專利名稱：：用于評(píng)估hiv病毒適應(yīng)度的方法、質(zhì)粒載體和引物的制作方法用于評(píng)估HIV病毒適應(yīng)度的方法、質(zhì)粒栽體和引物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在給定環(huán)境中評(píng)價(jià)HIV病毒復(fù)制能力的方法和裝置。特別地，本發(fā)明提供了生長(zhǎng)竟?fàn)幏治觯淇梢岳媒?jīng)重組標(biāo)簽化的HIV-1病毒系統(tǒng)來(lái)測(cè)定相對(duì)病毒適應(yīng)度(fitness)。所述方法依靠質(zhì)粒栽體、擴(kuò)增子、引物和探針以及能復(fù)制的病毒的由此生成。所迷方法和材料可以用于多個(gè)領(lǐng)域，包括診斷、藥物篩選、藥物遺傳學(xué)和藥物開發(fā)。
背景技術(shù)：
：抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的最終目標(biāo)是盡可能多和盡可能久地抑制HIV-1復(fù)制。維持低至不可檢測(cè)的HIV-1RNA水平將防止向獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的發(fā)展，并能使得抗逆轉(zhuǎn)錄病毒抗性的出現(xiàn)最小化(Hirschetal.,1998)。然而，即使高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療學(xué)(HAART)也不能在所有組織區(qū)室中完全地抑制HIV-1復(fù)制。所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的有效性都受到藥物抗性變體的出現(xiàn)的限制，經(jīng)常顯示出在每類藥物種類內(nèi)部的廣泛的交叉抗性(Miller，2001;Deeks，2001;Loveday，2001)。在沒有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(ART)時(shí)，這些藥物抗性毒抹與準(zhǔn)種(quasispecies)內(nèi)的野生型(WT)克隆相比具有降低的適應(yīng)度(Coffin,1995)。適應(yīng)性是描述有機(jī)體對(duì)其環(huán)境的復(fù)制適應(yīng)性(adaptability)的復(fù)雜參數(shù)(在DomingoandHolland,1997;Domingoetal.1999中綜述)。通常，適應(yīng)度的初始的降低與賦予直接藥物抗性的初級(jí)替代物的出現(xiàn)一致。持續(xù)的藥物壓力容許病毒選擇次級(jí)突變，其補(bǔ)償了初級(jí)突變，并恢復(fù)了藥物目標(biāo)酶[蛋白酶(PR)或逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)]的酶活性。這種持續(xù)的進(jìn)化將使得適應(yīng)度恢復(fù)到有時(shí)比WT病毒更低、類似或甚至更高的水平(Hirschetal.,1998;Nijhuisetal.，2001;Berkhout，1999a;Claveletal.,2000;Doyonetal.，1996;Quifiones-MateuandArts,2001)。因而，"群集(swarm)"或準(zhǔn)種中的每個(gè)克隆受到各種選擇壓力，并且具有反映出在特定環(huán)境下的性質(zhì)如活性和穩(wěn)定性的組合的適應(yīng)度。在準(zhǔn)種周轉(zhuǎn)(turnover)或復(fù)制期間，不同的基因組快速地產(chǎn)生，并經(jīng)歷連續(xù)的竟?fàn)幒瓦x擇過(guò)程(Domingoetal.，1999)。更高適應(yīng)度的新近出現(xiàn)的變體通常竟?fàn)幊^(guò)更低適應(yīng)度的克隆，因而，準(zhǔn)種可以快速地適應(yīng)改變中的環(huán)境。相當(dāng)大的注意已經(jīng)集中于藥物抗性和病毒適應(yīng)度之間的關(guān)系上。與WT分離抹相比，賦予對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑的抗性的若干突變與降低了HIV-1分離抹的復(fù)制能力和相對(duì)適應(yīng)度(Croteauetal.JVirol1997;71:1089-96;Larderetal.Science1995;269:696-9;Harriganetal.JVirol1998;72:3773-8;Kosalaraksaetal.JVirol1999;73:5356-63;Wrinetal.ConferenceonRetrovirusesandOpportunisticInfections,SanFrancisco,January30-February2，2000)。HIV-1的高度藥物抗性變體的降低的復(fù)制能力可能對(duì)在被認(rèn)為是"失敗中的"抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者中的持續(xù)免疫效益有貢獻(xiàn)(Deeksetal.NEnglJMed2001;344:472-80)。