專利名稱：一種測定蜂膠中β-葡萄糖苷酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬蜂膠中有效成分測定，涉及一種測定蜂膠中p-葡萄糖苷酶活性的方法。
背景技術(shù)：
蜂膠是蜜蜂從植物幼芽、樹皮與樹干裂縫上采集樹脂，并混入其上顎腺分 泌物和蜂蠟等加工而成的具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜， 含有黃酮類化合物、酸、醇、酚、醛、酯、醚類以及烯、萜、甾類化合物和多 種氨基酸、脂肪酸、酶類、維生素和多種微量元素。在這些化學(xué)成分中，由于 黃酮類化合物含量高，生物學(xué)活性強，因此有關(guān)蜂膠中黃酮類化合物提取和功 效的研究成為熱點。
黃酮類化合物在自然界中多數(shù)以黃酮苷的形式存在，只有極少量的以游離 黃酮苷元的形式存在。雖然天然存在的游離黃酮苷元含量極少，但其表現(xiàn)出來 的活性要比結(jié)合型的糖苷高很多。而蜂膠中的已分離鑒定出的黃酮類化合物大 都以游離黃酮苷元形式存在，多數(shù)人認(rèn)為是蜜蜂在采集蜂膠的過程中加入了自 身分泌物，使黃酮苷水解成黃酮苷元。黃酮苷元可以直接被吸收進(jìn)入動物血液， 大部分糖苷型的黃酮化合物在人體內(nèi)不能通過小腸壁進(jìn)入到血液中，而是被腸 腔內(nèi)微生物通過雜環(huán)裂解方式降解和代謝，其中僅有小部分黃酮苷在結(jié)腸內(nèi)益 生菌(乳酸菌和雙歧桿菌)分泌的水解酶的作用下，產(chǎn)生苷元再重新吸收進(jìn)入血 液。因此，黃酮苷在動物體內(nèi)的生物利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于苷元型黃酮。研究表明， 黃酮苷元清除人體氧自由基的生物活性明顯優(yōu)于黃酮糖苷，黃酮苷元的效價是
黃酮糖苷效價的7倍。
天然存在的黃酮苷基本上都是卩-D-葡萄糖苷，因此，蜜蜂很可能在采集蜂 膠的過程中加入了 P-D-葡萄糖苷酶。目前，還沒有蜂膠中P-D-葡萄糖苷酶研究 的相關(guān)報道，為了證實該酶的存在，必須建立蜂膠中(3-D-葡萄糖苷酶提取鑒定 的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定蜂膠中P-D-葡萄糖苷酶活性的方法，本發(fā)明 采用分光光度法對蜂膠中P-D-葡萄糖苷活性進(jìn)行測定。通過對蜂膠中該酶提取
3條件及影響該酶活力參數(shù)的考察，確定測定蜂膠中該酶活性的基本條件。其原 理為卩-D-葡萄糖苷酶催化對硝基苯-P-D-葡萄糖苷水解反應(yīng)，生成物對硝基苯
酚在400 420 nm可見光范圍內(nèi)有特征吸收峰，可通過測定一定時間內(nèi)(3-D-葡萄糖苷酶將一定量的底物水解成對硝基苯酚的量的多少來確定酶活性的強 弱。
本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)
(1) 粗酶提取將蜂膠樣本冷凍，然后將蜂膠搗碎，過30目篩，取3.0g 蜂膠粉末加入pH值4.5 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，然后加入0.3 0.9 g 不溶性聚乙烯毗咯垸酮(PVPP)及少許石英砂，在冰浴上研磨成糊狀，低溫 高速離心，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，二次低溫高速離心，取上清液定容 至25mL即為粗酶提取液；
(2) 酶促反應(yīng)取兩只試管，分別加入0.5mL粗酶液，0.5mL底物濃度 5 40 mmol/L的對硝基苯酚p-D-葡萄糖苷，其中一只試管在30 60'C下溫育 1.5 h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5mLlMNa2C03終止反應(yīng)， 另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在100。C水浴中加熱5 min使酶滅活， 然后加入1 MNa2C03終止反應(yīng)；
(3) 活性測定用分光光度計在400nm處測定對硝基苯酚的吸光度，從 而確定該酶的活性。
卩-D-葡萄糖苷酶活力單位每分鐘催化形成一個微摩爾對硝基苯酚所需要 的酶量為一個酶活力單位。蜂膠中(3-D-葡萄糖苷酶活力為每克蜂膠具有的酶活 力單位(unit/g)。計算公式如下
卩-0-葡萄糖苷酶活力=#><" 「
式中A為對硝基苯酚的摩爾量(Kimol/L) V為酶液量(mL) n為酶液稀釋倍數(shù) t為反應(yīng)時間(min)
本發(fā)明方法通過對蜂膠中該酶提取條件及影響該酶活力參數(shù)的考察，確定 測定蜂膠中該酶活性的基本條件。該方法的建立，首次證實蜂膠中確定含有 卩-D-葡萄糖苷酶，這說明蜜蜂確實在采膠的過程中加入了該酶，使蜂膠的藥理 活性得以加強。同時，通過測定P-D-葡萄糖苷酶活力的方法，可以從成分及藥 理活性的角度區(qū)分蜂膠與其膠源植物的差別。因此，可以在原料蜂膠的層面上區(qū)分真假蜂膠，為蜂膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。本發(fā)明的方法具有簡便，靈敏度 高，檢測成本低等優(yōu)點，由于蜂膠中酶的相關(guān)研究還未見報道，因此，該方法 在蜂膠中卩-D-葡萄糖苷酶的提取及活力測定上具有創(chuàng)新性。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步的說明。
實施例1
