專利名稱：多塞瑞龍化合物與制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用真菌發(fā)酵液提取的化合物與制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
(2)背景技術(shù)紅樹林是熱帶和亞熱帶海岸潮間帶特有的植物類群，是海岸重要的濕地生態(tài)系統(tǒng)，除分布著大量的海洋動植物和微生物外，還存在豐富的內(nèi)生真菌資源。據(jù)報(bào)道(1、Strol，G.A.Endophytes as sources of bioactive products.Microbes and Infection.20035535-544；2、Schmidt，K.，Gunther，W.，Stoyanova，S.，et al.a neurotrophicpyridone alkaloid from Paecilomyces militaris.Org Lett.2002，24；4(2)197-199；3、Bandaranayake，W.M.Bioactivities，bioactive compounds and chemical constituentsof mangrove plants.Wetland Ecology and Management 2002，10421-452.)世界上50％的真菌都能從紅樹植物中分離到，但目前對紅樹林內(nèi)生真菌進(jìn)行的系統(tǒng)報(bào)道相對很少，而且主要集中在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。紅樹植物特殊的生長環(huán)境，決定了其內(nèi)生真菌有特殊的代謝途徑，能產(chǎn)生特異結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物。在對其次級代謝產(chǎn)物化學(xué)成分進(jìn)行的不多的研究中，人們已發(fā)現(xiàn)了具有很高生理活性和全新結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，例如具有選擇性細(xì)胞毒性的新結(jié)構(gòu)環(huán)肽類化合物等?？傊畬t樹植物內(nèi)生真菌的研究才剛剛起步，它具有較高的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類新的來源于紅樹植物內(nèi)生真菌的具有潛在藥用價(jià)值的化合物及其提取分離方法，以及它們在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內(nèi)生真菌—小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3，簡稱HTF3)的發(fā)酵液中提取分離到四種結(jié)構(gòu)類似的化合物，結(jié)構(gòu)分別為多塞瑞龍A，[3，5-二羥基-2-(7-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物A)、多塞瑞龍B，[3，5-二羥基-2-(6-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物B)、多瑞塞龍C，[3，5-二羥基-2-(8-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(記為化合物C)和多塞瑞龍D，6，8-二羥基-1(R)-(5-羥基-己基)-異苯并二氫吡喃-3-酮(記為化合物D)。
本發(fā)明所用的紅樹植物內(nèi)生真菌HTF3已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號為CCTCC NOM203067，保藏日期為2003年8月29日，其分類命名為小穴殼菌屬(Dothiorella SP.)。
化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的結(jié)構(gòu)式分別為 本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物的制備方法為1)內(nèi)生真菌的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5-2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，室溫下培養(yǎng)5-8天；2)內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)5-8天；3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體；4)將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)為洗脫劑梯度洗脫；5)收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集5-6分鐘和6.5-7.5分鐘時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集18-19分鐘的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集14-15分鐘的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
化合物A的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)EMSm/z(rel.int.)339.1[M+1]+(60.9)，356.3[M+NH4]+(43.6)，361.2[M+Na]+(100)，694.2[2M+NH4]+(4.3)，698.5[2M+Na]+(58)；1H NMR and13C NMR(400MHz，DMSO-d6)見表1和表2；化合物B的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)EMSm/z(rel.int.)339.0[M+H]+(24.1)，356.3[M+NH4]+(21.8)，361.1[M+Na](21.3)，698.4[2M+Na]+(9.8)；1H NMR and13C NMR(400MHz，CDCl3)見表1和表2；化合物C的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Colourless oil；EMSm/z(rel.int.)339.3[M+H](100)；1H NMR and13C NMR(400MHz，CDCl3)見表1和表2；化合物D的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)EMSm/z(rel.int.)281.0[M+H]+(90)；1H NMR and13C NMR(400MHz，DMSO-d6)見表1和表2。
表1化合物A、B、C和D的1H-NMR數(shù)據(jù)
表2化合物A、B、C和D的13C-NMR數(shù)據(jù)
本發(fā)明所說的多塞瑞龍化合物可用于制備抗腫瘤藥物。以下給出抗腫瘤活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1)腫瘤細(xì)胞株人B淋巴瘤Raji細(xì)胞、人口腔皮樣癌KB細(xì)胞等。
2)材料a MTT(噻唑藍(lán))用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到終濃度5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃避光保存；b SDS裂解液100g十二烷基磺酸鈉(SDS)，1N HCl 10ml，加熱溶解，蒸餾水定容至1000ml。
c 細(xì)胞培養(yǎng)基(全培)一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)細(xì)胞培養(yǎng)基溶于1L雙蒸水中；加入2g NaHCO3攪勻溶解后封口，置于4℃過夜，以自然沉淀除去雜質(zhì)；次日加入10-15％已滅活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混勻后用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
3)化合物A、B、C和D的配置分別取一定量的化合物A、B、C和D，用甲醇溶解并調(diào)整濃度為5mg/ml，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)a 細(xì)胞活化取一干凈燒杯，裝入干凈溫水，水溫調(diào)至37-40℃；將凍存管從液氮中取出迅速投入溫水解凍，并將凍存細(xì)胞接入預(yù)裝有細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液、分瓶。
b 細(xì)胞計(jì)數(shù)選對數(shù)生成期細(xì)胞，胰酶消化，移入離心管中，加全培至10ml，取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml。
c 活性檢測①96孔板在超凈工作臺內(nèi)紫外光下照射1小時(shí)；②在各孔中加入細(xì)胞懸液80μl，37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；③加入20μl用全培梯度稀釋成一系列濃度的A、B、C和D溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；④每孔加入MTT溶液10μl，輕輕震搖使顆粒溶解，37℃放置3小時(shí)；⑤取出培養(yǎng)板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解過夜；⑥用酶聯(lián)反應(yīng)儀570nm測定各孔吸光值(參比波長為655nm)，按下列公式計(jì)算抑制率抑制率＝(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照組OD值×100％⑦以抑制率為縱坐標(biāo)，受試樣品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，求出抑制率為50％時(shí)的濃度即為IC50。
