一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學檢測技術(shù)領域，具體涉及一種測定腺苷樣品中次黃苷與腺苷 相對含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺苷是酶化學法測定腺苷脫氨酶（ADA)的底物，以腺苷為主要原料之一的液體型 ADA測定試劑具有穩(wěn)定、抗干擾能力好、能實現(xiàn)自動化分析等特點，在臨床得以廣泛應用。腺 苷在-20°C保存時具有良好的穩(wěn)定性，受潮、受熱后易分解產(chǎn)生次黃苷，腺苷中次黃苷與腺 苷相對含量的高低顯著影響ADA測定試劑的靈敏度與空白吸光度值，是控制ADA測定試劑 批間差不可忽視的實驗因素之一。
[0003] 目前實驗室測定腺苷樣品中次黃苷與腺苷相對含量時均采用高效液相色譜 (HPLC)法，該法需要專用大型儀器，需要標準品做對照，檢測費時，檢測時還需要使用有毒 溶劑甲醇，易造成環(huán)境污染。
[0004] 因此，尋求一種操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準確的方法，對腺苷樣品中次黃苷與腺 苷相對含量進行檢測就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方 法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)、黃嘌呤氧化酶（XTO)、過氧化物酶（POD)組成的酶偶 聯(lián)體系將腺苷樣品中的次黃苷轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物并測定特定波長下溶液吸光度值4、 加入含腺苷脫氨酶的緩沖液后繼續(xù)反應一段時間后測定吸光度值^、利用A 1值和A2值計算 出腺苷底物中次黃苷與腺苷相對含量。該法綠色、環(huán)保，無需校準品對照即可計算出次黃苷 與腺苷的相對含量，并且用普通的可見分光光度計就可以實現(xiàn)檢測。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] -種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟 1、配制含有 MgCl2、EDTA · 2Na、Na2HP04、PNP、XTO、P0D、4-AAP、T00S、乙二醇、 蔗糖的pH 7. 0-7. 5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCL)緩沖液，得試劑A ;
[0009] 步驟2、往步驟1所得的試劑A中加入含次黃苷和腺苷的待測樣品，在37°C環(huán)境 中，反應5-10min，直至樣品中的次黃苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm波長 下的吸光度A 1;
[0010] 步驟3、配制含ADA、乙二醇、蔗糖的ρΗ7· 0-7. 5Tris-HCL緩沖液，得試劑B ;
[0011] 步驟4、將步驟3所得的試劑B加入到步驟2所得溶液中，在37°C環(huán)境中，繼續(xù)反 應5-10min，直至樣品中的腺苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm波長下的吸光 度A2;
[0012] 步驟5、通過以下公式計算出次黃苷與腺苷的相對含量：
[0013] 樣品液中次黃苷/腺苷（％) = (A1-Atl) X 100% AA2-A1XVyV2)，式中：Atl為同體 積的去離子水代替樣品與試劑A反應所測得的吸光度值;A1為樣品與試劑A反應所測得的 吸光度值;A2為樣品與試劑A反應后繼續(xù)與試劑B反應所測得的吸光度值；V i為樣品液和 試劑A混合后的反應體積；V2S樣品液與試劑A、試劑B混合后的總反應體積。
[0014] 優(yōu)選的，所述的步驟1中ρΗ7· 0-7. 5Tris-HCL緩沖液中Tris-HCL濃度為 20-200mmol/L、MgCl2濃度為 l-25mmol/L、EDTA · 2Na 濃度為 0· 5-20mmol/L、Na 2ΗΡ04濃度為 5-50mmol/L、PNP 濃度為 0· 1-10KU/L、XTO 濃度為 0· 2-20KU/L、POD 的濃度為 0· 5-50KU/L、 4-AAP 的濃度為 0. 2-5mmol/L、T00S 的濃度為 0. 5-10mmol/L、乙二醇濃度為 10-100ml/L、蔗 糖濃度為5-50g/L。
[0015] 優(yōu)選的，所述的步驟3中pH7. 0-7. 5Tri s-HCL緩沖液Tris-HCL濃度為 20-200mmol/L、ADA 濃度為 10-100KU/L、乙二醇濃度為 10-100ml/L、蔗糖濃度為 5-50g/L。
[0016] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0017] 靈敏度高，線性、精密度好，結(jié)果準確，且操作簡便快速，并可用于各種類型的 分析儀，達到大規(guī)模測定樣本的要求。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步 詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0019] 實施例1
