專利名稱：一種抗SARS－CoV免疫球蛋白抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界衛(wèi)生組織在今年3月12日發(fā)出關(guān)于非典型肺炎(atypicalpneumonia)的全球性警告之后，隨后命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)。在WHO的高度重視、協(xié)調(diào)和組織下，引起SARS的病原體很快被確認(rèn)為一種新的或變異的冠狀病毒，并相應(yīng)命名為SARS-CoV。自SARS爆發(fā)后很快在全球傳播，現(xiàn)已蔓延到世界30多個(gè)國家和地區(qū)，嚴(yán)重地影響人們的健康和生命，成為21世紀(jì)初最危害人類的頭號大敵。馬抗血清(又叫馬抗免疫球蛋白)自古以來是用于重要病原體感染的一種有效的應(yīng)急治療措施，至今至少有7種抗血清在臨床廣泛應(yīng)用，發(fā)揮重要的治療和預(yù)防傳染病的作用。馬抗血清發(fā)展經(jīng)歷了傳統(tǒng)的整個(gè)抗體分子，發(fā)展到今天有效去掉能引起毒副作用的Fc段抗體分子和其它血漿雜蛋白分子，獲得具有與病原體抗原特異結(jié)合的高純度F(ab′)2治療抗體，達(dá)到消滅病原體的效果?；谙愀?、新加坡和我國大陸報(bào)道針對SARS恢復(fù)期病人的血清具有治療SARS的作用，但SARS恢復(fù)期病人血清的廣泛應(yīng)用存在一定的問題，并且人們對SARS-CoV的認(rèn)識(shí)還很浮淺，特別是在安全性等方面存在一定的問題，制約其應(yīng)用和發(fā)展。
因此，研制有治療與預(yù)防SARS的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白，是非常有價(jià)值的治療性和預(yù)防性抗體藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開一種新型的用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開制備馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的方法。
一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體，是馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體。
本發(fā)明馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的制備包括以下步驟1)滅活純化SARS-CoV加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢疫符合生物制品要求的馬匹，免疫四次、間隔10天免疫一次，試血測抗體效價(jià)對流電泳1∶128、間接酶聯(lián)免疫1∶12800，測抗體中和效價(jià)細(xì)胞病變法1∶12800、空斑減數(shù)法1∶12800，并不同SARS-CoV標(biāo)準(zhǔn)株免疫馬產(chǎn)生的中和抗體均與其它SARS-CoV毒株呈現(xiàn)一致的中和抗體活性；2)采集馬抗SARS-CoV血漿，用無熱源2倍蒸餾水稀釋加入21％飽和度硫酸銨混勻、離心棄沉淀纖維蛋白和白蛋白，上清再加入9％飽和度硫酸銨混勻離心要沉淀免疫球蛋白G(IgG)，用無熱源蒸餾水恢復(fù)原體積再用30％飽和度硫酸銨混勻、離心要沉淀IgG，先加入一定量的無熱源蒸餾水、后加入無熱源0.9％氯化鈉鹽水用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮和去雜蛋白，超濾液為純化馬抗SARS-CoV IgG；3)純化的馬抗SARS-CoV IgG用鹽酸調(diào)PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氫氧化鈉調(diào)PH至7.4，加熱58℃、30min，用帆布過濾去Fc段，濾液為初步純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體；4)初步純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體過苯基蔬水層析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)，用200mmol/L pH7.0磷酸緩沖液、1mol/L硫酸銨上柱，20mmol/L pH7.0磷酸緩沖液收集F(ab′)2抗體流出液，再用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮，為純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體。
本發(fā)明制備的純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體可制備成馬抗SARS-CoV免疫球蛋白注射劑型和黏膜噴霧劑型成品。
本發(fā)明所用純化的滅活SARS-CoV可以通過如下步驟制得1)綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)的復(fù)蘇、培養(yǎng)，取細(xì)胞種子庫凍存Vero細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng)基并加入10％小牛血清培養(yǎng)，提供培養(yǎng)SARS-CoV的Vero細(xì)胞；2)SARS冠狀病毒(SARS-CoV)滴定，對培養(yǎng)的Vero細(xì)胞加入經(jīng)鑒定凍存的SARS-CoV，擴(kuò)增培養(yǎng)SARS-CoV，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)測定SARS-CoV的毒力(106-108)，對滴定的SARS-CoV分裝凍存；3)用長滿單層的Vero細(xì)胞加入滴定的SARS-CoV，用無血清DMEM培養(yǎng)SARS-CoV，生產(chǎn)SARS-CoV；4)Vero細(xì)胞完全病變后收集SARS-CoV培養(yǎng)液，反復(fù)凍融三次(冰凍-37℃)或不凍融，收集SARS-CoV細(xì)胞培養(yǎng)液；5)向SARS-CoV培養(yǎng)液加入1/2000-1/8000的β-丙內(nèi)酯，4℃過夜、37℃2h滅活SARS-CoV，取滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液在Vero細(xì)胞上連傳三代，檢測SARS-CoV滅活效果；6)滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液，4℃、離心12000rpm/min 