專利名稱：L－氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中向發(fā)酵液中加入L-脯氨酸作為滲透保護(hù)物質(zhì)。
已知在滲透壓力下，大多數(shù)微生物在其細(xì)胞質(zhì)中濃縮鉀離子或所謂的滲壓劑(有機(jī)化合物)，這導(dǎo)致內(nèi)部滲透阻力，從而防止細(xì)胞脫水。在這一方面，已知加入甜菜堿能刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，尤其是在具有抑制滲透壓的培養(yǎng)基中。這會(huì)導(dǎo)致糖消耗速率的增加，以及L-賴氨酸的產(chǎn)量增加(Y.Kawahara，Y.Yoshihara，S.Ikeda，H.Yoshii，Y.Hirose，甜菜堿對(duì)L-賴氨酸發(fā)酵的刺激效應(yīng)，(1990)，34(1)，pp87-90，應(yīng)用微生物學(xué)生物工程)。
在乳發(fā)酵短桿菌的脯氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體中，已發(fā)現(xiàn)脯氨酸在滲透調(diào)節(jié)中起一定作用。
已證明這些菌株的滲透耐受性比其野生型菌株低，在這一方面，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞在滲透壓力下生長(zhǎng)時(shí)，吡咯啉-5-羧酸還原酶的活性提高3倍(Y.Kawahara，T.Ohsumi，Y.Yoshihara，S.Ikeda，脯氨酸在乳發(fā)酵短桿菌的滲透調(diào)節(jié)中，(1989)，53(9)，pp2475-2479，農(nóng)業(yè)及生物化學(xué))。
在上述文獻(xiàn)中未涉及氨基酸的生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其中高滲透壓對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)被抑制。
本發(fā)明提供了一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于將產(chǎn)生和分泌L-氨基酸的棒狀桿菌在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)基除了常規(guī)組分外，還添加有L-脯氨酸，優(yōu)選地是在發(fā)酵開始時(shí)加入L-脯氨酸。其特別適用于由規(guī)定量和類型的組分組成的所謂的最小培養(yǎng)基和確定成分培養(yǎng)基。但是在包括水解物或提取物的復(fù)合培養(yǎng)基中加入L-脯氨酸也能提高產(chǎn)量。
此處L-脯氨酸并不作為微生物代謝中的C源或N源，但是其添加能促進(jìn)氨基酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)并增加L-氨基酸的產(chǎn)量。
棒狀桿菌特別是谷氨酸棒狀桿菌很久以來(lái)就已知是一種氨基酸生產(chǎn)菌種。優(yōu)選地使用適于生產(chǎn)L-賴氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸或L-纈氨酸的菌株。L-谷氨酸也可以如此方式生產(chǎn)。
發(fā)酵通常在25-50℃、優(yōu)選地30-45℃進(jìn)行，同時(shí)pH為6-8，優(yōu)選地pH為7-7.5，銨濃度優(yōu)選地為0.5-8g/l。
L-脯氨酸以0.01-10g/l、優(yōu)選地0.1-2.5g/l的量加入到發(fā)酵液中。
棒狀桿菌屬特別是谷氨酸棒狀桿菌的合適菌株是例如已知的生產(chǎn)谷氨酸的野生型菌株谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032，醋谷棒狀桿菌ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870，黃色短桿菌ATCC14067，乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC14020及由其產(chǎn)生的突變體和菌株，如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒狀桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712或如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒狀桿菌FERM-P 5835黃色短桿菌FERM-P 4164和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 4180或如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒狀桿菌FERM-P 756黃色短桿菌FERM-P 759和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 4192或如生產(chǎn)L-纈氨酸的菌株黃色短桿菌FERM-P 512和乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1845。
用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是用于生產(chǎn)本發(fā)明中所提到的L-氨基酸的已知基本培養(yǎng)基，或者常規(guī)用于生產(chǎn)L-氨基酸并且適用于生產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌的培養(yǎng)基。
