一株谷氨酸棒狀桿菌及其高產(chǎn)異亮氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株谷氨酸棒狀桿菌及其高產(chǎn)L?異亮氨酸的方法，屬于微生物領(lǐng)域、基因組學(xué)領(lǐng)域。所述谷氨酸棒桿菌具體為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)YI，保藏號(hào)為CGMCC No.12153。該菌株經(jīng)誘變獲得，在30L發(fā)酵罐發(fā)酵32?40h，異亮氨酸產(chǎn)量可達(dá)28g/L，發(fā)酵時(shí)間短，且產(chǎn)量高，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。此外，本發(fā)明還公布了該菌株相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)株的基因突變位點(diǎn)，為相關(guān)研究提供了新方向。CGMCC No.1215320160301
【專利說(shuō)明】
一株谷氨酸棒狀桿菌及其高產(chǎn)異亮氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域、基因組學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一株谷氨酸棒狀桿菌及其高產(chǎn) L-異亮氨酸的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，是一種放線菌目的革蘭氏陽(yáng)性 菌，細(xì)胞呈短棒狀八字排列。谷氨酸棒狀桿菌在氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域有著舉足輕重的地位，至今 已經(jīng)被安全應(yīng)用了近60年。目前，包括L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨 酸、L-丙氨酸、L-天門冬氨酸等大多數(shù)氨基酸都開始運(yùn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。
[0003] 國(guó)內(nèi)的L-異亮氨酸生產(chǎn)主要依靠微生物發(fā)酵法，使用的菌株以谷氨酸棒狀桿菌為 主，但目前對(duì)其代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)認(rèn)識(shí)的不足限制了更深層次代謝工程應(yīng)用研究的進(jìn)展。 異亮氨酸的生物合成途徑所屬的分支鏈氨基酸(纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸)合成途徑，一 直是科研人員研究的熱點(diǎn)，大部分研究集中于該代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵酶的活性中心氨基酸的 改變，或者關(guān)鍵酶的過(guò)表達(dá)，但目前為止，尚未有關(guān)于異亮氨酸生產(chǎn)菌的完整基因組序列的 報(bào)道。
[0004] 本實(shí)驗(yàn)室，利用傳統(tǒng)育種手段中的化學(xué)誘變法，成功篩選到了一株高效的異亮氨 酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌YI株，并完成了全基因組測(cè)序。在此基礎(chǔ)上又對(duì)其進(jìn)行比較基因 組學(xué)分析，揭示了 YI株的異亮氨酸合成途徑相關(guān)基因的堿基突變。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明包括一株經(jīng)過(guò)誘變篩選得到的L-異亮氨酸高效生產(chǎn)菌株，谷氨酸棒桿菌 YI，并且對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)序，得到了完整的基因組序列。本發(fā)明在異亮氨酸高產(chǎn)菌株谷氨 酸棒桿菌YI的全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，分析了整個(gè)分支鏈氨基酸合成途徑中的基因序列， 報(bào)道了這些基因存在堿基突變所導(dǎo)致的編碼產(chǎn)物氨基酸突變，這些突變對(duì)于異亮氨酸的合 成有較明顯的正向影響。
[0006] 傳統(tǒng)誘變育種得到的菌株的遺傳背景往往不清晰，雖然獲得了期望的表型性狀， 但對(duì)于其形成機(jī)理缺乏明確認(rèn)識(shí)。本發(fā)明在基因組序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)異亮氨酸生產(chǎn)菌 谷氨酸棒桿菌YI與谷氨酸棒桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032的基因組序列相比較，發(fā)現(xiàn)其異亮氨酸 合成相關(guān)基因序列中存在較多堿基突變，堿基突變導(dǎo)致各基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列存在 以下改變，以下采用"原始氨基酸位置替換的氨基酸"來(lái)表示谷氨酸棒桿菌YI相較于標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC 13032(Genebank:NC_003450)在相同的酶上發(fā)生的氨基酸突變。由于突變前后的各基 因序列所包含的堿基數(shù)均與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032-致，因此所述位置的編號(hào)以ATCC 13032的 對(duì)應(yīng)酶在Genebank中的氨基酸序號(hào)來(lái)表示：
[0007] 乙酰羥酸合酶催化亞基:1^8306111^81115648?、￥&1233116 ;核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.l；
[0008] 乙酰羥酸合酶調(diào)控亞基:His47Leu;核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2;
[0009] 蘇氨酸脫水酶:Pro363Leu;核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3;
[0010] 二羥酸脫水酶:Glu461Lys;核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4;
[0011] 分支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶:Phe32Tyr、Gln 253His;核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 5；
[0012] 異丙基蘋果酸合酶：Gly92Asp、Ilel62Val、Pro206Ser、Val439Ile、Arg494His、 Ser557Leu;核苷酸序列如序列表SEQ ID No.6;
[0013] 異丙基蘋果酸脫水酶大亞基:Lys 93Gln、Gly317Ser、Ser319Thr、Ser322AsnJS- 酸序列如序列表SEQ ID No.7;
[0014] 異丙基蘋果酸脫水酶小亞基：Tyr7His、Thrll3Ala;核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 8；
[0015] 異丙基蘋果酸脫氫酶：Ile334Val、Lys336Arg;核苷酸序列如序列表SEQ ID No.9;
[0016] 所述谷氨酸棒桿菌YI，具體為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) YI，該菌已于2016年3月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱 CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 12153,保藏地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101.
