專利名稱：一種提取分離高純度杯莧甾酮的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用大孔樹(shù)脂和高速逆流色譜法分離制備高純度杯莧留酮的工藝。
背景技術(shù)：
川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)為覓科杯覓屬多年生草本植物，別名甜膝，主要分布于四川、云南和貴州，野生或栽培，生長(zhǎng)于海拔1500米以上的地區(qū)，為著名的川產(chǎn)地道中藥材，是極常用且是重要的出口品種。川牛膝的主要成分為生物堿、川牛膝主要和含留類化合物、皂苷、多糖和少量異黃酮類以及多種微量元素等化學(xué)成分，其中留類化合物包括杯莧留酮、異杯莧留酮、5-表杯莧留酮、羥基杯莧留酮、蛻皮留酮、莧菜留酮A及B、頭花杯莧甾酮、前杯莧甾酮、后甾酮等。黎萬(wàn)壽等的藥理研究表明，杯莧甾酮對(duì)去勢(shì)小鼠的體 重和子宮系數(shù)有增加趨勢(shì)，子宮濕重有顯著增長(zhǎng)，提示其為川牛膝的雌激素樣活性的有效成分；杯莧留酮能增加去勢(shì)大鼠提肛肌重量，提示其有蛋白質(zhì)同化作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杯莧甾酮的藥理活性與川牛膝強(qiáng)筋健骨“其滋補(bǔ)之功如牛之多力也”相符，與中醫(yī)臨床用藥功能主治基本吻合，可以作川牛膝的對(duì)照品。現(xiàn)常采用醇提、氧化鋁柱層析分離等對(duì)杯莧留酮進(jìn)行提取分離，由于生產(chǎn)周期長(zhǎng)、制備量小、純度低，難以滿足需要，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種提取分離高純度杯覓留酮的制備工藝。高速逆流色譜(HighSpeed Countercurrent Chromatography,簡(jiǎn)稱 HSCCC)是國(guó)際上于上世紀(jì)80年代以來(lái)在液-液分配色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型分離技術(shù)，其分離原理是利用螺旋柱在高速行星運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的巨大離心力，使螺旋柱中互不相容的兩相不斷混合，達(dá)到穩(wěn)定的流體動(dòng)力學(xué)平衡態(tài)，此時(shí)在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑都反復(fù)進(jìn)行著混合和靜置的分配過(guò)程，這一過(guò)程頻率極高，當(dāng)柱心以SOOrpm旋轉(zhuǎn)時(shí)，頻率超過(guò)每秒13次。流動(dòng)相不斷地穿過(guò)固定相，同時(shí)保留其中的一相(固定相)，利用橫流泵連續(xù)輸入另一相(流動(dòng)相)，流動(dòng)相載著溶質(zhì)(樣品)進(jìn)入螺旋柱并不斷反復(fù)穿過(guò)固定相，使樣品再兩相之間也不斷反復(fù)地進(jìn)行分批額，由于樣品中各組分再兩相中分配系數(shù)不同，導(dǎo)致在螺旋柱中的移動(dòng)速度不同，因而能使樣品各組分按分配系數(shù)的次序，依次得到分離。高速逆流色譜作為一種新型的分配技術(shù)，有許多優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)液-固色譜無(wú)法比擬的，因而有很廣闊的應(yīng)用前景。首先，它的流動(dòng)相、固定相均為液體，不需要固體載體，避免了液-固色譜常會(huì)造成的固體載體對(duì)樣品的不可逆吸附，可以保證樣品再不損失任何一種組分的情況下得到分離，理論上樣品回收率相當(dāng)高；其次，它的分離效率高，可以達(dá)到幾千個(gè)理論塔板數(shù)，尤其在天然產(chǎn)物組分分離提取中有較高的分離度，有的樣品經(jīng)過(guò)一次分離就可以得到一個(gè)甚至多個(gè)單體，并且分離時(shí)間也短，一般是幾個(gè)小時(shí)即可完成一次分離；此夕卜，它使用常規(guī)試劑，有廣泛的液-液分配體系可供選擇，體系更換方便、快捷；它的進(jìn)樣量大，可以從毫克到克量級(jí)，進(jìn)樣體積可達(dá)20ml以上，這對(duì)于樣品的純化制備顯示出驚人的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取分離高純度杯莧留酮的制備工藝，所得產(chǎn)品杯莧甾酮含量達(dá)98%以上。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種提取分離高純度杯莧留酮的制備工藝，其特征在于將牛膝藥材粉碎過(guò)20-50目篩，加入5-10倍量提取溶劑，加熱至60-80°C，提取2_3次，每次1_3小時(shí)，合并提取液，減壓回收乙醇，所得提取物用大孔樹(shù)脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總留酮浸膏；將總留酮浸膏采用高速逆流色譜分離制備 高純度杯莧留酮，所得產(chǎn)品杯莧留酮含量為98%以上。所述提取溶劑為50-95%的乙醇水溶液。所述大孔樹(shù)脂柱分離采用濕法裝柱，洗脫液減壓回收至相對(duì)密度I. 15-1. 20 (600C測(cè))。所述高速逆流色譜分配系統(tǒng)為庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三種組分的體積比為(5-12) (9-12) (1-5)。所述高速逆流色譜恒溫循環(huán)器溫度為25_28°C。所述高速逆流色譜流動(dòng)相的流速為2_5ml/min。所述高速逆流色譜達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，將樣品溶液泵入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器，在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè)，與杯莧留酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集液蒸除溶劑，干燥即得產(chǎn)品。本發(fā)明采用大孔樹(shù)脂吸附，處理量大；通過(guò)采用合理的溶劑體系、控制主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速，可得到高純度的杯莧留酮，整個(gè)工藝條件溫和、損失少。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入8L的70%乙醇加熱提取2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度I. 19(60°C測(cè))，將濃縮液置于DlOl型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(5 : 11 : 4)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以900r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以2. 2ml/min的流速泵入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧甾酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 55g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98.6%。實(shí)施例2:將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入5L的80%乙醇加熱提取3次，每次3小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度117 (60°C測(cè))，將濃縮液置于AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用65%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(7 10 5)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以800r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以3. Oml/min的流速泵入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧留酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧留酮流出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 58g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98. 