一種高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]瓜氨酸(Citrulline)是一種α-氨基酸，因1914年右賀太郎等第一次從西瓜中獲取而得名為“瓜氨酸”。后來(lái)游離態(tài)的瓜氨酸在野生西瓜葉片、核桃仁、核桃幼苗等葫蘆科植物的種子中被發(fā)現(xiàn)。瓜氨酸在生物體代謝中起到重要作用，主要參與人體尿素循環(huán)，是尿素形成的重要中間產(chǎn)物，對(duì)于維持人體血氨平衡具有重要的作用。此外瓜氨酸被廣泛應(yīng)用于健康和營(yíng)養(yǎng)方面，如參與重要的信使分子Ν0的生成，肝臟昏迷的治療，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的診斷，作為異體排斥效應(yīng)的指示劑和天然高效的抗氧化劑等。
[0003]瓜氨酸的制備方法主要包括化學(xué)合成法、酶催化法及微生物發(fā)酵法。相比化學(xué)法難以控制、產(chǎn)率不高、純度低;酶法催化效率不高且雜酶易對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾等問(wèn)題，微生物發(fā)酵法合成瓜氨酸具有成本低廉、產(chǎn)品純度高、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，因此生物法制備瓜氨酸成為今年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前生物法合成瓜氨酸的主要菌種包括:Corynebacteriumhydrocarboclastus、Enterococcusfaecalis、Escherichia col1、Corynebacteriumcrenatum等。其中谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum因其生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐受性強(qiáng)、發(fā)酵條件成熟，成為最具潛力的生產(chǎn)瓜氨酸的工業(yè)菌種。但是野生谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸的過(guò)程中，總是伴隨著副產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-谷氨酸，影響了發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量，增加了后續(xù)分離的負(fù)荷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸中的應(yīng)用。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
發(fā)明人通過(guò)低能離子束注入技術(shù)，對(duì)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032進(jìn)行誘變，經(jīng)三輪篩選得到一株谷氨酸棒桿菌，其好氧下可高產(chǎn)瓜氨酸，同時(shí)不產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-谷氨酸。該菌株，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)CIT002,目前該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC N0.11567，保藏日期是2015年11月3日。以此菌作為生產(chǎn)菌株。
[0006]CGMCC N0.11567菌株具有下述性質(zhì):
1、菌落形態(tài)學(xué)特征: 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C劃線培養(yǎng)呈中度生長(zhǎng)，菌苔線狀，24h為白色，48h后稍呈淡黃色，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色稍增深。表面濕潤(rùn)、光滑，有光澤，無(wú)黏性。
[0007]2、生理與生化特性:
a.培養(yǎng)溫度:28?39°C，最適溫度為30°C;
b.在pH5.0?8.5范圍內(nèi)生長(zhǎng);
c.色素產(chǎn)生情況:不產(chǎn)色素；
3、營(yíng)養(yǎng)特征:
谷氨酸棒桿菌可在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)基成分明確且價(jià)格低廉。該培養(yǎng)基碳源一般為葡萄糖或玉米糖化液，氮源可選用玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素以及(NH4)2S04等，培養(yǎng)基中還包括鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽、鐵鹽、錳鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽等常用的無(wú)機(jī)鹽類，根據(jù)不同的氮源而定，以硫酸銨或尿素為唯一氮源時(shí)需全添加，在以玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏時(shí)可以少量或不加入無(wú)機(jī)鹽。
[0008]利用上述高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)瓜氨酸的方法，將保藏號(hào)為CGMCCN0.11567的菌株活化后，在28?39°C下好氧發(fā)酵48?72h;
其中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基:碳源20?80g/L，氮源10~40g/L，無(wú)機(jī)鹽0?3g/L，生長(zhǎng)因子0~0.3mg/L，其余為水，pH 5.0-7.5；
其中，所述的碳源為葡萄糖。
[0009]其中，所述的氮源為硫酸銨。
[0010]其中，所述的無(wú)機(jī)鹽為鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、銅鹽、鈣鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或鹽酸鹽中的任意一種或幾種的組合。
[0011]其中，所述的生長(zhǎng)因子為生物素和維生素中的任意一種或兩種的組合。
[0012]最優(yōu)選的生產(chǎn)方式為:將保藏號(hào)為CGMCCN0.11567的菌株活化后，在30°C下好氧發(fā)酵48?72h，裝液量為30ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0013]其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖40g/L，K2HP04.3H20 1.5g/L,KH2PO40.5g/L，MgS04.7H20 0.4 g/L,FeS04.7H20 20mg/L，MnS(VH20 20mg/L，尿素 5g/L，生物素100yg/L，維生素B1 200yg/L，其余為水，pH 7。
[0014]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì):
(1)與化學(xué)法及酶催化法相比，能耗低，污染小，使用非化石資源作為原料，無(wú)需使用貴重金屬作為催化劑，成本低廉，過(guò)程易操控，產(chǎn)量高。
[0015](2)與原始菌相比，發(fā)酵產(chǎn)物單一，副產(chǎn)物少，產(chǎn)量高。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明菌株CGMCCN0.11567好氧發(fā)酵終點(diǎn)的高效液相色譜氨基酸檢測(cè)圖譜。其中，標(biāo)號(hào)1的峰為瓜氨酸的響應(yīng)峰。
【具體實(shí)施方式】
[0017]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1
平板培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，pH7.0。
