含吡螨胺結構的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物醫(yī)藥領域，具體設及含化蛾胺結構的化合物的一種新用途，更具 體設及含化蛾胺結構的化合物在制備抗埃博拉病毒感染藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 埃博拉病毒化bola Virus,EBOV)是傳染病埃博拉出血熱的病原體，該出血熱于 1976年首次在扎伊爾發(fā)現(xiàn)，其高傳染性的爆發(fā)流行和高致死性很快引起了世界各國研究人 員的注意。埃博拉病毒具有極強的感染性，可引起人類和其他靈長類動物高致死性的出血 熱綜合征。研究表明，埃博拉病毒的所有組分對疾病的發(fā)展都有一定的促進作用，尤其是埃 博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein,GP)可與祀細胞發(fā)生吸附，進而進入祀細胞，在介導 病毒進入祀細胞過程中發(fā)揮重要作用。埃博拉病毒的囊膜糖蛋白被認為是決定埃博拉病毒 致病性一個重要因素，體外通過轉染編碼囊膜糖蛋白基因的質粒或腺病毒進入祀細胞，能 夠導致祀細胞的脫落，表明埃博拉病毒的囊膜糖蛋白具有細胞毒性，但是其機理不詳。因 此，抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白活性是抑制埃博拉病毒感染祀細胞的重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題如何制備抗埃博拉病毒感染藥物。
[0004] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了含化蛾胺結構的化合物在制備抗埃博拉病毒 感染藥物中的應用。
[0005] 所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/或預防型抗埃 博拉病毒感染藥物。
[0006] 含化蛾胺結構的化合物在制備抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產(chǎn)品中的應 用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007] 所述哺乳動物細胞具體可為人細胞。所述哺乳動物細胞具體可為哺乳動物肝癌細 胞。所述哺乳動物細胞具體可為人肝癌細胞。所述人肝癌細胞具體可為HUH7細胞。
[000引含化蛾胺結構的化合物在制備抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的產(chǎn)品中的應用 也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0009] 上述應用中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[0010] al)氨基酸序列是序列表序列2所不的蛋白質；
[0011] a2)將al)所示的蛋白質經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關的蛋白質。
[0012] 上述任一所述的應用中，所述含化蛾胺結構的化合物可為式（I)所示化合物或式 (H)所示化合物；
[0014] 為解決上述問題，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品。
[0015] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)品，其活性成分為含化蛾胺結構的化合物;所述產(chǎn)品可為如下 bl)或 b2)或 b3):
[0016] bl)抗埃博拉病毒感染藥物；
[0017] b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳動物細胞的產(chǎn)品；
[001引b3)抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的產(chǎn)品。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述抗埃博拉病毒感染藥物可為治療型抗埃博拉病毒感染藥物和/ 或預防型抗埃博拉病毒感染藥物。
[0020] 上述產(chǎn)品中，所述哺乳動物細胞具體可為人細胞。上述產(chǎn)品中，所述哺乳動物細胞 具體可為哺乳動物肝癌細胞。上述產(chǎn)品中，所述哺乳動物細胞具體可為人肝癌細胞。所述人 肝癌細胞具體可為HUH7細胞。
[0021] 上述產(chǎn)品中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可為al)或a2):
[0022] al)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白質；
[0023] a2)將al)所示的蛋白質經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 得到的與埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相關的蛋白質。
[0024] 上述任一所述產(chǎn)品中，所述含化蛾胺結構的化合物可為式（I)所示化合物或式 (H)所示化合物；
[00%] 上述任一所述埃博拉病毒可為扎伊爾亞型，具體為H. sapiens wt/GIN/2014/ Gueckedou-COTO
[0027]由于高致病性和傳染性，本發(fā)明中所述埃博拉病毒可用埃博拉假病毒代替，所述 埃博拉假病毒的制備方法可如下：
[002引 1、向質粒pcDNA?4/HisMax的限制性內(nèi)切酶BamH巧肋hoi的識別序列之間插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質粒PCDNA4-EB0V-GP。
