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發(fā)酵制備氨基酸的方法

文檔序號:3595493閱讀:3415來源:國知局
專利名稱:發(fā)酵制備氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備氨基酸如L-賴氨酸或L-蘇氨酸的改進(jìn)方法。
L-賴氨酸是一種必需氨基酸并大量地被用作動物飼料添加劑。
通常通過生物合成生產(chǎn)大量的氯基酸,并且該方法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。通過在短時間內(nèi)以高濃度把這些氨基酸分泌到培養(yǎng)基中的能力來鑒別生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌菌株。通常為了避免底物的高起始濃度,一般采用分批進(jìn)料的工藝。由于所用的生產(chǎn)菌株有很高的代謝能力,因此采用使最大需氧量和放熱量保持在經(jīng)濟(jì)學(xué)上可接受的數(shù)量級這一發(fā)酵方法對于完成發(fā)酵過程是極其重要的。
因此,為了調(diào)節(jié)生物體的代謝活性,采用了各種手段,以確保氧氣的供給和熱量的釋放以及在同一時間平衡生物量和產(chǎn)物形成的分布。
在CSFR-PS212558中公開了間歇供料的方法,其中在生長期通過改變pH并通過α-氨基氮調(diào)節(jié)生物量總量來調(diào)節(jié)代謝活性。SU-PS157059公開了一種間歇供料的方法,其中以蘇氨酸濃度作為供料標(biāo)準(zhǔn),并使還原化合物的比例保持在3到5%。在FR-PS8303487中公開了一種很精細(xì)地調(diào)節(jié)過程。在該過程中,連續(xù)加入兩種供料溶液以這樣的速度加入磷酸亮氨酸溶液,即通過補充料加入的速度限制生物代謝強度和生物量的形成。以實際糖濃度保持在5到15g/l的速度加入第二種供料溶液,即糖溶液。這表明,由于在供料期由亮氨酸/磷酸鹽補充物的限制,隨后在任何一個時間,培養(yǎng)物可利用的糖均比在培養(yǎng)基中可得到的少。該方法與重復(fù)記載的應(yīng)當(dāng)避免C-限制和過度的C-超量(如,DD-PS269167)的觀點是一致的。為了該目的,HasjSassi等人在“BiotechnLetters,Volume10,No.8,pp.583-586(1988)”中甚至建議葡萄糖濃度保持在90到140g/l。因此,代謝活性總是由只有碳源以外的因素調(diào)節(jié)的。
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵制備氨基酸的生產(chǎn)方法,該方法以較高轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化所用的碳源(糖),并在不含生物量的干物質(zhì)中得到高濃度的氨基酸。
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備氨基酸物的生產(chǎn)方法,其中在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生一種或多種氨基酸的短桿菌屬或棒狀桿菌屬的菌株,并在發(fā)酵結(jié)束時從培養(yǎng)液中分離氨基酸,特征在于在活躍的生長期(生產(chǎn)期期間)后,細(xì)菌培養(yǎng)基可得到的碳源量比以它在其菌株結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上可代射的量少并且在營養(yǎng)培養(yǎng)基中提供一定量的其它必需補充物。發(fā)酵(營養(yǎng))培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基組合物。除含碳源如可同化的糖、蔗糖、葡萄糖,糖蜜或淀粉水解物及銨離子外,在自養(yǎng)型生產(chǎn)菌的情況下,由于一種或多種營養(yǎng)缺陷,它還含有復(fù)雜的成分作為所需的有機補充物源,如蛋白水解物作為α-氨基氮源,維生素及無機鹽。在發(fā)酵開始時呈現(xiàn)的活躍生長通常是一個對數(shù)生長期。如果需要,可通過限制補充物和/或碳源來縮短對數(shù)生長期。