[0017] 所述谷氨酸棒桿菌YI經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到異亮氨酸28g/ L，所述發(fā)酵培養(yǎng)具體如下：
[0018] (1)斜面培養(yǎng):置于32 °C培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng) 12h，經(jīng)過(guò)兩代活化培養(yǎng)之后的菌種直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，或置于4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0019] (2)搖瓶種子培養(yǎng):容積1000mL的三角瓶，裝液量為100mL，從二代斜面上接種2-4 環(huán)，置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32°C，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2 之間；
[0020] (3)二級(jí)種子培養(yǎng):接種量為8-10%，32°C培養(yǎng)，溶氧維持在20-30%，培養(yǎng)過(guò)程使 用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，培養(yǎng)至0D 6Q() = 15-20;
[0021] (4)發(fā)酵罐發(fā)酵:接種量為10-13%，32°C培養(yǎng)，溶氧維持在20-30%，培養(yǎng)過(guò)程使用 氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，培養(yǎng)32-40h;
[0022] 所述活化斜面培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 5,瓊脂條20，ρΗ 6·7-7·2;
[0023] 所述搖瓶種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g， NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4· I2H2O 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨 酸〇 · lg，纈氨酸〇 · lg，苯酚紅溶液(〇 · 4g/L)20mL，蒸餾水lOOOmL，pH 6 · 7-7 · 2;
[0024] 所述二級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿 20g，NaCl 5g，MgS〇4 · 7H20 2g，KH2P〇4 · 12H20 2g，F(xiàn)eS〇4 · 7H200.01g，MnS〇4 · H20 O.Olg，亮 氨酸〇· lg，結(jié)I氨酸〇· lg，蒸餾水 1000mL，pH 6·7-7·2;
[0025] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖60g，豆餅粉水解液25mL，玉米漿40g，MgS〇4 · 7H20 2g，KH2P〇4.12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 0.01g，VBi O.Olg，蒸餾水 1000mL，pH 6.7-7.2；
[0026] 所述豆餅粉水解液波美度28度。
[0027] 有益效果：
[0028] 1、本發(fā)明所提供的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到異亮氨酸13g/ L，較原始菌株的0.2g/L，進(jìn)步顯著，經(jīng)30L發(fā)酵罐32-40h發(fā)酵后，發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到異 亮氨酸28g/L，且高于現(xiàn)有技術(shù)；
[0029] 2、本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的與異亮氨酸合成相關(guān)酶的氨基酸突變位點(diǎn)為異亮氨酸合成及 基因研究提供了新的方向與途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。
[0031] 實(shí)施例1谷氨酸棒桿菌的化學(xué)誘變
[0032] (1)以土壤中分離得到的谷氨酸棒桿菌作為出發(fā)菌株，首先在完全培養(yǎng)基斜面上 活化，32 °C培養(yǎng)12小時(shí)；
[0033] (2)從斜面接種于液體種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，32 °C培養(yǎng)12小時(shí)；
[0034] (3)用生理鹽水對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，重復(fù)一次后，用pH為7.0的磷酸緩沖液 重懸菌體，制成1〇7-1〇8細(xì)胞/mL的菌懸液；
[0035] (4)取5-10mL菌懸液，加入到無(wú)菌試管中，再加入1%(V/V)硫酸二乙酯，試管用棉 塞封口，震蕩30_40min;
[0036] (5)用適量無(wú)菌水稀釋，涂布于含有磺胺胍、L-異亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性篩選培 養(yǎng)基上，32 °C培養(yǎng)，待生長(zhǎng)出單菌落；
[0037] (6)初篩方式:單菌落利用96孔板培養(yǎng)，以紙層析檢測(cè)L-異亮氨酸產(chǎn)量；
[0038] (7)復(fù)篩方式:在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。
[0039] 實(shí)施例2谷氨酸棒桿菌YI的基因組測(cè)序
[0040] (1)基因組的提取：使用PR0MEGA公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Wizard? Genomic DNA Purification Kit A1120,利用核酸分析儀檢測(cè)，保證基因組DNA的質(zhì)量符合 測(cè)序需要；
[0041 ] (2)利用三代測(cè)序平臺(tái)PacBio RS II對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序；
[0042] (3)利用PacBio公司提供的裝軟件對(duì)基因組進(jìn)行組裝，并使用相關(guān)軟件進(jìn)行常規(guī) 的比較基因組分析。
[0043] 實(shí)施例3基因突變前后菌株異亮氨酸合成能力比較
[0044] (1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 5,瓊脂 條20，ρΗ 6.7-7.2;
[0045] (2)搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g，NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4.12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨酸 〇 · 1 g，纈氨酸〇 · 1 g，苯酚紅溶液(〇 · 4g/L) 20mL，蒸餾水 1 OOOmL，pH 6 · 7-7 · 2;