30min，棄沉淀雜蛋白，上清為SARS-CoV液；7)用分子量30萬超濾柱超濾SARS-CoV液，濃縮和去雜蛋白，濾液為粗制滅活SARS-CoV；8)對粗制滅活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子篩柱，開始緩沖液是0.1MPBS PH7.0緩沖液，用100mM PBS PH7.0洗脫，收集SARS-CoV，合并濃縮收集初步純化SARS-CoV；9)對初步純化的SARS-CoV液上DE52陰離子柱層析，用100mM PB，PH7.2液平衡并將病毒吸附在柱上、用100mM PB，PH7.2，0.35M NaCl洗脫，收集SARS-CoV峰，合并濃縮收集純化SARS-CoV；10)對超濾濃縮后SARS-CoV液的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為55％、用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為92％；11)對凝膠過濾純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為85％、采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為94.5％、用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定病毒殘余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)對離子交換純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得蛋白抗原由純化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC顯示病毒純度為97％；采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為98.5％；用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE顯示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白條帶，并與恢復(fù)期SARS病人的血清發(fā)生反應(yīng)，純化滅活SARS-CoV分裝放-70℃保存。
本發(fā)明利用分離的SARS-CoV經(jīng)培養(yǎng)、滅活、純化后免疫健康馬匹，產(chǎn)生高效價(jià)中和SARS-CoV的抗血清，去除能引起副作用的Fc片段，制備馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體，能特異消滅SARS-CoV，對非典型肺炎的治療和預(yù)防有很好的效果；純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體對SARS-CoV具有很好的特異性及靈敏性。
以下實(shí)驗(yàn)例進(jìn)步說明本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的鑒定1)精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體和純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體，采用對流電泳抗體效價(jià)達(dá)到1∶128以上、間接酶聯(lián)免疫抗體效價(jià)高達(dá)1∶12800以上；2)精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的中和效價(jià)的滴定，是首先在Vero細(xì)胞上對SARS-CoV滴定確定滴度為106-8，選擇200TCID50按抗體稀釋方法檢測馬抗SARS-CoV血漿、精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的中和效價(jià)?；蛴梦g斑減數(shù)中和實(shí)驗(yàn)方法檢測馬抗SARS-CoV血漿、精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體的中和效價(jià)在1∶10000以上；實(shí)驗(yàn)例2精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白治療和預(yù)防效果的評價(jià)1)建立SARS-CoV感染Vero-6細(xì)胞模型，在16孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入4×105/孔Vero-6，培養(yǎng)24h加入100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul，24h后加入0.1mg/100mL馬抗SARS-CoV免疫球蛋白治療SARS-CoV感染的細(xì)胞，觀察48h經(jīng)細(xì)胞病變法、MTT法和空斑減數(shù)法檢測馬抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好治療SARS-CoV的效果；2)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白0.1mg/100mL加入4×105/孔Vero-6細(xì)胞/16孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12h用100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul感染Vero-6細(xì)胞，觀察72h經(jīng)細(xì)胞病變法、MTT法和空斑減數(shù)法檢測精制馬抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好預(yù)防SARS-CoV的效果；3)通過對每只恒河猴1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV建立了感染模型，感染后6h、12h、24h、48h分別肌肉注射2mg/2mL(100IU)，觀察15天解剖，從癥狀表現(xiàn)治療組減輕到無、白細(xì)胞及免疫細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常。