如通常已知的，所用的主要碳源是糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和淀粉水解物、纖維素和糖化纖維素、乳糖；脂肪酸，如乙酸、丙酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；有機(jī)酸，如丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸；醇類，如乙醇、丁醇；上述化合物的單個(gè)組分或化合物。另外，來(lái)自所選的L-氨基酸的生物合成途徑的前體或L-氨基酸本身也可以使用。
所用磷源通常是磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。
所用的氮源是通常已知的銨鹽，如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸銨、尿素、液態(tài)氨或氨水。所用的復(fù)合有機(jī)氮源是酪蛋白氨基酸、玉米浸漬液、豆粉水解物、酵母提取物、生物量水解物和蛋白水解物。
可以使用的無(wú)機(jī)鹽是磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鉀鹽、鈉鹽、鐵鹽、錳鹽、鋅鹽、銅鹽，及其它微量元素，如果需要。另外，如果需要，可以使用維生素如生物素、硫胺等。
本發(fā)明的培養(yǎng)條件與已知的氨基酸發(fā)酵培養(yǎng)條件相同。盡管發(fā)酵液的組成根據(jù)L-氨基酸或所用菌株而變化，但是培養(yǎng)溫度為25-50C，優(yōu)選30-45℃。關(guān)于pH值，當(dāng)pH值處于中性范圍時(shí)能獲得良好的結(jié)果。當(dāng)使用蛋白水解物作為復(fù)合氮源時(shí)，其中所含的脯氨酸含量有利地是計(jì)算進(jìn)補(bǔ)加的脯氨酸量中。由水解物來(lái)源的脯氨酸的量由這些產(chǎn)物的天然組成限制，從而在本發(fā)明方法框架內(nèi)加入另外的脯氨酸證明是有利的。
實(shí)施例本發(fā)明以下經(jīng)實(shí)施例更詳細(xì)地描述。
為此，用下列氨基酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行試驗(yàn)，在試驗(yàn)中證明了本發(fā)明方法的優(yōu)越性L-賴氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌DSM5715，(EP-B 0 435132)和L-蘇氨酸及L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株黃色短桿菌DSM5399，(EP-B 0 385 940)實(shí)施例1 L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)用氫氧化鈉將含2.5g/lNaCl、10g/l蛋白胨和10g/l酵母膏的培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為pH7.4，熱滅菌后，每升培養(yǎng)基中加入40ml 50％葡萄糖溶液。用接種針挑取在腦心浸液瓊脂板上培養(yǎng)48小時(shí)的谷氨酸棒狀桿菌DSM5715接種到47ml所述培養(yǎng)基中，在購(gòu)自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培養(yǎng)箱中于33℃以150rpm振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。然后用無(wú)菌生理鹽水洗細(xì)胞，在Beckman離心機(jī)J 6B中以4000rpm離心20分鐘分離細(xì)胞。
為了在搖瓶中進(jìn)行主培養(yǎng)，在1升燒杯中稱入40g(NH4)2SO4，0.5gKH2PO4，0.5g K2HPO4，0.25g MgSO4·7H2O和0.3g L-亮氨酸，并向其中加入750ml蒸餾水。還加入1ml微量元素鹽溶液，該微量元素鹽溶液含有溶解于100ml蒸餾水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O，該溶液用幾滴HCl稍加酸化以增加鹽的溶解。另外，還加入1ml 0.02g生物素在100ml蒸餾水中的溶液。隨后加入NaCl至濃度為5g/l。將這-培養(yǎng)基分成45ml的等份，置于500ml Erlenmeyer燒瓶中，并調(diào)節(jié)脯氨酸至0.1-10g/l的各種濃度。在121℃熱滅菌20分鐘后，向每個(gè)燒瓶中加入單獨(dú)滅菌的12ml 50％葡萄糖溶液和1.2g無(wú)菌CaCO3。然后用前述已在無(wú)菌狀態(tài)下洗滌的培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種，洗滌的細(xì)胞的光密度為18.5(測(cè)定用波長(zhǎng)535nm)，用7.7ml這種懸液接種57ml培養(yǎng)基。
在購(gòu)自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培養(yǎng)箱中于33℃以150rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，隨后測(cè)定光密度(OD)(購(gòu)自Dr.Lange，德國(guó)柏林的分光光度計(jì)LP2W)及培養(yǎng)懸液中的L-氨基酸的濃度。用購(gòu)自Eppendorf BioTronik(德國(guó)漢堡)的氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析及利用茚三銅的柱層析后反應(yīng)分析氨基酸。測(cè)試結(jié)果見表1。