在治療中斷時(shí)藥物抗性病毒被WT病毒相對(duì)快速替代提供了證椐證明在不存在藥物壓力時(shí)，WT病毒相對(duì)于藥物抗性變體而言，具有顯著的適應(yīng)度優(yōu)勢(shì)(Devereuxetal.AIDS1999;13(Suppl):F123-7;Verhofstedeetal.AIDS1999;13:2541-6;Milleretal.AIDS2000;14:2857-67)。因而，在HIV-1PR和RT中的藥物抗性突變體的積累顯著地?fù)p害病毒適應(yīng)度(Luetal.,J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.27:7-13;Martinez-Picadoetal.,J.Virol.73:3744-3752)。盡管存在高水平的藥物抗性，但降低的病毒適應(yīng)度仍能促進(jìn)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的持續(xù)效益，(Deeksetal.，N.Engl.J.Med,344:472-480)。然而，在不存在藥物的情況下，并非所有的抗性突變體一定能降低病毒適應(yīng)度。例如，在使用含有蛋白酶抑制物(PI)的方案進(jìn)行治療期間選擇的某些突變體可以改進(jìn)病毒復(fù)制，產(chǎn)生比初始的WT分離抹更適應(yīng)的突變(Nijhuisetal.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA89:10537-10541)。已經(jīng)報(bào)道了用于估計(jì)體外相對(duì)病毒適應(yīng)度的多種分析。這些方法中的大多數(shù)依靠點(diǎn)突變分析、直接群體測(cè)序，或取決于大量的分子克隆的測(cè)序來(lái)估計(jì)群體中WT和突變等位基因的頻率(Martinez-Picadoetal.JVirol1999;73:3744-52;Nijhuisetal.AIDS1999;13:2349-59)?；蛘?，通過(guò)從測(cè)序?qū)游稣Z(yǔ)分析相對(duì)峰高度來(lái)估計(jì)等位基因頻率(Kosalaraksaetal.JVirol1999)。然而，克隆分析和點(diǎn)突變分析很可能是耗時(shí)的和費(fèi)力的。此外，對(duì)于通過(guò)點(diǎn)突變分析研究的每個(gè)等位基因需要設(shè)計(jì)和驗(yàn)證獨(dú)特的引物。雖然直接群體測(cè)試是更為直接的，但是，在測(cè)序?qū)游鲎V上比較相對(duì)峰高度是估計(jì)混合群體中等位基因頻率的不精確的手段(Harriganetal.JVirol1998;72:3773-8)。重組病毒分析已經(jīng)提供了從血漿分離HIV的相對(duì)快速和可重現(xiàn)的方法(Kellametal.J.Virol.38(1994)，pp.23-30;Mascheraetal.J.Virol.69(1995),pp.5431-5436;Hertogsetal.Antimicrob.AgentsChemother.42(1998),pp.269-276;andRobinsonetal.AIDSRes.Hum.Retr.16(2000)，pp.1149-1156)。通過(guò)產(chǎn)生cDNA然后聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增藥物目標(biāo)基因PR和/或RT,并與在相應(yīng)于擴(kuò)增區(qū)域的區(qū)域中具有特異性刪除的克隆的原病毒DNA共同轉(zhuǎn)染。在共轉(zhuǎn)染的DNA片段中的重疊區(qū)域重新組合產(chǎn)生復(fù)制型病毒。Robinsonetal.,JournalofVirologicalMethods,104(2002)147-160描述了培養(yǎng)HIV-1的方法；其中除了整條PR和RT序列之外，包含Gag-Pol裂解位點(diǎn)的所有Gag基因也來(lái)自感興趣的分離抹。經(jīng)改良的單循環(huán)重組病毒檢驗(yàn)已經(jīng)被用于測(cè)定不同HIV-1分離林的復(fù)制能力，但其不能提供關(guān)于比較適應(yīng)度的實(shí)際數(shù)據(jù)，因?yàn)檫@種分析沒有測(cè)量不同病毒物種的竟?fàn)幮陨L(zhǎng)(Wrinetal.)。此外，單循環(huán)的重組病毒分析限于含有源自受試者的基因或特定突變的HIV-1克隆，此外測(cè)試的病毒沒有完成完整的復(fù)制周期(Quifiones-Mateuetal.,2002)。利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的基于PCR的差示探針雜交分析精確地定量了混合物中WT和突變序列的比例，但是必須針對(duì)每個(gè)感興趣的等位基因設(shè)計(jì)特定的探針(Eastmanetal.JClinMicrobiol1995;33:2777-80)。測(cè)序足夠大數(shù)量的克隆以估計(jì)等位基因頻率是費(fèi)力的，而峰高度比較是用于定量病毒準(zhǔn)物種混合物的相對(duì)不精確的方法。生長(zhǎng)竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)涉及用兩種不同的HIV-1分離株進(jìn)行的雙感染。