[0019]好氧發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L，K2HP04.3H20 1.5g/L,KH2P04 0.5g/L,MgS04.7H200.4 g/L，F(xiàn)eS04.7H20 20mg/L，尿素 5g/L，生物素 100yg/L，維生素B1 200yg/L，初始pH7.0。500mL三角瓶裝液量30mL，115°C滅菌10分鐘。
[0020]分別將保藏號(hào)為ATCC13032及CGMCC N0.11567菌首先于30°C平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入裝液量為30ml發(fā)酵液/500ml三角瓶，30°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm。發(fā)酵48h后CGMCC%.11567的發(fā)酵液中含有5.438/1瓜氨酸。較4了0:13032相比，瓜氨酸產(chǎn)量提高了10.24倍，沒(méi)有副產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-谷氨酸。
[0021 ] 實(shí)施例2
平板培養(yǎng)基:同實(shí)施例1;
好氧發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米糖化液500mL/L(玉米糖化液的含糖量約為100g/L)，Κ2ΗΡ04.3H201.5g/L，KH2P04 0.5g/L，MgS04.7H20 0.4 g/L,FeS04.7H20 20mg/L，尿素 2.5g/L，生物素100yg/L，維生素B1 200yg/L，初始pH7.0。5L發(fā)酵罐裝液量4L，115°C滅菌10分鐘。
[0022]分別將保藏號(hào)為ATCC13032及CGMCC N0.11567菌首先于30°C平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入4L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速800rpm，30°C培養(yǎng)。發(fā)酵60h后CGMCC N0.的發(fā)酵液中含有12.8g/L瓜氨酸。較ATCC13032相比，瓜氨酸產(chǎn)量提高了24.2倍，沒(méi)有副產(chǎn)物1^-賴氨酸和L-谷氨酸。
[0023]實(shí)施例3
平板培養(yǎng)基:同實(shí)施例1;
好氧發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40g/L，玉米漿干粉10g/L，初始pH7.0。5L發(fā)酵罐裝液量4L，115°C滅菌10分鐘。
[0024]分別將保藏號(hào)為ATCC13032及CGMCC N0.11567菌首先于30°C平板活化菌種，24h后接兩環(huán)生長(zhǎng)良好的菌體入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后按照3%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接入4L發(fā)酵培養(yǎng)基，通空氣lv/vm，轉(zhuǎn)速800rpm，30°C培養(yǎng)。發(fā)酵60h后CGMCC N0.11567的發(fā)酵液中含有11.8g/L瓜氨酸。較ATCC13032相比，瓜氨酸產(chǎn)量提高了22.2倍，沒(méi)有副產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-谷氨酸。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)CIT002，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)是CGMCC N0.11567。2.權(quán)利要求1所述高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將保藏號(hào)為CGMCCN0.11567的菌株活化后，在28?39°C下好氧發(fā)酵48?72h; 其中，好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基:碳源20?80g/L，氮源10?40g/L，無(wú)機(jī)鹽0?3g/L，生長(zhǎng)因子0~0.3mg/L，其余為水，pH 5.0~7.5ο4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的碳源為葡萄糖或者玉米糖化液。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的氮源為玉米漿干粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素或者(NH4)2S04中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)鹽為鉀鹽、錳鹽、鐵鹽、鎂鹽、鋅鹽、銅鹽、鈣鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或鹽酸鹽中的任意一種或幾種的組合。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生長(zhǎng)因子為生物素和維生素中的任意一種或兩種的組合。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將保藏號(hào)為CGMCCN0.11567的菌株活化后，在30°C下好氧發(fā)酵48?7 2h，轉(zhuǎn)速為200rpm ； 其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖40g/L，K2HP(V3H20 1.5g/L,KH2P04 0.5g/L,MgS04.7H20 0.4 g/L，F(xiàn)eS04.7H20 20mg/L，MnS04.H20 20mg/L，尿素 5g/L，生物素 .100yg/L，維生素B1 200yg/L，其余為水，pH 7。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將保藏號(hào)為CGMCCN0.11567的菌株活化后，在30°C下好氧發(fā)酵48?7 2h，轉(zhuǎn)速為800rpm ； 其中，所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)基為:玉米糖化液500mL/L，K2HPO4.3H20 1.5g/L，KH2PO4.0.5g/L，MgS04.7H20 0.4 g/L,FeS04.7H20 20mg/L，尿素 2.5g/L，生物素 100yg/L，維生素B1 200yg/L，初始 pH7.0。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)瓜氨酸中的應(yīng)用，所述菌株的分類命名為谷氨酸棒桿菌（<i>Corynebacterium</i><i>？glutamicum</i>）CIT002<i></i>，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)是CGMCC？No.11567。本發(fā)明還公開(kāi)了利用上述高產(chǎn)瓜氨酸的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)瓜氨酸的方法。本發(fā)明方法與化學(xué)法相比，能耗低，污染小，使用非化石資源作為原料，成本低廉，過(guò)程易操控，產(chǎn)量高。本發(fā)明菌株與原始菌相比，發(fā)酵產(chǎn)物單一，副產(chǎn)物少，產(chǎn)量高。CGMCC No.1156720151103
【IPC分類】C12P13/10, C12N1/20, C12R1/15
【公開(kāi)號(hào)】CN105483060
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610032245
【發(fā)明人】郝寧, 申朋, 劉兆星, 許琳, 歐陽(yáng)平凱
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日