專利名稱：家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)、蛋白質(zhì)的純化與活性分析，尤其涉及一種家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
家蠶桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)是目前高效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，但目前的技術(shù)在重組病毒構(gòu)建和純化過程中存在著重組率低、空斑分析技術(shù)繁瑣、花費時間長的缺點。為了較好地解決這個問題，我們借鑒國外AcNPV快速基因表達(dá)系統(tǒng)工作原理，利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的基因定位轉(zhuǎn)移作用，在大腸桿菌內(nèi)實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移重組，快速獲得重組病毒，構(gòu)建了可利用我國特色資源昆蟲-家蠶的快速基因表達(dá)系統(tǒng)(專利已授權(quán)，名稱利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法授權(quán)公告日2005-10-11，專利號2003101087818)。該系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細(xì)菌DH10BmBac構(gòu)成，其產(chǎn)生重組病毒的原理是首先將外源目的基因克隆入供體質(zhì)粒，然后將供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH10BmBac感受態(tài)細(xì)胞中，通過細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的定點轉(zhuǎn)位作用，將啟動子和目的基因一并轉(zhuǎn)入家蠶桿狀病毒基因組而產(chǎn)生重組病毒DNA，最后轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞而獲得含有目的基因重組病毒。供體質(zhì)粒是決定目的基因是如何進(jìn)行表達(dá)的重要工具，目前美國Invitrogen公司已有產(chǎn)品出售，名稱為pFastBacHTa，b，c(產(chǎn)品目錄號10584-027)，但該質(zhì)粒不含有蛋白質(zhì)信號肽分泌信號，致使表達(dá)的重組表達(dá)無法分泌出細(xì)胞外。而桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcGP67-B(BD Biosciences公司目錄號21223P)含有一個能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的強的信號肽序列，名稱為GP67 Signal Sequence。利用基因重組原理，通過基因操作技術(shù)，將該信號肽序列重組入pFastBacHTa，b，c供體質(zhì)粒。這樣獲得的分泌型供體質(zhì)粒，能夠用于家蠶快速桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶快速桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法。該質(zhì)粒的構(gòu)建是基于目前已有的供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67-B，采用基因重組原理構(gòu)建而成，具有強的蛋白質(zhì)分泌能力為特征。該分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建為能獲得分泌的重組蛋白質(zhì)創(chuàng)造了條件。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟如下
桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcGP67-B在多角體啟動子Ph下游帶有強分泌信號肽gp67序列，該序列賦予重組蛋白具有很強的分泌胞外的能力，將pAcGP67-B質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，隨后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRV和HindIII雙酶切處理，分離獲得帶有多角體啟動子Ph啟動子、gp67信號肽序列和多克隆位點的基因片段，大小為377bp；并對現(xiàn)有供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c進(jìn)行SnaBI和HindIII酶切處理，切除原有的多角體啟動子Ph啟動子及其多克隆位點，由于EcoRV和SnaBI均為平末端，因此可以將上述377bp的片段與上述片段相連，產(chǎn)生一個新的供體質(zhì)粒。
本發(fā)明具有的有益的效果是該質(zhì)粒的構(gòu)建是基于目前已有的供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67-B，采用基因重組原理構(gòu)建而成，具有強的蛋白質(zhì)分泌能力為特征。該分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建為能獲得分泌的重組蛋白質(zhì)創(chuàng)造了條件。


圖1是桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP-B圖；圖2是供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c圖；圖3是分泌型供體質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；a.桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67-B酶切位點示意圖；b.供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c(invitrogen)，圖中MCS(Multiple Cloning Sites)表示多克隆位點。
具體實施例方式
為了使重組蛋白能有效地分泌出胞外，構(gòu)建了具有強分泌能力特性的供體質(zhì)粒。桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcGP67-B(BD Biosciences公司目錄號21223P，圖1)在多角體啟動子Ph下游帶有強分泌信號肽gp67序列，該序列賦予重組蛋白具有很強的分泌胞外的能力，將pAcGP67-B質(zhì)粒分泌轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，隨后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRV和HindIII雙酶切處理，分離獲得帶有Ph啟動子、gp67信號肽序列和多克隆位點的基因片段，大小為377bp；并對現(xiàn)有供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c(美國Invitrogen公司產(chǎn)品，目錄號10584-027，圖2)進(jìn)行SnaBI和HindIII酶切處理，切除原有的Ph啟動子及其多克隆位點，由于EcoRV和SnaBI均為平末端，因此可以將上述377bp的片段與上述片段相連，產(chǎn)生一個新的供體質(zhì)粒，將其命名為pBmBacGP67a，b，c。操作過程詳見圖3。
1、研究材料家蠶快速桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由本研究室構(gòu)建(專利已授權(quán)，名稱利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建家蠶病毒快速基因表達(dá)系統(tǒng)的方法授權(quán)公告日2005-10-11，專利號2003101087818)由本申請人自行構(gòu)建。DH5α、DH10β菌株、供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c均購自美國Invitrogen。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67-B購自BD公司。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子生物學(xué)操作試劑購自日本Takara公司。
2、工作流程將pAcGP67-B質(zhì)粒分泌轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，隨后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRV和HindIII雙酶切處理，分離獲得帶有Ph啟動子、gp67信號肽序列和多克隆位點的基因片段，大小為377bp；并對現(xiàn)有供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c(美國Invitrogen公司產(chǎn)品，目錄號10584-027，圖2)進(jìn)行SnaBI和HindIII酶切處理，切除原有的Ph啟動子及其多克隆位點，由于EcoRV和SnaBI均為平末端，因此可以將上述377bp的片段與上述片段相連，產(chǎn)生一個新的供體質(zhì)粒，將其命名為pBmBacGP67a，b，c。操作過程詳見圖3。
權(quán)利要求
1.家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcGP67-B在多角體啟動子Ph下游帶有強分泌信號肽gp67序列，該序列賦予重組蛋白具有很強的分泌胞外的能力，將pAcGP67-B質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化人大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，隨后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRV和HindIII雙酶切處理，分離獲得帶有多角體啟動子Ph啟動子、gp67信號肽序列和多克隆位點的基因片段，大小為377bp；并對現(xiàn)有供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c進(jìn)行SnaBI和HindIII酶切處理，切除原有的多角體啟動子Ph啟動子及其多克隆位點，由于EcoRV和SnaBI均為平末端，因此可以將上述377bp的片段與上述片段相連，產(chǎn)生一個新的供體質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建方法。該質(zhì)粒的構(gòu)建是基于目前已有的供體質(zhì)粒pFastBacHTa，b，c和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67－B，采用基因重組原理構(gòu)建而成，具有強的蛋白質(zhì)分泌能力為特征。該分泌型供體質(zhì)粒的構(gòu)建為能獲得分泌的重組蛋白質(zhì)創(chuàng)造了條件。
文檔編號C12N15/866GK1818072SQ20061004939
公開日2006年8月16日 申請日期2006年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月26日
發(fā)明者吳小鋒, 姚慧鵬, 王冰 申請人:浙江大學(xué)