[0046] (3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖60g，豆餅粉水解液25mL，玉米漿40g，MgS〇4 · 7H20 2g， ΚΗ2Ρ〇4·12Η20 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 0.01g，VBi O.Olg，苯酚紅溶液（0.4g/L) 20mL，蒸餾水 1000mL，pH 6·7-7·2;
[0047] (2)(3)中所述豆餅粉水解液購(gòu)自山東菱花味精股份有限公司，波美度28度；
[0048] (4)斜面培養(yǎng):置于32°C培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng) 12h，經(jīng)過(guò)兩代活化培養(yǎng)之后的菌種可直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可置于4°C保存； [0049] (5)搖瓶種子培養(yǎng):容積500mL的三角瓶，裝液量為30mL，從二代斜面上接種1-2環(huán)， 置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32°C，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液的pH在6.4到 7.2之間；
[0050] (6)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):容積500mL的三角瓶，裝液量為30mL，接種量為10%，置于水平 旋轉(zhuǎn)搖床，32°C，200r/min，培養(yǎng)36h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液的pH在6.4到7.2之間， 發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于l〇g/L;
[0051 ] (7)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中異亮氨酸濃度，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 13032的發(fā)酵液 中基本檢測(cè)不到異亮氨酸，基因突變之前的菌株的發(fā)酵液中最多檢測(cè)到異亮氨酸〇.2g/L， 突變后菌株的發(fā)酵液中平均可檢測(cè)到異亮氨酸13g/L。
[0052]實(shí)施例4基因突變后菌株(YI株)的30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0053] (1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 5,瓊脂 條20，pH 6.7;
[0054] (2)搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g，NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4.12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨酸 〇 · lg，纈氨酸〇 · lg，苯酚紅溶液(〇 · 4g/L)20mL，蒸餾水lOOOmL，pH 6 · 7;
[0055] (3)二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g，NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4.12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨酸 〇· lg，繳氨酸〇· lg，蒸餾水 1000mL，pH 6.7;
[0056] (4)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g，豆餅粉水解液25mL，玉米漿40g，MgS〇4 · 7H202g， ΚΗ2Ρ〇4·12Η20 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 0.01g，VBi O.Olg，蒸餾水 1000mL，pH 6.7；
[0057] (2)(3)(4)中所述豆餅粉水解液購(gòu)自山東菱花味精股份有限公司，波美度28度； [0058] (5)斜面培養(yǎng):置于32 °C培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng) 12h；
[0059] (6)搖瓶種子培養(yǎng):容積1000mL的三角瓶，裝液量為100mL，從二代斜面上接種3環(huán)， 置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32°C，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.4到7.2 之間；
[0060] (7)二級(jí)種子培養(yǎng):采用5L發(fā)酵罐，裝液量為3L，接種量為8%，32°C培養(yǎng)，溶氧維持 在20-30 %，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，培養(yǎng)周期在12小時(shí)，用分光光度 計(jì)在波長(zhǎng)為600納米處檢測(cè)吸光度為16;
[0061 ] (8)30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵:裝液量為16L，接種量為10 %，32°C培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程的溶氧 控制在20%到30 %之間，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.4到7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖 濃度維持不低于l〇g/L，發(fā)酵周期為32小時(shí)；
[0062] (8)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中異亮氨酸濃度，可檢測(cè)到異亮氨酸22g/L。 [0063]實(shí)施例5基因突變后菌株(YI株)的30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn) [0064] (1)活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 5,瓊脂 條20，pH 7.0;
[0065] (2)搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g，NaCl 5g，MgS〇4 · 7H20 2g，KH2P〇4 · 12H20 2g，F(xiàn)eS〇4 · 7H20 O.Olg，
[0066] MnS〇4 · H2O O.Olg，亮氨酸0· lg，繳氨酸0· lg，苯酸紅溶液(0.4g/L)20mL，蒸餾水 1000mL,pH7.0；
[0067] (3)二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g，NaCl 5g，MgS〇4 · 7H2O 2g，KH2P〇4 · 12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4 · 7H2O O.Olg，