從病原學(xué)觀察到治療組肺、肝、腎、腦、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、拭胭子、血液、糞便等部位分離病原體，及PCR檢測S、N、M、E和X4主要病原體蛋白基因，經(jīng)病毒培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增病原體均為陰性。從病理改變觀察到治療組肺、肝組織病理改變有不同程度的好轉(zhuǎn)，并產(chǎn)生有效的抗SARS-CoV抗體。說明馬抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的動(dòng)物有明顯治療SARS的效果；4)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白黏膜噴霧劑3mg/3mL(150IU)給藥，每12h一次，共用4次給恒河猴預(yù)防，再用1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV感染攻擊恒河猴，觀察30天預(yù)防組恒河猴沒有出現(xiàn)癥狀、不發(fā)燒、血細(xì)胞正常，發(fā)病。從病原學(xué)觀察到預(yù)防組肺、肝、腎、腦、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、拭胭子、血液、糞便等部位分離病原體，及PCR檢測S、N、M、E和X4主要病原體蛋白基因，經(jīng)病毒培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增病原體均為陰性。從病理改變觀察到治療組肺、肝組織病理改變有不同程度的好轉(zhuǎn)，并產(chǎn)生具有中和活性的抗SARS-CoV抗體。說明馬抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的動(dòng)物有明顯預(yù)防SARS的效果。
下述實(shí)施例均能達(dá)到上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
實(shí)施例1馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體制備1、SARS-CoV的培養(yǎng)、滅活及純化1)綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)的復(fù)蘇、培養(yǎng)，取細(xì)胞種子庫凍存Vero細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng)基并加入10％小牛血清培養(yǎng)，提供培養(yǎng)SARS-CoV的Vero細(xì)胞；2)SARS冠狀病毒(SARS-CoV)滴定，對培養(yǎng)的Vero細(xì)胞加入經(jīng)鑒定凍存的SARS-CoV，擴(kuò)增培養(yǎng)SARS-CoV，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)測定SARS-CoV的毒力(106-108)，對滴定的SARS-CoV分裝凍存；3)用長滿單層的Vero細(xì)胞加入滴定的SARS-CoV，用無血清DMEM培養(yǎng)SARS-CoV，生產(chǎn)SARS-CoV；4)Vero細(xì)胞完全病變后收集SARS-CoV培養(yǎng)液，反復(fù)凍融三次(冰凍-37℃)或不凍融，收集SARS-CoV細(xì)胞培養(yǎng)液；5)向SARS-CoV培養(yǎng)液加入1/4000的β-丙內(nèi)酯(1/2000-1/8000均可)，4℃過夜、37℃2h滅活SARS-CoV，取滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液在Vero細(xì)胞上連傳三代，檢測SARS-CoV滅活效果；6)滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液，4℃、離心12000rpm/min 30min，棄沉淀雜蛋白，上清為SARS-CoV液；7)用分子量30萬超濾柱超濾SARS-CoV液，濃縮和去雜蛋白，濾液為粗制滅活SARS-CoV；8)對粗制滅活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子篩純化，對粗制滅活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱層析，0.01Mtris-HCl PH7.4緩沖液洗脫，收集SARS-CoV，合并濃縮收集初步純化SARS-CoV；9)對初步純化的SARS-CoV液上DE52陰離子柱層析純化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0緩沖液洗脫，收集SARS-CoV峰，合并濃縮收集純化SARS-CoV；10)對超濾濃縮后SARS-CoV液的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為55％、用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為92％；11)對凝膠過濾純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為85％、采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為94.5％、用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定病毒殘余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)對離子交換純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得蛋白抗原由純化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC顯示病毒純度為97％；采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為98.5％；用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE顯示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白條帶，并與恢復(fù)期SARS病人的血清發(fā)生反應(yīng)，純化滅活SARS-CoV分裝放-70℃保存。
