一種產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體涉及一種產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方 法與應用。
【背景技術】
[0002] 莽草酸（3, 4, 5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-ca;rboxylic acid, shikimic acid，SA)呈白色晶體狀，比旋光度[α ] = -157° XcmVgXdnT1，最大紫外吸收在235nm， 其具有多種同分異構體，但只有α型的同分異構體具有生物學活性。莽草酸除可用于合成 苯丙氨酸、絡氨酸、色氨酸外，還可用于合成維生素、己二酸等化合物。莽草酸可以通過化學 合成、微生物發(fā)酵、植物萃取等手段獲得。傳統(tǒng)的莽草酸生產(chǎn)主要通過植物萃取進行，植物 八角茴香的果實是工業(yè)上獲得莽草酸的主要來源。但由于八角茴香僅分布在全球極少數(shù)地 區(qū)，其產(chǎn)量受氣候、自然環(huán)境等因素的影響，因此嚴重限制了莽草酸的產(chǎn)量?；瘜W合成莽草 酸由于產(chǎn)率不高、工藝復雜、價格高昂因而未能廣泛開展。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸具有 操作簡單、能耗小、生產(chǎn)成本及低無污染等優(yōu)點，在當今資源需求量較大、能源緊張、環(huán)保要 求不斷提高的情況下，展現(xiàn)了特有的優(yōu)越性和廣闊的發(fā)展空間。
[0003] 現(xiàn)有的產(chǎn)莽草酸的菌株主要是通過對莽草酸途徑基因改造的方式過表達途徑中 的aroG、aroB、aroD、aroE四個基因，雖然經(jīng)過以上方法改造的菌株可以在一定條件下提升 莽草酸的生產(chǎn)效率，但對莽草酸途徑的改造策略只強調了過表達途徑中的基因，而在翻譯 水平使用相同的RBS元件來控制基因的表達，限制了對莽草酸表達能力的進一步提高。例 如：Chen等人對大腸桿菌進行改造，其菌株的莽草酸產(chǎn)量僅為1.85g/L (Chen K，Dou J，Tang S, Yang Y, Wang Η, Fang Η, Zhou C(2012)Deletion of the aroK gene is essential for high shikimic acid accumulation through the shikimate pathway in E.coli. Bioresour Technol 119:141-7)。Cui等人對大腸桿菌進行改造，其菌株的莽草酸產(chǎn)量也 僅為 3. 12g/L(Cui YYjLing CjZhang YYjHuang JjLiu JZ(2014)Production of shikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomal evolution and cofactor metabolic engineering. Microb Cell Fact 13:21)〇

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用，通過選 擇適當?shù)腞BS序列調整莽草酸表達途徑中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表達量，從而大大 提高莽草酸的產(chǎn)量。
[0005] 本發(fā)明提供一種產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，還 包含調控aroG基因表達的RBS1、調控aroB基因表達的RBS2、調控aroD基因表達的RBS3 和調控aroE基因表達的RBS4 ;aroG的基因序列為SEQ ID N0:6所示，aroB的基因序列為 SEQ ID NO: 7所示，aroD的基因序列為SEQ ID NO:8所示，aroE的基因序列為SEQ ID NO:9 所示；
[0006] 在上述技術方案中，RBS1的基因序列為SEQ ID NO :1所示，RBS2的基因序列為SEQ ID NO: 2所示，RBS3的基因序列為SEQ ID NO: 3所示，RBS4的基因序列為SEQ ID NO:4所 不O
[0007] 在上述技術方案中，aroB基因與aroD基因之間還插入有終止子2,終止子2的基 因序列為SEQ ID NO: 11所示。
[0008] 在上述技術方案中，還包含RiboJ基因，RiboJ的基因序列為SEQ ID NO: 5所示。
[0009] 在上述技術方案中，aroG基因與aroG基因的啟動子之間插入有RiboJ基因，所述 ar〇B基因與aroB基因的啟動子之間插入有RiboJ基因、所述aroD基因與aroD基因的啟動 子之間插入有RiboJ基因，所述aroE基因與aroE基因的啟動子之間插入有RiboJ基因。 [0010] 本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌的構建方法，包括如下步驟：
[0011] 1)將 aroG、aroB、aroD 和 aroE 基因分別插入載體 pXMJ19,得到載體 pXMJ19_aroG、 pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19_aroE ;