取不同產(chǎn)地(平湖、紹興、江山)蜂膠各3.0g，溶于25 mL pH 6.0磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，加入0.9gPVPP，少許石英砂，在冰浴上研磨至糊狀， 10000g4 。C離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，14000 g 4 。C離心30 min取上清液定容至25mL。取兩只試管，分別加入0.5 mL粗酶液，0.5 mL 25 mmol/L底物濃度的對硝基苯酚(3-D-葡萄糖苷，其中一只試管在37"C設(shè)定的條 件下溫育1.5h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5mLlMNa2C03 終止反應(yīng)。另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在10(TC水浴中加熱5 min 使酶滅活，然后加入lMNa2C03終止反應(yīng)。用分光光度計在400nm處測定對 硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
測定結(jié)果平湖蜂膠吸光度為0.172，計算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力為 0.0420 unit/g;紹興蜂膠吸光度為0.160，計算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力為0.0391 unit/g;江山蜂膠吸光度為0.184，計算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力為0.0449 unit/g。
實施例2
取不同產(chǎn)地(平湖、紹興、江山)蜂膠各3.0g，溶于25 mL pH 6.0磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，加入0.6gPVPP，少許石英砂，在冰浴上研磨至糊狀， 10000g4。C離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，14000 g 4 。C離心30 min取上清液定容至25mL。取兩只試管，分別加入0.5 mL粗酶液，0.5mL30 mmol/L底物濃度的對硝基苯酚P-D-葡萄糖苷，其中一只試管在57。C設(shè)定的條 件下溫育1.5 h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5 mL 1 M Na2C03 終止反應(yīng)。另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在IO(TC水浴中加熱5 min 使酶滅活，然后加入lMNa2C03終止反應(yīng)。用分光光度計在400nm處測定對 硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
測定結(jié)果平湖蜂膠吸光度為0.405，計算所得P-D-葡萄糖苷酶活力為0.0980 unit/g;紹興蜂膠吸光度為0.330，計算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力為 0.0800 unit/g;江山蜂膠吸光度為0.456，計算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力為0.110 unit/g。
實施例3
取不同產(chǎn)地(平湖、紹興、江山)蜂膠各3.0g，溶于25 mL pH 5.0磷酸 氫二鈉-擰檬酸緩沖液中，加入0.6gPVPP，少許石英砂，在冰浴上研磨至糊狀， 10000g4 。C離心15min,上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，14000 g 4 。C離心30 min取上清液定容至25mL。取兩只試管，分別加入0.5 mL粗酶液，0.5mL10 mmol/L底物濃度的對硝基苯酚(3-D-葡萄糖苷，其中一只試管在37"C設(shè)定的條 件下溫育1.5 h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5 mL 1 M Na2C03 終止反應(yīng)。另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在IOO'C水浴中加熱5 min 使酶滅活，然后加入1MNa2C03終止反應(yīng)。用分光光度計在400nm處測定對 硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
測定結(jié)果平湖蜂膠吸光度為0.162，計算所得p-D-葡萄糖苷酶活力為 0.0396 unit/g;紹興蜂膠吸光度為0.154，計算所得P-D-葡萄糖苷酶活力為0.0377 unit/g;江山蜂膠吸光度為0.210，計算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力為0.0511 unit/g。
實施例4
取不同產(chǎn)地(平湖、紹興、江山)蜂膠各3.0g，溶于25 mL pH 4.5磷酸 氫二鈉-擰檬酸緩沖液中，加入0.3gPVPP，少許石英砂，在冰浴上研磨至糊狀， 10000g4 。C離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，14000g4 。C離心30 min取上清液定容至25mL。取兩只試管，分別加入0.5 mL粗酶液，0.5mL10 mmol/L底物濃度的對硝基苯酚卩-D-葡萄糖苷，其中一只試管在37。C設(shè)定的條 件下溫育1.5 h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5 mL 1 M Na2C03 終止反應(yīng)。另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在IO(TC水浴中加熱5 min 使酶滅活，然后加入1 MNa2C03終止反應(yīng)。用分光光度計在400 nm處測定對 硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