2、馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體制備1)選用的SARS-CoV是我們所分離并經(jīng)國家生物制品檢定所鑒定的標(biāo)準(zhǔn)毒株，所用Vero細(xì)胞是來自細(xì)胞生產(chǎn)工廠，進(jìn)行SARS-CoV培養(yǎng)、滅活和純化，制備滅活純化SARS-CoV抗原；2)滅活純化SARS-CoV加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢疫符合生物制品要求的馬匹，免疫四次、間隔10天免疫一次，試血測抗體效價(jià)對流電泳1∶128、間接酶聯(lián)免疫1∶12800，測抗體中和效價(jià)細(xì)胞病變法1∶12800、空斑減數(shù)法1∶12800，并不同SARS-CoV標(biāo)準(zhǔn)株免疫馬產(chǎn)生的中和抗體均與其它SARS-CoV毒株呈現(xiàn)一致的中和抗體活性；3)采集馬抗SARS-CoV血漿，用無熱源2倍蒸餾水稀釋加入21％飽和度硫酸銨混勻、離心棄沉淀纖維蛋白和白蛋白，上清再加入9％飽和度硫酸銨混勻離心要沉淀免疫球蛋白G(IgG)，用無熱源蒸餾水恢復(fù)原體積再用30％飽和度硫酸銨混勻、離心要沉淀IgG，先加入一定量的無熱源蒸餾水、后加入無熱源0.9％氯化鈉鹽水用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮和去雜蛋白，超濾液為純化馬抗SARS-CoV IgG；4)純化的馬抗SARS-CoV IgG用鹽酸調(diào)PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氫氧化鈉調(diào)PH至7.4，加熱58℃、30min，用帆布過濾去Fc段，濾液為初步純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體；5)初步純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體過苯基蔬水層析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)，用200mmol/L pH7.0磷酸緩沖液、1mol/L硫酸銨上柱，20mmol/L pH7.0磷酸緩沖液收集F(ab′)2抗體流出液，再用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮，為純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體；6)純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體加入適量硫柳汞防腐劑，用生理鹽水稀釋所需含量0.22um除菌分裝，分別制備馬抗SARS-CoV免疫球蛋白注射劑型和黏膜噴霧劑型成品；7)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品用2％蛋白濃度做瓊脂糖電泳檢測，沒有白蛋白成分、通過10％SDS-PAGE檢測F(ab′)2純度在90％以上，抗體中和效價(jià)細(xì)胞病變法、空斑減數(shù)法1∶2000/mg蛋白，按現(xiàn)有國家對人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg為1個(gè)治療單位(1IU)，則馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品50IU/mg；8)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品的理化性質(zhì)檢測，蛋白含量3.0g/L、PH值6.8、氯化鈉含量8.5g/L、硫酸銨含量0.5g/L、硫柳汞0.06g/L、凍干制劑水分含量2.0％，均符合生物制品的規(guī)定；9)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品在兔和小鼠體內(nèi)進(jìn)行熱源、異常毒性觀察，實(shí)驗(yàn)證實(shí)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白無熱源、異常毒性；10)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品放4℃、37℃觀察穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白放置6個(gè)月以上中和效價(jià)不減，有很好的穩(wěn)定性；11)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白成品，通過免疫組化證實(shí)與正常人心、肝、肺、腎、腦、脾、淋巴結(jié)、腸組織器官?zèng)]有交叉反應(yīng)，證實(shí)馬抗SARS-CoV免疫球蛋白沒有抗人的組織成分，用于人的防治是安全的。
權(quán)利要求
1.一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體，其特征在于該抗體是的制備方法包括如下步驟1)滅活純化SARS-CoV加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢疫符合生物制品要求的馬匹，免疫四次、間隔10天免疫一次，試血測抗體效價(jià)對流電泳1∶128、間接酶聯(lián)免疫1∶12800，測抗體中和效價(jià)細(xì)胞病變法1∶12800、空斑減數(shù)法1∶12800，并不同SARS-CoV標(biāo)準(zhǔn)株免疫馬產(chǎn)生的中和抗體均與其它SARS-CoV毒株呈現(xiàn)一致的中和抗體活性；2)采集馬抗SARS-CoV血漿，用無熱源2倍蒸餾水稀釋加入21％飽和度硫酸銨混勻、離心棄沉淀纖維蛋白和白蛋白，上清再加入9％飽和度硫酸銨混勻離心要沉淀免疫球蛋白G，用無熱源蒸餾水恢復(fù)原體積再用30％飽和度硫酸銨混勻、離心要沉淀IgG，先加入一定量的無熱源蒸餾水、后加入無熱源0.9％氯化鈉鹽水用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮和去雜蛋白，超濾液為純化馬抗SARS-CoV