可以在混合的感染物中直接比較兩種病毒毒林的相對(duì)適應(yīng)度，其中每種毒林被精確地定量，并且可從遺傳上和/或表型上與另一種相區(qū)分。一種分離株相對(duì)于另一種的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)是相對(duì)適應(yīng)度的衡量(Hollandetal.,1991)。盡管是更費(fèi)力的，通過(guò)允許突變和WT毒抹的直接比較，但生長(zhǎng)竟?fàn)幏治鎏峁┝藢?duì)病毒適應(yīng)度的精確估計(jì)。利用這種病毒竟?fàn)幐拍?，已?jīng)開發(fā)出了不同的技術(shù)，來(lái)定量?jī)煞N病毒在體外感染集中的最終比例，從而測(cè)量相對(duì)病毒適應(yīng)度。許多這些方法比較了相差單個(gè)氨基酸取代的HIV-1克隆的適應(yīng)度，必須依靠大量克隆的測(cè)序(SharmaandCrumpacker，1997;Harriganetal.,1998;Martinez畫Picadoetal.,1999,2000;Imamichietal.，2000)。近來(lái)的研究采用了更快速的技術(shù)來(lái)估計(jì)群體中兩種病毒的相對(duì)頻率(Quifiones-MateuandArts,2001)。例如，不同版本的雜雙鏈體跟蹤分析(HTA)已經(jīng)被用于對(duì)竟?fàn)幹械膬煞NHIV-1變體進(jìn)行精確地檢測(cè)和定量(Quifiones-Mateuetal.,2000;Nelsonetal.，2000;Reschetal.,2001)。新的技術(shù)例如實(shí)時(shí)PCR也被用于雙病毒檢測(cè)(DeRondeetal.,2001)。Quifiones-Mateu等人(2002)近來(lái)開發(fā)了新的實(shí)時(shí)PCR/TaqMan分析，其通過(guò)直接與非亞型BHIV-1對(duì)照竟?fàn)巵?lái)測(cè)量HIV-l亞型B毒抹的相對(duì)產(chǎn)量。Lu和Kuritzkes(JAIDS,27:7-13，May2001)開發(fā)了新的重組標(biāo)記物病毒分析(RMVA)，來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)竟?fàn)幏治龊蟮膬煞NHIV-1克隆。在刪除RT的原病毒克隆中用兩種不同的標(biāo)記基因(hisD或PLAP)替代nef基因。在生長(zhǎng)竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)之后，經(jīng)由對(duì)相應(yīng)標(biāo)記物的實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量含不同的RT編碼區(qū)的兩種RMV克隆(pHIVdeltaenvBSTEIIdeltanef-hisD和pHIVdeltaenvBSTEIIdeltanef-PLAP)的比例。然而，由于包膜(env)區(qū)域是HIV基因組最為可變的區(qū)域，即，提供了對(duì)藥物或中和抗體的很多逃避突變的最高頻率的突變，因此，外來(lái)基因?qū)ef基因的消除或替代將不可避免地影響原始病毒的性質(zhì)。因而，這種方法仍不能提供可以模擬目標(biāo)病毒的體內(nèi)效果的體外模型。因而存在著對(duì)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的用于測(cè)試病毒適應(yīng)度的方法的需求，所述方法能模擬體內(nèi)環(huán)境、易于使用并易于以精確和精密的方式定量。還需要容許在單個(gè)分析試管中進(jìn)行對(duì)多種病毒的多路分析的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其可以測(cè)量在環(huán)境中病毒的復(fù)制能力。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其可以測(cè)量不同病毒物種的竟?fàn)幧L(zhǎng)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其不需要采用為被研究的每個(gè)等位基因設(shè)計(jì)并驗(yàn)證的引物或探針。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其對(duì)完全完整的復(fù)制循環(huán)加以測(cè)試。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其對(duì)于在病毒準(zhǔn)物種中測(cè)定混合物來(lái)說(shuō)是精確的。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的方法，其在估計(jì)病毒適應(yīng)度方面是精確的。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供評(píng)估病毒適應(yīng)度的模型，其可以模擬體內(nèi)條件。