對數(shù)生長期之后是細(xì)胞生長,但這種生長的范圍局限于活躍生長期的一小部分。優(yōu)選地是使用生產(chǎn)L-賴氨酸和/或L-蘇氨酸的菌株。選擇發(fā)酵培養(yǎng)基,以使溫度為25到40℃,最好是30到36℃,pH從6到8,最好為7到7.5,銨濃度從0.5到8g/l。攪拌發(fā)酵液并充分地供氧??梢酝ㄟ^改變加入的氨基酸量控制糖代謝,特別是在使用氨基酸營養(yǎng)缺陷型賴氨酸分泌菌的情況下。生長期后,這些補充物或其它必需補充物的濃度優(yōu)選地是各自為0到0.1g/l,最好各自為0到0.05g/l。因此,例如在亮氨酸-營養(yǎng)缺陷型賴氨酸分泌菌中,在連續(xù)加料的培養(yǎng)基中選擇糖/亮氨酸比率,以便通過添加亮氨酸限制生物量的形成,但同時所提供的糖數(shù)量僅僅是在給定的亮氨酸濃度下可被轉(zhuǎn)化之糖的一部分。
在活躍生長期后,可利用之糖的濃度較好為0到<3g/l,最好為0到1g/l。
就任何所需的補充物或碳源來說,在發(fā)酵液中的濃度為0g/l并不意味著不連續(xù)提供這些物質(zhì)。它意味著這些化合物是以立刻被細(xì)菌培養(yǎng)物攝取的量提供的。按照本發(fā)明的方法完成上述發(fā)酵與上述的常規(guī)方法相比有許多很重要的優(yōu)點,即1.可以直接影響并沒有因供料速度而延緩代謝活性和由此導(dǎo)致的培養(yǎng)物需氧量及熱釋放改變,且適應(yīng)于發(fā)酵罐的能力。
2.由整體地干物質(zhì)的較高產(chǎn)物含量和較高的純度區(qū)別發(fā)酵液。通過在整個供料期間,給細(xì)菌培養(yǎng)物提供比它所能轉(zhuǎn)化的量較少的底物來阻制因副產(chǎn)品形成而造成的損耗,因而碳源構(gòu)成了初級限制。
3.發(fā)酵的產(chǎn)率比主要由添加方式限制的發(fā)酵高。
4.在監(jiān)測產(chǎn)物的過程中,在最佳或平穩(wěn)期,可直接地并且沒有任何延遲地停止發(fā)酵,并且在全部時間內(nèi)的粗產(chǎn)率等于凈產(chǎn)率。
5.在完成包括經(jīng)蒸發(fā)而直接濃縮發(fā)酵液的方案中,發(fā)酵罐中的內(nèi)含物可以在出現(xiàn)技術(shù)故障的情況下直接繼續(xù)加工,而不會因高殘余糖含量損壞產(chǎn)品的質(zhì)量。
下列實施例記載根據(jù)本發(fā)明之方法的可能的實施方案。
實施例1(比較實施例)把5.1kg含下列成分的無菌溶液引在帶攪拌器和通氣系統(tǒng)的發(fā)酵罐中水4540g糖蜜26g葡萄糖125g谷物谷蛋白水解物(用硫酸水解)35g生產(chǎn)菌生物量的水解物(用硫酸水解)320g
硫酸銨45g磷酸(85%)7g硫酸鎂3g其它無機鹽,微量元素和生物素及硫胺素。用銨溶液把溶液的pH調(diào)至7.3。在33到35℃,把帶遺傳標(biāo)記leu-,惡溶菌素抗性和氨乙基抗性的0.6l谷氨酸棒桿菌DM346-1的接種物加到上述溶液中。經(jīng)33℃,pH7,在攪拌和通氣條件下在培養(yǎng)基上培養(yǎng)15小時制備接種物,所述培養(yǎng)基含4.4%(質(zhì)量)糖蜜,另外還有2%蔗糖以及14%大豆粉水解物(用硫酸水解),附加的還有3%硫酸銨,0.05%磷酸和0.02%硫酸鎂以及維生素,生物素和硫胺素。
伴隨強烈攪拌,通風(fēng)以及用氨水溶液把pH調(diào)到7.3,將用氨水溶液中和的下列培養(yǎng)基在對數(shù)生長期結(jié)束后的32小時之內(nèi)按常規(guī)方法連續(xù)加到主發(fā)酵罐中,以使在發(fā)酵液中可測量的糖濃度為5到35g/l(以蔗糖和葡萄糖為基礎(chǔ)的酶法測定)水1250g糖蜜94g葡萄糖1456g玉米谷蛋白水解物(用硫酸水解)39g生產(chǎn)菌生物量的水解物(用硫酸水解)265g硫酸銨31g磷酸(85%)4g
硫酸鎂2g其它無機鹽,微量元素和生物素及硫胺素。
在發(fā)酵結(jié)束時,當(dāng)用完發(fā)酵培養(yǎng)基中的所有可同化糖時,糖轉(zhuǎn)化成賴氨酸的轉(zhuǎn)化率是35%,按LysxHCl計算,并且,沒有生物量的濃縮發(fā)酵液中的賴氨酸基本含量是45%。