IgG；3)純化的馬抗SARS-CoV IgG用鹽酸調(diào)PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氫氧化鈉調(diào)PH至7.4，加熱58℃、30min，用帆布過濾去Fc段，濾液為初步純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體；4)初步純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體過苯基蔬水層析，用200mmol/L pH7.0磷酸緩沖液、1mol/L硫酸銨上柱，20mmol/L pH7.0磷酸緩沖液收集F(ab′)2抗體流出液，再用6萬超濾器超濾除鹽、濃縮，為純化馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白抗體，其特征在于制備該抗體所用的純化的滅活SARS-CoV是由如下方法制得的1)綠猴腎細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)，取細(xì)胞種子庫凍存Vero細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng)基并加入10％小牛血清培養(yǎng)，提供培養(yǎng)SARS-CoV的Vero細(xì)胞；2)SARS冠狀病毒滴定，對培養(yǎng)的Vero細(xì)胞加入經(jīng)鑒定凍存的SARS-CoV，擴(kuò)增培養(yǎng)SARS-CoV，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染量測定SARS-CoV的毒力106-108，對滴定的SARS-CoV分裝凍存；3)用長滿單層的Vero細(xì)胞加入滴定的SARS-CoV，用無血清DMEM培養(yǎng)SARS-CoV，生產(chǎn)SARS-CoV；4)Vero細(xì)胞完全病變后收集SARS-CoV培養(yǎng)液，反復(fù)凍融三次，冰凍-37℃或不凍融，收集SARS-CoV細(xì)胞培養(yǎng)液；5)向SARS-CoV培養(yǎng)液加入1/2000-1/8000的β-丙內(nèi)酯，4℃過夜、37℃2h滅活SARS-CoV，取滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液在Vero細(xì)胞上連傳三代，檢測SARS-CoV滅活效果；6)滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液，4℃、離心12000rpm/min 30min，棄沉淀雜蛋白，上清為SARS-CoV液；7)用分子量30萬超濾柱超濾SARS-CoV液，濃縮和去雜蛋白，濾液為粗制滅活SARS-CoV；8)對粗制滅活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子篩純化，對粗制滅活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱層析，0.01Mtris-HCl PH7.4緩沖液洗脫，收集SARS-CoV，合并濃縮收集初步純化SARS-CoV；9)對初步純化的SARS-CoV液上DE52陰離子柱層析純化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0緩沖液洗脫，收集SARS-CoV峰，合并濃縮收集純化SARS-CoV；10)對超濾濃縮后SARS-CoV液的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為55％、用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為92％；11)對凝膠過濾純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為85％、采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為94.5％、用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定病毒殘余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)對離子交換純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得蛋白抗原由純化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC顯示病毒純度為97％；采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為98.5％；用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE顯示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白條帶，并與恢復(fù)期SARS病人的血清發(fā)生反應(yīng)，純化滅活SARS-CoV分裝放-70℃保存。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白抗體，其特征在于純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體可制備成馬抗SARS-CoV免疫球蛋白注射劑型和黏膜噴霧劑型成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS－CoV的抗SARS－CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體，特征在于該抗體為馬抗SARS－CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體，同時(shí)本發(fā)明公開該抗體的制備方法。本發(fā)明抗體能特異消滅SARS－CoV，對非典型肺炎的治療和預(yù)防有很好的效果。
文檔編號C07K16/08GK1621415SQ200310113790
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者王希良, 杜新安, 石辛甫, 張松樂, 劉建源, 李巖, 趙光宇, 田光, 周華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所