WO03/020878提供了對(duì)擴(kuò)增和檢測(cè)測(cè)試樣品中的HIV-l目標(biāo)序列有用的寡核苷酸引物集、探針和其組合。TibotecPharmaceuticalsLtd.的EP1283272涉及評(píng)估HIV治療的方法和產(chǎn)品。特別是，測(cè)定了HIV包膜蛋白的分子事件和它們對(duì)藥物的治療效力的影響。這些方法依靠通過(guò)基因分型或表型分型來(lái)提供HIV包膜核酸材料并評(píng)估治療。WO03/0U334公開了HIVTat蛋白或多核苷酸；或HIVNef蛋白或多核苷酸；或與HIVNef蛋白或多核苷酸連接的HIVTat蛋白或多核苷酸；以及HIVgp120蛋白或多核苷酸在疫苗生產(chǎn)中的用途，所述疫苗適合于針對(duì)HIV的人類預(yù)防性或治療性免疫的初次-強(qiáng)化遞送，其中所述遞送經(jīng)由轟擊方法實(shí)現(xiàn)。WO00/29611涉及對(duì)樣品中的HIV進(jìn)行亞型和/或物種全面性沖企測(cè)的方法，其中使用至少一種寡核苷酸，其含有來(lái)自以下的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸(i)HIV的gaggene或pol基因的LTR區(qū)域的高度保守區(qū)域，(ii)另一種HIV分離物的相應(yīng)區(qū)域的高度保守區(qū)域；(iii)源自多種HIV分離物的共有序列的相應(yīng)區(qū)域的、或與之互補(bǔ)的序列的高度保守區(qū)域。FR2869045提供了對(duì)可能含有HIV病毒的樣品進(jìn)行分析的方法，所述方法包括以下步驟(a)提取病毒RNA;(b)對(duì)步驟(a)獲得的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用第一對(duì)引物擴(kuò)增從而允許產(chǎn)生包含HIV基因組的至少兩個(gè)連續(xù)基因的全部或部分的、擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；(d)使用一組第二對(duì)引物對(duì)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增；(e)與步驟(d)制備的上述擴(kuò)增產(chǎn)物的栽體進(jìn)行同源重組；(f)對(duì)上述至少兩個(gè)基因的全部或部分編碼的病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析；(g)測(cè)量步驟(e)獲得的重組病毒的復(fù)制能力。TibotecPharmaceuticalsLtd.的EP1285971涉及評(píng)價(jià)HIV治療的方法和產(chǎn)品。該方法基于評(píng)價(jià)引起所研究化合物的改變的治療效力的、在HIV整合酶(int)上的分子事件來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些方法依靠提供整合酶基因并通過(guò)基因分型或表型分型所述整合酶基因來(lái)評(píng)價(jià)。US2005/244818公開了單個(gè)細(xì)胞水平的表型分析，其可以同時(shí)分析HIV-1藥物易感性和內(nèi)在的復(fù)制能力。這容許對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物在抑制病毒復(fù)制和選擇具有降低的復(fù)制能力的抗性病毒方面的功能進(jìn)行定量剖析。所公開的分析提供了對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的患者合理評(píng)價(jià)治療決定的工具。WeberJanetal.,TheJournalofGeneralVirology,Aug2003，vol.84，no,Pt8公開了下述TaqMan實(shí)時(shí)PCR分析，以離體估計(jì)在多目標(biāo)(pol和env)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療階段中人類免疫缺陷病毒1型適應(yīng)度。WO05/108588涉及基于HIV的重組病毒克隆，其是以下基因操作的結(jié)果HIV片段的刪除(例如，Nef基因)而不損失傳染能力；摻入不在人類細(xì)胞中表達(dá)的基因；插入LacZ基因；導(dǎo)入限制性位點(diǎn)以從基礎(chǔ)原病毒提取DNA片段和用來(lái)自被評(píng)估患者的基因取代基因。此外，本發(fā)明涉及所述克隆在與AIDS相關(guān)的分析方法中的應(yīng)用。VanMaarseveenetal.