測定結(jié)果平湖蜂膠吸光度為0.129，計算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力為 0.0316 unit/g;紹興蜂膠吸光度為0.112，計算所得P-D-葡萄糖苷酶活力為0.0270 unit/g;江山蜂膠吸光度為0.143，計算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力為0.0350 unit/g。實施例5
取不同產(chǎn)地(平湖、紹興、江山)蜂膠各3.0g，溶于25 mL pH 5.5磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，加入0.6gPVPP，少許石英砂，在冰浴上研磨至糊狀， 10000g4 。C離心15min，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，14000g4 。C離心30 min取上清液定容至25mL。取兩只試管，分別加入0.5 mL粗酶液，0.5mL30 mmol/L底物濃度的對硝基苯酚p-D-葡萄糖苷，其中一只試管在47'C設(shè)定的條 件下溫育1.5h，反應(yīng)中始終保持溶液均勻，溫育完畢加入2.5mLlMNa2C03 終止反應(yīng)。另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在10(TC水浴中加熱5 min 使酶滅活，然后加入lMNa2C03終止反應(yīng)。用分光光度計在400nm處測定對 硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
測定結(jié)果平湖蜂膠吸光度為0.359，計算所得J3-D-葡萄糖苷酶活力為 0.0870 unit/g;紹興蜂膠吸光度為0.298，計算所得P-D-葡萄糖苷酶活力為0.0723 unit/g;江山蜂膠吸光度為0.412，計算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力為0.0997 unit/g。
權(quán)利要求
1. 一種測定蜂膠中β-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)(1)粗酶提取將蜂膠冷凍，然后搗碎，過30目篩，取3.0g蜂膠粉末加入pH值4.5～6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，然后加入0.3～0.9g不溶性聚乙烯毗咯烷酮及石英砂，在冰浴上研磨成糊狀，低溫高速離心，上清液轉(zhuǎn)移到另一只離心管中，二次低溫高速離心，取上清液定容至25mL即為粗酶提取液；(2)酶促反應(yīng)取兩只試管，分別加入0.5mL粗酶液，0.5mL底物濃度5～40mmol/L的對硝基苯酚β-D-葡萄糖苷，其中一只試管在30～60℃下溫育1.5小時，溫育完畢加入2.5mL1M Na2CO3終止反應(yīng)，另一只為空白對照，其反應(yīng)混合液立即在100℃水浴中加熱5分鐘使酶滅活，然后加入1M Na2CO3終止反應(yīng)；(3)活性測定用分光光度計在400nm處測定對硝基苯酚的吸光度，從而確定該酶的活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定蜂膠中p-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于步驟(2)中所述試管在溫育時始終保持溶液均勻。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定蜂膠中(3-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于蜂膠中P-D-葡萄糖苷酶活力計算公式如下(3-D-葡萄糖苷酶活力"^x"式中A為對硝基苯酚的摩爾量pmol/L， V為酶液量mL， n為酶液稀釋倍數(shù)，t為反應(yīng)時間分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定蜂膠中β-D-葡萄糖苷酶活性的方法，本發(fā)明采用分光光度法測定一定時間內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶將一定量的底物水解成對硝基苯酚的量的多少來確定酶活性的強弱。本發(fā)明方法證實蜂膠中確定含有β-D-葡萄糖苷酶，并從成分及藥理活性的角度區(qū)分蜂膠與其膠源植物的差別，還可在原料蜂膠的層面上區(qū)分真假蜂膠，為蜂膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。本發(fā)明的方法具有簡便，靈敏度高，檢測成本低等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/31GK101482498SQ200910096109
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者張翠平, 胡福良 申請人:浙江大學(xué)