實施例2制備接種物,把培養(yǎng)基引入主發(fā)酵罐并且使用與實施例1相似的培養(yǎng)條件。
培養(yǎng)基2也有除下列改變外的同樣組成水1560g糖蜜25g葡萄糖1170g在本實驗中,以與實施例1中同樣的速度加入供料培養(yǎng)基。對以可同化糖為基礎(chǔ)的進(jìn)展所作分析表明,與本發(fā)明在本文中所說的一致,在整個供料期間,可測量的可同化糖的濃度保持在3g/l,并幾乎總是保持低于1g/l。使用氨基酸分析儀,以發(fā)酵液中的亮氨酸為基礎(chǔ)的分析表明,在培養(yǎng)基1中提供的亮氨酸量用完后,供料期間亮氨酸的濃度沒有大于0.05g/l的點。
發(fā)酵結(jié)束后,糖轉(zhuǎn)化成賴氨酸的轉(zhuǎn)化率(按LysxHCl計算)為40%,并且,無生物量之濃縮發(fā)酵液的賴氨酸基本含量為54%。
實施例3
把含下列組分的3980kg無菌培養(yǎng)基引入10m3的反應(yīng)容器中蔗糖320kg糖蜜20kg玉米谷蛋白水解物230kg25%含水硫酸銨150kg檸檬酸·H2O 2.3kg磷酸(89%)6.6kgMgSO4·7H2O 2.8kgCaCl2·2H2O 75gFeSO4·H2O 113gMnSO4·H2O 113gZnSO4·7H2O 5.6gCuSO4·5H2O 0.6g生物素1.1g硫胺素·HCl0.8gNH4OH(2-3%) 1010kg水2258kgpH7.0在33℃攪拌反應(yīng)器的內(nèi)含物并充分通氣。把250l攜帶遺傳標(biāo)記亮氨酸營養(yǎng)缺陷型和氨乙基半胱氨酸抗性的菌株DM282-2的接種物(在含6%糖蜜,14%大豆粉水解物,1%硫酸銨和0.1%磷酸的培養(yǎng)基中,于30℃,pH7條件下培養(yǎng)16小時后)轉(zhuǎn)移到10m3的反應(yīng)器中,加入氨水使pH保持在7.0,并調(diào)整通氣速度以使氧含量總是15%以上的飽和度。
在培養(yǎng)物生長到約為30的光密度(535nm)后,以30l/h的速度加入有下列組成的生產(chǎn)培養(yǎng)基蔗糖940kg糖蜜50kg玉米谷蛋白水解物180kg25%含水硫酸銨80kg檸檬酸·H2O 1kg磷酸(89%)2.8kgMgSO4·7H2O 1.2kgFeSO4·H2O 48gMnSO4·H2O 48gZnSO4·7H2O 2.4gCuSO4·5H2O 0.3g生物素0.6g硫胺素·HCl0.4gNH4OH(25%) 80kg水740kgpH7.5
生產(chǎn)期間pH保持在7.3。根據(jù)本發(fā)明的描述,生長培養(yǎng)基中提供的糖用完后,供料期間可同化糖的濃度不超過1g/l,可測定的亮氨酸濃度低于0.05g/l。在發(fā)酵結(jié)束時,糖轉(zhuǎn)化成賴氨酸(以Lys·HCl的形式)的轉(zhuǎn)化率是32.3%,不含生物量的濃縮發(fā)酵液不的賴氨酸含量是54.7%。
實施例4(比較實施例)制備接種物,方法參數(shù),以及生長期和生產(chǎn)期的培養(yǎng)基與在實施例3中說明的條件相一致,但在這種情況下以大約100l/h的速度完成供料。結(jié)果,在生長培養(yǎng)基中提供的糖用完后,供料期間可測量的可同化糖濃度明顯高于5g/l,但亮氨酸濃度保持低于0.05g/l。在發(fā)酵結(jié)束時,糖轉(zhuǎn)化成賴氨酸(以Lys·HCl計算)的轉(zhuǎn)化率是30.9%,且不含生物量的發(fā)酵液中賴氨酸基本含量為43.5%。
實施例5(比較實施例)除了在生長培養(yǎng)基中用25g/l的蔗糖代替葡萄糖,在生產(chǎn)培養(yǎng)基中用564g/l的蔗糖代替葡萄糖外,培養(yǎng)生長以及生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基均與實施例1所述者相似。包括制備接種物在內(nèi)的培養(yǎng)參數(shù)也完全相同。把0.82kg(0.8l)無菌培養(yǎng)基引入一配有攪拌器和通氣裝置的小發(fā)酵罐中。在33到35℃向該溶液中加入1.1l的谷氨酸棒桿菌DSM5717的接種物。當(dāng)光密度達(dá)到約30(535nm)時,在24小時內(nèi)連續(xù)加入533g(430ml)的生產(chǎn)培養(yǎng)基。