，JournalofVirologicalmethods,vol.133,2006,pages185-194,公開了下述實(shí)時(shí)PCR分析，以測(cè)定HIV-l蛋白酶變體和/或逆轉(zhuǎn)錄酶變體的相對(duì)復(fù)制能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于測(cè)定兩種HIV病毒在環(huán)境中的復(fù)制能力的體外或離體方法，所述方法包括下述步驟a)產(chǎn)生標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，其包含標(biāo)簽化的HIVDNA栽體和來(lái)自第一目標(biāo)HIV病毒的第一擴(kuò)增子；其中通過(guò)在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生所述標(biāo)簽化的HIVDNA栽體；其中所述標(biāo)簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于(correspondsatmost)或重疊于來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的所述第一擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；其中所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變被導(dǎo)入下述基因中，所述基因不被來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的所述第一擴(kuò)增子包括；以及其中所述第一擴(kuò)增子包含來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；b)產(chǎn)生未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，其包含未標(biāo)簽化的HIVDNA載體和來(lái)自第二目標(biāo)HIV病毒的第二擴(kuò)增子；其中所述未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體不包含在步驟a)的標(biāo)簽化的HIVDNA載體中導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)沉默突變；其中所述未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于(correspondsatmost)或重疊于來(lái)自所述第二目標(biāo)HIV病毒的所述第二擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；以及其中所述第二擴(kuò)增子包含來(lái)自第二目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；c)在給定環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)物中混合步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及d)通過(guò)檢測(cè)所述標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變，和通過(guò)檢測(cè)未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中一個(gè)或多個(gè)沉默突變的缺乏，通過(guò)定量擴(kuò)增測(cè)定總病毒群體內(nèi)標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例。特別地，所述第一目標(biāo)病毒可以是WT病毒，所述第二目標(biāo)病毒可以是突變病毒毒林，或者反過(guò)來(lái)。備選地，所述第一目標(biāo)病毒可以是突變病毒毒林，所述第二目標(biāo)病毒可以是不同的突變病毒毒林。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及上文提及的方法，其中針對(duì)環(huán)境中三種或更多種目標(biāo)HIV病毒來(lái)測(cè)定復(fù)制能力，所述方法包括下述步驟a)產(chǎn)生上文提及的方法的步驟a)的標(biāo)簽化的重組傳染性病毒；b)產(chǎn)生上文提及的方法的步驟b)的未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒；c)產(chǎn)生其它一種或多種標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，每種包含標(biāo)簽化的HIVDNA栽體和來(lái)自其它一種或多種目標(biāo)HIV病毒的第三種或后續(xù)的擴(kuò)增子；其中通過(guò)在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體，所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變不同于這種方法的步驟a)的所述第一標(biāo)簽化的HIVDNA載體的一個(gè)或多個(gè)沉默突變；其中每種所述標(biāo)簽化的HIVDNA栽體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于(correspondsatmost)或重疊于來(lái)自所述第三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的所述第三或后續(xù)的擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；其中所迷一個(gè)或多個(gè)沉默突變被導(dǎo)入下述基因中，所述基因不被來(lái)自所述第三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的所述第三或后續(xù)的擴(kuò)增子包括；以及其中所述第三或后續(xù)的擴(kuò)增子包含來(lái)自所述第三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；d)在給定的環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)物中混合步驟c)的重組傳染性病毒和步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及e)通過(guò)檢測(cè)每種所述標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變，和通過(guò)檢測(cè)未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中一個(gè)或多個(gè)沉默突變的缺乏，通過(guò)定量擴(kuò)增測(cè)定總病毒群體內(nèi)每種標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例。本發(fā)明提供了重組病毒標(biāo)記物病毒系統(tǒng)，其中每種所述標(biāo)簽化的的主干(backbone)。重組病毒標(biāo)記物病毒系統(tǒng)進(jìn)一步提供了被設(shè)計(jì)來(lái)恢復(fù)、制備和分析幾種和各種HIV遺傳材料的原病毒DNA、質(zhì)粒構(gòu)建體、引物和探針。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)簽化的HIVDNA載體或未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體是原病毒HIVDNA或質(zhì)粒DNA。因?yàn)閷?duì)一個(gè)或多個(gè)栽體進(jìn)行了標(biāo)簽化，所以可以通過(guò)用定量的擴(kuò)增來(lái)定量每種標(biāo)簽化的基因的頻率，來(lái)容易地測(cè)定攜帶每種標(biāo)簽化的序列的混合培養(yǎng)物中的病毒的比例。從而避免了為每種等位基因設(shè)計(jì)獨(dú)特的引物的需要。此外，與原始分離株相比，使用重組病毒消除了感興趣的編碼區(qū)外部的多態(tài)性或突變對(duì)相對(duì)適應(yīng)度的可能影響。這些重組克隆的主要益處之一是在相同的遺傳背景下在當(dāng)前蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物的選擇的情況下研究特定編碼區(qū)的靈活性。實(shí)際上，與HIV-l原始分離林相比，使用重組病毒消除了目標(biāo)編碼區(qū)外部的多態(tài)性或突變的可能的適應(yīng)度影響。因而，獲得了可以用于研究所有類型的HIV變體的適應(yīng)度的完全標(biāo)準(zhǔn)化方案。測(cè)定病毒適應(yīng)度的方法對(duì)于設(shè)計(jì)治療方式可能是有用的。例如，一種方法可以包括測(cè)定在存在一種或多種藥物的情況下患者的臨床分離林的相對(duì)復(fù)制能力，并使用所述相對(duì)復(fù)制能力來(lái)確定該患者的適合的藥物療法。本發(fā)明還提供了下述方法，來(lái)幫助科學(xué)家研究在存在或缺乏環(huán)境因素時(shí)不同的HIV毒林的進(jìn)化，所述環(huán)境因素例如但不限于，藥物壓力，稀釋因子，竟?fàn)幮越Y(jié)合蛋白質(zhì)例如白蛋白、Ctl-糖蛋白，細(xì)胞系等等。此外，本發(fā)明提供了選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的引物;HIV質(zhì)粒載體，其包含HIV基因中標(biāo)簽化的或未標(biāo)簽化的序列和gag、pol或env基因基因序列、其部分和其組合的刪除，其中所述標(biāo)簽4匕的序歹'J在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個(gè)或多個(gè)沉默突變。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于定量HIV病毒的病毒適應(yīng)度的試劑盒。用于測(cè)定在一定環(huán)境中兩種或更多種HIV病毒的病毒適應(yīng)度的此類試劑盒包含i)選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種引物；和/或ii)一種或多種標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒栽體和任選的未標(biāo)簽化的HIVHXB2D質(zhì)粒載體；和iii)任選的用于定量擴(kuò)增的探針，如本發(fā)明所描述的。還可用至少一種HIV抑制物來(lái)使得此類試劑盒完整化。任選地，可以添加帶有WTHIV序列的參考原病毒DNA或質(zhì)粒。任選地，對(duì)于HIV感染易感的細(xì)胞可以添加到試劑盒中。此外，可以添加其它環(huán)境因素。