[0012] 2)將aroG中的HindIII和PstI酶切位點，aroB中的BamHI和SpeI酶切位點，aroD 中的PstI酶切位點，aroE中的EcoRI和Sail酶切位點進行突變，得到載體pXMJ19-aroGm、 pXMJ19-aroB?、pXMJ19-aroDm、pXMJ19-aroE?;
[0013] 3)將RiboJ基因插入載體pXMJ19,得到載體pXMJ19-RiboJ ;
[0014] 4)將熒光蛋白基因插入載體pXMJ19_Rib〇J，得到載體pZB ;
[0015] 5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以pXMJ19-aroG?為模板擴增基因片段 aroG?，用引物 MU-RBSAB-F 和 MU-RBSAB-R 以 pXMJ19-aroBm為模板擴增基因片段 aroB m， 用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以pXMJ19-aroD?為模板擴增基因片段aroD ?，用引物 MU-RBSAE-F 和 MU-RBSAE-R 以 pXMJ19-aroEm為模板擴增基因片段 aroE
[0016] 6)將步驟5)中擴增的基因片段&1'〇6' &1^'&1'〇0?和&1^"11分別插入載體？28， 得到載體 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE ;
[0017] 7)步驟6)得到的載體分別轉化大腸桿菌，對得到的克隆進行測序，將測序無 誤的載體 pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD 和 pZB-aroE 共同轉化至 Corynebacterium glutamicumAaroK中，培養(yǎng)并檢測焚光強度；
[0018] 8)用引物 aroG-H-F、aroG-H-R 以 pXMJ19-aroG?為模板擴增基因片段 aroG-Η 并 插入載體pXMJ19-RiboJ，得到載體ρΧΜΙΙΘ-Κ?^οΙ-ΒΓοΟ^-Η ;所述aroG-Η的基因序列如SEQ ID NO: 13 所示；
[0019] 9)用引物 aroB-M-F、aroB-M-R 以 pXMJ19-aroB?為模板擴增基因片段 aroB-Μ ;用 aroD-M-F、aroD-M-R 以 pXMJ19-aroD?為模板擴增基因片段 aroD-Μ ;用 aroE-M-F、aroE-M-R 以pXMJ19-aroE?為模板擴增基因片段aroE-Μ ;將擴增的基因片段aroB-M、aroD-Μ和 aroE-Μ 插入載體 pXMJ19-RiboJ，獲得載體 pXMJig-RiboJ-aroB^-MjXMJig-RiboJ-aroD^-M 和 pXMJ19-RiboJ-aroEm-M ;所述 aroB-M、aroD-M 和 aroE-Μ 的基因序列依次分別如 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 所示；
[0020] 10)用引物 PB-F、PB-R 以 pXMJig-RiboJ-aroB^-M 為模板擴增基因片 段 Ptac-aroB-M ;用引物 PD-F、PD-R 以 pXMJ19-RiboJ-aroD?-M 為模板擴增基因片 段Ptac-aroD-M ;用引物PE-F、PE-R以pXMJig-RiboJ-aroE^-M為模板擴增基因片段 Ptac-aroE-M，將基因片段 Ptac-aroB-M 插入載體 ρΧ?νυ?θ-Κ?^οΙ-ΒΓοΟ?1-!!，得到載體 PXMJ19-GHBM ;所述 Ptac-aroB-M 的基因序列如 SEQ ID NO: 17 所示；
[0021] 11)將片段 Ptac-aroD-M 插入載體 pXMJ19-GHBM，得到載體 pXMJ19-GHBMDM ;所述 Ptac-aroD-M的基因序列如SEQ ID NO: 18所示。
[0022] 12)將片段 Ptac-aroE-M 插入載體載體 pXMJ19-GHBMDM，得到載體 pXMJ19-GBDE ; 所述Ptac-aroE-M的基因序列如SEQ ID NO: 19所示；
[0023] 13)用引物 Terminator2_F、Terminator2_R 以 pXMJ19 為模板擴增終止子 2,將終 止子2和載體pXMJ19-GBDE分別用XmaI進行酶切，回收終止子2片段和載體，將終止子2 片段和載體進行連接，得到載體PXMJ19-GBTDE ;
[0024] 14)將 pXMJ19-GBTDE 轉化至 C. glutamicum RES167 Δ aroK，獲得產(chǎn)莽草酸的谷氨 酸棒桿菌。
[0025] 在上述產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌的構建方法中，步驟4)中的熒光蛋白基因為 egfp基因。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)莽草酸的方法，包括如下步驟：
[0027] 按2%~4%體積比的接種量接種上述任一產(chǎn)莽草酸的谷氨酸棒桿菌種子液到滅 菌后冷至發(fā)酵溫度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述種子液的OD值為14,溫度為30°C，通氣速率為 3vvm，發(fā)酵過程中補加蔗糖，攪拌轉速為300rpm的條件下培養(yǎng)發(fā)酵3~5天，獲得含莽草酸 濃度