[0020] 精確稱取0. 1克左右樣品，用去離子水定容至樣品終濃度為0. 05g/L的樣品液； 配制含有 MgCl2lmmol/L、EDTA · 2Na 濃度為 0. 5mmol/L、Na2HPO4濃度為 5mmol/L、PNP 濃度 為 0· 1KU/L、XT0 濃度 0· 2KU/L、P0D 濃度為 0· 5KU/L、4-AAP 濃度為 0· 2mmol/L、T00S 濃度為 0. 5mmol/L、乙二醇濃度為10ml/L、鹿糖濃度為5g/L的20mmol/LpH7. OTris-HCL緩沖液為 試劑1 ;配制含有ADA濃度為10KU/L、乙二醇濃度為10ml/L、蔗糖濃度為5g/L的20mmol/L pH 7. OTris-HCL緩沖液為試劑2。將試劑1和試劑2用于測定樣品液時，采用的儀器為奧 林巴斯2700全自動生化分析儀，測定方法類型為終點法，溫度為37°C，V #品為5 μ 1，V $ 300 μ 1，V 2為100 μ 1，測定主/副波長為540/800nm，試劑1加入樣本后在測定溫度反應 3. 5分鐘后讀取吸光度A1，繼續(xù)加入試劑2反應5分鐘后讀取吸光度A2。樣品液中次黃苷與 腺苷相對含量的計算公式為：樣品液中次黃苷/腺苷（％) = (A1-Atl) X 100% AA2-A1XV1/ V2)，其中Atl為同體積的去離子水代替樣品與試劑1反應所測得的吸光度值，A i為樣品與試 劑1反應所測得的吸光度值，A2為樣品與試劑1反應后繼續(xù)與試劑2反應所測得的吸光度 值，％為樣品液和試劑1混合后的反應體積，V 2為樣品液和試劑1、試劑2混合后的總反應 體積。用本法和HPLC法同時測定了 11例樣品液中次黃苷與腺苷相對含量。
[0021] 表2為本實施例所述方法測定的結(jié)果與HPLC法測定測定結(jié)果對照表。
[0022] 表 2
[0023]
【主權(quán)項】
1. 一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟 1、配制含有MgCl2、EDTA? 2Na、Na2HP04、PNP、XTO、P0D、4-AAP、TOOS、乙二醇、蔗糖 的pH7. 0-7. 5三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCL)緩沖液，得試劑A; 步驟2、往步驟1所得的試劑A中加入含次黃苷和腺苷的待測樣品，在37°C環(huán)境中，反 應5-10min，直至樣品中的次黃苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm波長下的吸 光度A1; 步驟3、配制含ADA、乙二醇、蔗糖的pH7. 0-7. 5Tris-HCL緩沖液，得試劑B; 步驟4、將步驟3所得的試劑B加入到步驟2所得溶液中，在37°C環(huán)境中，繼續(xù)反應 5-10min，直至樣品中的腺苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm波長下的吸光度 A2; 步驟5、通過以下公式計算出次黃苷與腺苷的相對含量： 樣品液中次黃苷/腺苷（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1A2)，式中：Atl為同體積的 去離子水代替樣品與試劑A反應所測得的吸光度值;A1為樣品與試劑A反應所測得的吸光 度值;A2為樣品與試劑A反應后繼續(xù)與試劑B反應所測得的吸光度值；V:為樣品液和試劑A 混合后的反應體積；％為樣品液與試劑A、試劑B混合后的總反應體積。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法，其特 征在于，所述的步驟1中pH7. 0-7. 5Tris-HCL緩沖液中Tris-HCL濃度為20-200mmol/L、 MgCl2濃度為l-25mmol/L、EDTA? 2Na濃度為 0? 5-20mmol/L、Na2HP04濃度為 5-50mmol/L、 PNP濃度為 0. 1-10KU/L、XT0 濃度為 0. 2-20KU/L、P0D的濃度為 0. 5-50KU/L、4-AAP的濃度為 0. 2-5mmol/L、TOOS的濃度為 0. 5-10mmol/L、乙二醇濃度為 10-100ml/L、鹿糖濃度為 5_50g/ L0
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法，其特征 在于，所述的步驟3中pH7. 0-7. 5Tris-HCL緩沖液Tris-HCL濃度為20-200mmol/L、ADA濃 度為10-100KU/L、乙二醇濃度為10-lOOml/L、蔗糖濃度為5-50g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定待測樣品中次黃苷與腺苷相對含量的方法,利用由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黃嘌呤氧化酶(XTO)、過氧化物酶(POD)組成的酶偶聯(lián)體系將腺苷樣品中的次黃苷轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物并測定特定波長下溶液吸光度值A1、加入含腺苷脫氨酶的緩沖液后繼續(xù)反應一段時間后測定吸光度值A2、利用A1值和A2值計算出腺苷底物中次黃苷與腺苷相對含量。該法綠色、環(huán)保，無需校準品對照即可計算出次黃苷與腺苷的相對含量，并且用普通的可見分光光度計就可以實現(xiàn)檢測。本發(fā)明靈敏度高,線性、精密度好,結(jié)果準確,且操作簡便快速,并可用于各種類型的分析儀，達到大規(guī)模測定樣本的要求。
【IPC分類】G01N1-28, G01N21-31
【公開號】CN104730017
【申請?zhí)枴緾N201510186267
【發(fā)明人】連國軍
【申請人】溫州醫(yī)科大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年4月18日