通過(guò)定量擴(kuò)增對(duì)總病毒群體中一種或多種標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例的測(cè)定通過(guò)體外擴(kuò)增技術(shù)來(lái)進(jìn)行，所述技術(shù)包括但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈交換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、自持的序列復(fù)制(3SR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(TAS)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(由Schweitzer,B.andKingsmore,S.，2001，Combiningnucleicacidamplificationanddetection.CurrentOpinioninBiotechnology,12:21-27綜述)。可以4吏用一些方案來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)通過(guò)體外擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的擴(kuò)增子積累，所迷方案采用LuxTM發(fā)熒光引物、可被DNAzymes、QZymes或MNAzymes裂解的探針、TaqMan⑧探針、分子信標(biāo)、蝎子引物(scorpions)或任何其它FRET探針。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，其中通過(guò)采用MNAzymes作為監(jiān)視技術(shù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行定量擴(kuò)增。來(lái)自病毒適應(yīng)度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以用于針對(duì)大量的WT和突變HIV毒林開發(fā)存在或不存在特定環(huán)境因素下特定擴(kuò)增子的復(fù)制能力水平的數(shù)據(jù)庫(kù)。特定擴(kuò)增子的基因型或表型可以與存在其它病毒的情況下所述特定擴(kuò)增子的復(fù)制能力相關(guān)聯(lián)。檢索相同的基因型或表型，向數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步提問來(lái)鑒定對(duì)于任何被檢索序列來(lái)說(shuō)是否已知相應(yīng)的病毒適應(yīng)度。在后一種情況中，可以確定有效的病毒適應(yīng)度?？梢陨蓤?bào)告，包括病毒抹相對(duì)于一種或多種其它毒株(包括WT)的病毒適應(yīng)度，研究中的毒林的基因型和/或表型，以及其它信息，如測(cè)試的環(huán)境因素、生物制劑篩截，等等。這種數(shù)據(jù)庫(kù)可以與gag、pol或env基因序列信息一起被分析，結(jié)果用于確定合適的治療策略。-附圖l,在中心部分，是完整HIV基因組的示意圖。在上部，包膜基因是強(qiáng)調(diào)示出的，其表明了標(biāo)簽的位置以及以及用于檢測(cè)該標(biāo)簽的引物結(jié)合的位置。在下半部分，是用于擴(kuò)增gag蛋白酶擴(kuò)增子的引物結(jié)合的位置的示意圖概觀，其稍后可以與合適的標(biāo)簽化的或未標(biāo)簽化的質(zhì)粒載體重新結(jié)合。-附圖2顯示了pGEM載體pGEM-HIVdelGPRT的圖鐠(登記號(hào)nrLMBP4568,于2002年7月1日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時(shí)微生物協(xié)作保藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所述載體具有g(shù)ag蛋白酶逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列的刪除。-附圖3顯示了pGEM栽體的圖語(yǔ)(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env))(登記號(hào)nrLMBP5112,于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時(shí)樣i生物協(xié)作保藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所述載體具有g(shù)ag蛋白酶逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列的刪除，并還包含標(biāo)簽化的包膜基因。-附圖4顯示了pGEM載體的圖鐠(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int))(登記號(hào)nrLMBP5113,于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie的比利時(shí)樣i:生物協(xié)作^f呆藏所)，其中亞克隆的HIV基因被鑒定出。