除去雜質(zhì)，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脫得到含ba的洗脫液。將洗脫液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙腈-甲醇-水（17:3:1）溶解，趁熱過(guò)濾，置于-10℃條件下濃縮結(jié)晶。過(guò)濾，用冷的結(jié)晶體系清洗2-3次。得到0.18g高純度純品，經(jīng)高效液相測(cè)定其含量為98.5%。

實(shí)施例4：

取50ml80目-120目的hz-816大孔吸附樹(shù)脂，采用濕法裝柱，剩余3ml樹(shù)脂，其余倒入樹(shù)脂柱中。取2.5g濃縮浸膏，使用少量無(wú)水乙醇（5ml）溶解至完全，過(guò)濾，加入剩余的3ml樹(shù)脂，揮發(fā)溶劑后采用干法上樣。使用18倍50%乙醇溶液，以2.5ml/min的流速洗脫除去雜質(zhì)，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脫得到含ba的洗脫液。將洗脫液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁熱過(guò)濾，置于4℃條件下濃縮結(jié)晶。過(guò)濾，用冷的結(jié)晶體系清洗2-3次。得到0.11g高純度純品，經(jīng)高效液相測(cè)定其含量為99.0%。

實(shí)施例5：

取50ml80目-120目的hz801型大孔吸附樹(shù)脂，預(yù)留5ml樹(shù)脂，其余采用濕法裝柱倒入樹(shù)脂柱中。取2.5g濃縮浸膏，使用少量無(wú)水乙醇（5ml）溶解至完全，過(guò)濾，加入剩余的5ml樹(shù)脂，揮發(fā)溶劑后采用干法上樣。使用8倍50%乙醇溶液，以0.5ml/min的流速洗脫除去雜質(zhì)，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脫得到含ba的洗脫液。將洗脫液在65℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁熱過(guò)濾，置于-20℃條件下濃縮結(jié)晶。過(guò)濾，用冷的結(jié)晶體系清洗2-3次。得到0.23g高純度純品，經(jīng)高效液相測(cè)定其含量為98.9%。