[00巧]2、將重組質粒PCDNA4-EB0V-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒共轉染皿K 293T細 胞，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育化，用PBS緩沖液沖洗2次，然后加入DMEM培養(yǎng)基，置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱繼續(xù)解育48h，收集細胞上清。
[0030] 3、取步驟2收集的細胞上清，300化pm離屯、lOmin，收集上清液并用0.22皿微孔濾膜 過濾，收集過濾后的液體。
[0031] 4、取步驟3過濾后的液體，30000巧m離屯、2 .化，獲得的沉淀用ImL DMEM培養(yǎng)基溶 解，得到所述埃博拉假病毒的病毒液。
[0032] 序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白為埃博拉病毒的扎伊爾亞型的 H. sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07的囊膜糖蛋白。因此，含[I比蛾胺結構的化合物具有 抑制具有序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的假病毒的侵染能力，應該也具 有抑制扎伊爾亞型的埃博拉病毒的侵染能力。扎伊爾亞型的埃博拉病毒具體可為 H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07。
[0033] 實驗證明，本發(fā)明提供的含化蛾胺結構的化合物在埃博拉假病毒感染前或感染后 對埃博拉假病毒的感染均具有抑制作用。因此，本發(fā)明提供的含化蛾胺結構的化合物可抑 制埃博拉病毒感染祀細胞，在制備抗埃博拉病毒感染藥物中具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為埃博拉假病毒感染前給予化合物I對埃博拉假病毒感染冊H7細胞的抑制作 用。
[0035] 圖2為埃博拉假病毒感染前給予化合物n對埃博拉假病毒感染HUH7細胞的抑制作 用。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 冊H7細胞（人肝癌細胞）購自日本細胞庫（Japanese Collection Of Research Bioresources，JCRB)，編號為JCRB0403。胎牛血清為Sera Pro公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基為 G;Lbco公司產(chǎn)品。二甲基亞諷為Amresco公司產(chǎn)品。Luciferase Cell Culture Lysis 5X Reagent為Promega公司產(chǎn)品，貨號為E1531。皿K 293T細胞為中國普通微生物保藏管理中屯、 (簡稱CGMCC)產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為8.00020。質粒pcDNA?4/HisMax為Life technologies公司 產(chǎn)品，貨號為V8642(LPBS緩沖液為BioTopped公司產(chǎn)品，貨號為top0027eLuciferase Assay System IO-Pack為Promega公司產(chǎn)品，貨號為E1501。
[0040] ZMapp 2G4單克隆抗體的制備方法參考如下文獻：Q Xiangguo，W Gary, et al.Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp.NaUire.2014,514(10):47-61.
[0041 ] p化4.3-Luc-R-E-載體質粒購自BioVecto;r中國質粒載體菌株細胞基因保藏中屯、-NTCC國家典型培養(yǎng)物保藏中屯、（網(wǎng)址為hUp: //www.biovector.net/)，貨號為3767994。
[0042] 實施例1、埃博拉假病毒稀釋液的制備方法
[0043] 由于埃博拉病毒的高致病性和傳染性，埃博拉假病毒能夠代替活病毒的部分研 究。本發(fā)明中使用的埃博拉假病毒的制備方法如下：
[0044] 1、向質粒pcDNA?4/HisMax的限制性內(nèi)切酶BamHI和化Ol的識別序列之間插入核巧 酸序列是序列表中的序列1所示的雙鏈DNA分子，得到重組質粒PCDNA4-邸0V-GP。重組質粒 PCDNA4-EB0V-GP表達序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白（Glycoprotein,GP)， W下簡稱GP蛋白。
[0045] 2、將步驟1構建的重組質粒PCDNA4-邸OV-GP和pNL4.3-Luc-R-E-載體質粒共轉染 皿K 293T細胞（每1 X IO6個皿K 293T細胞約轉染IOiig重組質粒PCDNA4-EB0V-GP和IOiig P化4.3-Luc-R-E-載體質粒），置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱解育化，用PBS緩沖液沖洗2次，然后 加入DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱繼續(xù)解育48h，收集細胞上清。
[0046] 3、取步驟2收集的細胞上清，300化pm離屯、lOmin，收集上清液并用0.22皿微孔濾膜 過濾，收集過濾后的液體。
[0047] 4、取步驟3過濾后的液體，30000巧m離屯、2 .化，獲得的沉淀用ImL DMEM培養(yǎng)基溶 解，得到埃博拉假病毒的病毒液。該埃博拉假病毒的病毒液可表達GP蛋白。
[0048] 取埃博拉假病毒的病毒液，用DMM培養(yǎng)基稀釋至35倍體積，得到埃博拉假病毒稀 釋液。
[0049] 實施例2、制備化合物I和化合物n
[0051] 按照文獻（Song H，Liu Y et al . Desi即，synthes is，and insecticidal activity of novel pyrazole derivatives containinga-hydroxymethyl-N-benzy