表1脯氨酸(g/l)OD 535nm賴氨酸(g/l)024.6 23.60.5 30.5 29.4實(shí)施例2 L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)將含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、100ml/l大豆粉水解物、0.5gKH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素鹽溶液的培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為7.0并高壓滅菌。該微量元素鹽溶液由溶解于100ml去離子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及幾滴1N HCl組成。
將各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺儲(chǔ)存液(已過(guò)濾除菌)加入到培養(yǎng)基中。將10.0g/l CaCO3與搖瓶一起滅菌。培養(yǎng)基中由引入豆粉水解物產(chǎn)生的脯氨酸濃度為0.34g/l。向過(guò)濾除菌的培養(yǎng)基中加入來(lái)自脯氨酸儲(chǔ)存溶液的規(guī)定濃度的脯氨酸。
將在腦心浸液瓊脂板上培養(yǎng)72小時(shí)的DSM5399懸浮于10ml無(wú)菌生理鹽水中，將10ml培養(yǎng)基等份置于100ml Erlenmeyer搖瓶中并接種100μl上述細(xì)胞懸液。于30℃以300rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，之后如實(shí)施例1所述，測(cè)定波長(zhǎng)660nm的OD及蘇氨酸的濃度。測(cè)試結(jié)果見表2。
表2脯氨酸(g/l)OD 660nm蘇氨酸(g/l)0.3451.2 0.630.6652.6 1.29實(shí)施例3 L-異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)將含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素鹽溶液的培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為7.0并高壓滅菌。該微量元素鹽溶液由溶解于100ml去離子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02gCuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及幾滴1N HCl組成。
將各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺儲(chǔ)存液(已過(guò)濾除菌)加入到培養(yǎng)基中。將10.0g/l CaCO3與搖瓶一起滅菌。培養(yǎng)基中由引入豆粉水解物產(chǎn)生的脯氨酸濃度為0.34g/l。向過(guò)濾除菌的培養(yǎng)基中加入來(lái)自脯氨酸儲(chǔ)存溶液的規(guī)定濃度的脯氨酸。
將在腦心浸液瓊脂板上培養(yǎng)72小時(shí)的DSM5399懸浮于10ml無(wú)菌生理鹽水中，將10ml培養(yǎng)基等份置于100ml Erlenmeyer搖瓶中并接種100μl上述細(xì)胞懸液。于30℃以300rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，之后如實(shí)施例1所述，測(cè)定波長(zhǎng)660nm的OD及異亮氨酸的濃度。測(cè)試結(jié)果見表3。
表2脯氨酸(g/l)OD 660nm異亮氨酸(g/l)051.2 0.180.1 52.0 0.3權(quán)利要求
1.通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生并分泌L-氨基酸的棒狀桿菌而發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于優(yōu)選地在發(fā)酵開始時(shí)向含有已知碳源和氮源的發(fā)酵液中加入L-脯氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于基于發(fā)酵液，L-脯氨酸的加入量為0.01-10g/l。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于基于發(fā)酵液，L-脯氨酸的加入量為0.1-2.5g/l。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于發(fā)酵是在最小培養(yǎng)基和/或確定成分培養(yǎng)基中進(jìn)行。
5.權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于發(fā)酵是在含有水解物的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其特征在于生產(chǎn)出L-賴氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸或L-纈氨酸。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其特征在于使用棒狀桿菌屬的微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L－氨基酸的方法,其中向發(fā)酵液中加入L－脯氨酸作為滲透保護(hù)物質(zhì)以抑制高滲透壓力對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12P13/06GK1257930SQ9912209
公開日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1999年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月28日
發(fā)明者烏爾里?！へ惪藸? 海丁·波得, 蘇珊·莫爾巴赫, 伊洛娜·瓦爾格, 賴因哈德·克雷默, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請(qǐng)人:德古薩－于爾斯股份公司