[0068] MnSCU · H2O O.Olg，亮氨酸0· lg，結(jié)I氨酸0· lg，蒸餾水 1000mL，pH 7.0;
[0069] (3)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g，豆餅粉水解液25mL，玉米漿40g，MgS〇4 · 7H202g， ΚΗ2Ρ〇4·12Η20 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 0.01g，VBi O.Olg，蒸餾水 1000mL，pH 7.0；
[0070] (2)(3)(4)中所述豆餅粉水解液購(gòu)自山東菱花味精股份有限公司，波美度28度；
[0071] (4)斜面培養(yǎng):置于32°C培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng) 12h，經(jīng)過(guò)兩代活化培養(yǎng)之后的菌種可直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可置于4°C保存； [0072] (5)搖瓶種子培養(yǎng):容積1000mL的三角瓶，裝液量為100mL，從二代斜面上接種4環(huán)， 置于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32°C，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.4到7.2 之間；
[0073] (6)二級(jí)種子培養(yǎng):采用5L發(fā)酵罐，裝液量為3L，接種量為10%，32°C培養(yǎng)，溶氧維 持在20-30 %，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，培養(yǎng)周期在16小時(shí)，用分光光 度計(jì)在波長(zhǎng)為600納米處檢測(cè)吸光度到20;
[0074] (7)30L發(fā)酵罐分批發(fā)酵:裝液量為16L，接種量為13%，32°C培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程的溶氧 控制在20%到30 %之間，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水維持發(fā)酵液pH在6.4到7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖 濃度維持不低于l〇g/L，發(fā)酵周期為36小時(shí)；
[0075] (8)發(fā)酵結(jié)束后，用HPLC分析發(fā)酵液中異亮氨酸濃度，可檢測(cè)到異亮氨酸28g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，一株谷氨酸棒狀桿菌包含SEQ ID No.1 - 9所示 的序列。2. 如權(quán)利要求1所述的一株谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌具體為 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)YI，保藏號(hào)為CGMCC No. 12153。3. 權(quán)利要求1或2所述谷氨酸棒狀桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的谷氨酸棒狀桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于，具體步 驟如下： (1) 斜面培養(yǎng):置于32 °C培養(yǎng)箱，第一代活化斜面培養(yǎng)24h，第二代活化斜面培養(yǎng)12h，經(jīng) 過(guò)兩代活化培養(yǎng)之后的菌種直接接種于搖瓶種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，或置于4°C保存； (2) 搖瓶種子培養(yǎng):容積1000 mL的三角瓶，裝液量為IOOmL，從二代斜面上接種2-4環(huán)，置 于水平旋轉(zhuǎn)搖床，32 °C，200r/min，培養(yǎng)12h，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間； (3) 二級(jí)種子培養(yǎng):接種量為8-10%，32°C培養(yǎng)，溶氧維持在20-30%，培養(yǎng)過(guò)程使用氨 水調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，培養(yǎng)至0D_ = 15-20; (4) 發(fā)酵罐發(fā)酵:接種量為10-13%，32°C培養(yǎng)，溶氧維持在20-30%，培養(yǎng)過(guò)程使用氨水 調(diào)節(jié)pH維持在6.4-7.2之間，發(fā)酵液葡萄糖濃度維持不低于10g/L，培養(yǎng)32-40h。5. 如權(quán)利要求4所述谷氨酸棒狀桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于，所述活化 斜面培養(yǎng)基組成為:葡萄糖l〇g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，瓊 脂條20g/L，蒸餾水1000 mL，pH 6.7-7.2; 所述搖瓶種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g， NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4· I2H2O 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨 酸〇 · Ig，纈氨酸〇 · Ig，苯酚紅溶液(〇 · 4g/L)20mL，蒸餾水1000 mL，pH 6 · 7-7 · 2; 所述二級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g，酵母粉5g，豆餅粉水解液20mL，玉米漿20g， NaCl 5g，MgS〇4.7H20 2g，KH2P〇4· 12H2〇 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 O.Olg，亮氨 酸0· Ig，結(jié)I氨酸0· Ig，蒸餾水1000 mL，pH 6.7-7.2; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖60g，豆餅粉水解液25mL，玉米漿40g，MgS〇4 · 7H202g， ΚΗ2Ρ〇4·12Η20 2g，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.01g，MnS〇4.H20 0.01g，VBi O.Olg，蒸餾水1000 mL, ρΗ6·7-7·2〇
【文檔編號(hào)】C12P13/06GK105886431SQ201610270771
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】謝希賢, 陳寧, 馬躍超, 徐慶陽(yáng), 張成林, 李燕軍, 范曉光, 馬倩, 杜麗紅, 陳啟欣, 石拓
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)