供料期間,發(fā)酵培養(yǎng)基中可測量的糖含量總是大于5g/l,且在生長培養(yǎng)基中提供的糖用完后,亮氨酸含量總是低于0.05g/l。發(fā)酵結(jié)束時,在培養(yǎng)基中檢測到作為Lys·HCl的賴氨酸為74g,在蔗糖總輸入量為275g的情況下,相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率是27%??偢缮锪康馁嚢彼岷渴?0.5%。
實施例6在另一實驗中也使用DSM5715菌株,其中所有培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的參數(shù)與實施例5的相同,在39小時內(nèi)連續(xù)加入生產(chǎn)培養(yǎng)基。與本發(fā)明所述的一致,生長培養(yǎng)基中提供的碳源和亮氨酸用完后,在供料期間,實際的蔗糖濃度低于1g/l且亮氨酸濃度低于0.05g/l。在發(fā)酵結(jié)束時,在培養(yǎng)基中檢測到89g賴氨酸(以Lys·HCl的形式),且轉(zhuǎn)化率為32%。在全部干物質(zhì)中賴氨酸含量為36.3%。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵制備氨基酸的方法,其中,在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)一種或多種氨基酸的短桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株,并在發(fā)酵結(jié)束時,從培養(yǎng)液中分離氨基酸,其特征在于在活躍生長期后,細(xì)菌培養(yǎng)物可以得到比基于該菌株之結(jié)構(gòu)可以被其代謝的較小量碳源,并在營養(yǎng)培養(yǎng)基中提供一定量的其他必要添加物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于活躍生長期后,碳源的濃度是從0到<3g/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法,其特征在于,使用營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌菌株并且在一些多菌株營養(yǎng)缺陷情況下,至少加入一種有機化合物,在活躍生長期后,把其濃度限制到0到0.1g/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3之任一項的方法,其特征在于使用生產(chǎn)L-賴氨酸和/或L-蘇氨酸的菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其特征在于使用谷氨酸棒狀桿菌的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵制備氨基酸的方法。其中在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)一種或多種氨基酸的短桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株,并在發(fā)酵結(jié)束時從培養(yǎng)液中分離氨基酸,特征在于在活躍生長期后,細(xì)菌培養(yǎng)物得有供它自己使用的可吸收碳源,這個碳源量比基于該菌株結(jié)構(gòu)上可代謝的量少,并在營養(yǎng)培養(yǎng)基中提供一定量的其它必需添加物。
文檔編號C07K16/00GK1070687SQ92110718
公開日1993年4月7日 申請日期1992年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1991年9月17日
發(fā)明者W·費佛勒, H·勞特, H·福里德里奇, W·狄格奈 申請人:底古薩股份公司
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