5%。實(shí)施例3 將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入7L的50%乙醇加熱提取2次，每次I小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度I. 18(60°C測(cè))，將濃縮液置于DlOl型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(8 : 12 : 3)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以850r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以5. Oml/min的流速泵 入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧甾酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 63g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98.7%。實(shí)施例4 將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入IOL的65%乙醇加熱提取3次，每次I小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度I. 15 (60°C測(cè))，將濃縮液置于DlOl型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(12 8 I)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以900r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以3. 5ml/min的流速泵入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧留酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧留酮流出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 62g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98. 4%。實(shí)施例5 將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入6L的75%乙醇加熱提取2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度I. 20(60°C測(cè))，將濃縮液置于AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用72%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將庚烷-甲醇-二氯甲烷(10 : 9 : 2)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以880r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以2. 5ml/min的流速泵入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧甾酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧甾酮流出液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 54g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98.9%。實(shí)施例6 將川牛膝藥材粉碎過(guò)50目篩，取Ikg加入8L的95%乙醇加熱提取2次，每次I. 5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度I. 18(60°C測(cè))，將濃縮液置于AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱中，采用濕法裝柱，用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得川牛膝總留酮浸膏；然后采用高速逆流色譜分離川牛膝總甾酮浸膏，將正己烷-乙腈-丙酮(9 10 3)系統(tǒng)置于分液漏斗中振搖，放置，分別取上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，將固定相泵入色譜柱中，使柱中充滿固定相，讓儀器以1000r/min轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)將流動(dòng)相以4. 4ml/min的流速泵入，待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到平衡后，將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中。在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，與杯莧甾酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集杯莧甾酮流出液， 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，干燥，得到O. 60g杯莧留酮，經(jīng)HPLC法測(cè)定其含量為98. 2%。
權(quán)利要求
1.一種提取分離高純度杯莧留酮的制備工藝，其特征在于將牛膝藥材粉碎過(guò)20-50目篩，加入5-10倍量提取溶劑，加熱至60-80°C，提取2-3次，每次1_3小時(shí)，合并提取液，減壓回收乙醇，所得提取物用大孔樹(shù)脂吸附，先用水洗至色淡，再用60-80%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到總留酮浸膏；將總留酮浸膏采用高速逆流色譜分離制備高純度杯莧甾酮，所得產(chǎn)品杯莧留酮含量為98 %以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述提取溶劑為50-95%的乙醇水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述大孔樹(shù)脂柱分離采用濕法裝柱，洗脫液減壓回收至相對(duì)密度I. 15-1. 20(60°C測(cè))。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述高速逆流色譜分配系統(tǒng)為庚烷-甲醇-二氯甲烷或正己烷-乙腈-丙酮，三種組分的體積比為(5-12) (9-12) (1-5)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述高速逆流色譜恒溫循環(huán)器溫度為 25-28 0C o
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述高速逆流色譜流動(dòng)相的流速為.2-5ml/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備工藝，其特征在于所述高速逆流色譜達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，將樣品溶液泵入色譜系統(tǒng)中，同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器，在246nm波長(zhǎng)處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè)，與杯莧留酮的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)，收集液蒸除溶劑，干燥即得產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取分離高純度杯莧甾酮的制備工藝，其特征在于將川牛膝藥材粉碎，加入適量溶劑提取，濾過(guò)，濃縮，濃縮液先后采用大孔吸附樹(shù)脂柱層析及高速逆流色譜技術(shù)進(jìn)行分離制備高純度的杯莧甾酮。本發(fā)明分離效果好、樣品損失少、無(wú)污染、高效快速，工藝穩(wěn)定，可大制備量分離杯莧甾酮，獲得的杯莧甾酮純度可達(dá)98％以上。
文檔編號(hào)C07J17/00GK102649803SQ20111004528
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者劉東鋒, 李法慶 申請(qǐng)人:蘇州寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司