d 試驗(yàn)結(jié)果化合物A、B、C和D對人口腔上皮癌KB細(xì)胞的IC50分別是16μg/ml、18μg/ml、20μg/ml和20μg/ml；對人淋巴瘤Raji細(xì)胞的IC50分別是12μg/ml、9μg/ml、10μg/ml和8μg/ml。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一類來源于紅樹林內(nèi)生真菌、實(shí)驗(yàn)中對人口腔上皮癌和淋巴瘤等有抑制作用的新結(jié)構(gòu)化合物，它們可用于制備抗口腔上皮癌和淋巴瘤等的藥物。另外，這些化合物的制備方法簡單，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(4)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1內(nèi)生真菌的種子培養(yǎng)將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1g，瓊脂1.6g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，25℃下培養(yǎng)6天。
內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)6天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體，將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集330s和400s時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集1100s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析(層析柱WAT 025821，流量3ml/min)，收集880s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實(shí)施例2將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1.5g，瓊脂1.8g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，30℃下培養(yǎng)8天；再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，20℃培養(yǎng)8天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/0.1為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集310s和420s時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1140s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集840s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實(shí)施例3將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2g，瓊脂1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，28℃下培養(yǎng)5天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)6天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/2為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集360s和390s時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1080s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集860s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實(shí)施例4將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖2.5g，瓊脂2.0g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，20℃下培養(yǎng)7天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1.5為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集300s和450s時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1120s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集900s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
實(shí)施例5
將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖3g，瓊脂1.7g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，23℃下培養(yǎng)6天。再將馬鈴薯20g去皮、切碎，水煮30min，紗布過濾，濾液中加葡萄糖3g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7天。將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體。過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/4為洗脫劑梯度洗脫。
收集、濃縮得化合物產(chǎn)物1、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集340s和420s時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集1100s的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；3、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集850s的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
權(quán)利要求
1.多塞瑞龍化合物，所說的多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內(nèi)生真菌—小穴殼菌HTF3的發(fā)酵液中提取分離的化合物，所說的小穴殼菌HTF3的保藏號為CCTCC NOM203067，其特征在于其結(jié)構(gòu)分別為化合物A多塞瑞龍A，[3，5-二羥基-2-(7-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物B多塞瑞龍B，[3，5-二羥基-2-(6-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物C多瑞塞龍C，[3，5-二羥基-2-(8-羥基-辛酰)]-苯乙酸乙酯和化合物D多塞瑞龍D，6，8-二羥基-1(R)-(5-羥基-己基)-異苯并二氫吡喃-3-酮；化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的結(jié)構(gòu)式分別為
2.多塞瑞龍化合物的制備方法，其特征在于其步驟為1)內(nèi)生真菌的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基以克為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5-2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面。挑取菌種接入斜面，室溫下培養(yǎng)5-8天；2)內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以克為單位；馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，紗布過濾，濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)5-8天；3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵培養(yǎng)液紗布過濾除去菌體；4)將過濾后的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)為洗脫劑梯度洗脫；5)收集、濃縮得化合物產(chǎn)物(1)、收集石油醚/乙酸乙酯為9/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝95/5為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集5-6分鐘和6.5-7.5分鐘時(shí)的流出液，濃縮后分別得到無色的組分化合物B和化合物A；(2)、石油醚/乙酸乙酯為7/1的組分，濃縮后用氯仿/甲醇＝98/2為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集18-19分鐘的流出液，濃縮后得到無色的油狀物，為組分化合物C；(3)、石油醚/乙酸乙酯為1/1的組分，濃縮后用乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1為洗脫劑，高效液相色譜層析，收集14-15分鐘的流出液，濃縮后得淺黃色的油狀物，為組分化合物D。
3.多塞瑞龍化合物，其特征在于可用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
涉及一種利用真菌發(fā)酵液提取的化合物與制法及在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。多塞瑞龍化合物是從紅樹植物內(nèi)生真菌—小穴殼菌HTF
文檔編號C07C69/738GK1541994SQ20031011404
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月8日
發(fā)明者徐慶妍, 黃耀堅(jiān), 鄭忠輝, 宋思揚(yáng), 蘇文金 申請人:廈門大學(xué)