所迷載體具有g(shù)ag蛋白酶逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列的刪除，并還包含標(biāo)簽化的整合酶序列。-附圖5是對(duì)MT4細(xì)胞中各種相對(duì)輸入濃度下HIVHXB2DWT和標(biāo)簽化的mVHXB2D的隨時(shí)間的病毒生長(zhǎng)情況的比較。-附圖6描繪了對(duì)來(lái)自使用雙標(biāo)記共感染的MT4細(xì)胞的HIVHXB2DWT和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的檢測(cè)。-附圖7a、7b和7c顯示了針對(duì)模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的擴(kuò)增曲線，其中用引物SEQIDNO:7和6進(jìn)行擴(kuò)增。B-FAM標(biāo)記對(duì)應(yīng)于HIVHXB2DDNA(附圖7a)，D-JOE對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖7b),TAMRA對(duì)應(yīng)于持家基因(GAPD)(附圖7c)。-附圖8a、8b和8c顯示了針對(duì)模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的擴(kuò)增曲線，其中用引物SEQIDNO:5和6進(jìn)行擴(kuò)增。B-FAM標(biāo)記對(duì)應(yīng)于HIVHXB2DDNA(附圖8a)，D-JOE對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖8b)，TAMRA對(duì)應(yīng)于持家基因(GAPD)(附圖8c)。-附圖9a、9b和9c顯示了針對(duì)模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的擴(kuò)增曲線，其中用引物SEQIDNO:8和9進(jìn)行擴(kuò)增。B-FAM標(biāo)記對(duì)應(yīng)于HIVHXB2DDNA(附圖9a),D-JOE對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖9b)，TAMRA對(duì)應(yīng)于持家基因(GAPD)(附圖9c)。-附圖10a、10b和10c顯示了針對(duì)模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的擴(kuò)增曲線，其中用引物SEQIDNO:5、6、7、8和9進(jìn)行擴(kuò)增。B-FAM標(biāo)記對(duì)應(yīng)于HIVHXB2DDNA(附圖10a),D-JOE對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖10b)，TAMRA對(duì)應(yīng)于持家基因(GAPD)(附圖10C)。-附圖U提供了附圖7-10中顯示的擴(kuò)增的材料的終點(diǎn)凝膠電泳的圖。-附圖12是對(duì)MNAzyme的示范性設(shè)計(jì)的描述，其中partzymesA和B的底物臂部分(A)結(jié)合報(bào)告物(Reporter)底物，其上附著了熒光標(biāo)簽(左)和淬滅劑(右)。催化核心部分(C)位于底物臂部分(A)和感受器臂部分(B)之間。在感受器臂部分(B)與目標(biāo)(Target)結(jié)合時(shí)，報(bào)告物(Repoter)底物在MNAzyme裂解位點(diǎn)(MNAzymeCleavageSite)被裂解，從而增加了熒光。-附圖13:多目標(biāo)的示范性多路分析的示意圖可以使用兩種或更多種底物同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種目標(biāo)，每種底物特異于一種MNAzyme。優(yōu)選地，用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記底物。在這個(gè)實(shí)施例中，目標(biāo)l可以通過(guò)監(jiān)視FAM熒光方面的提高來(lái)檢測(cè)，目標(biāo)2可以通過(guò)監(jiān)視JOE熒光方面的提高來(lái)檢測(cè)。Q:淬滅劑；FAM，JOE:熒光基團(tuán)。-附圖14呈現(xiàn)了用于監(jiān)視HIV病毒適應(yīng)度的MNAzymePCR分析的實(shí)例。闡述了雙鏈PCR分析，其使用兩種MNAzymes用于兩個(gè)序列的同時(shí)檢測(cè)和定量。上部的序列HIVHXB2DWT,含有位于被MNAzyme1識(shí)別的第二區(qū)域的5'的野生型(WT)序列。在笫二(3')區(qū)域中的灰色圓圏相應(yīng)于為標(biāo)簽化的野生型堿基。所述下部的序列標(biāo)簽化的HIVHXB2D含有通過(guò)感興趣的HIV目標(biāo)病毒(T)的擴(kuò)增衍生的序列，其位于由MNAzyme2識(shí)別的第二區(qū)域的5'。在第二(3')區(qū)域中的條紋方形相應(yīng)于沉默突變(標(biāo)簽化的堿基)。正向PCR引物(箭頭5'P)和反向PCR引物(箭頭3'P)指示了上部的HXB2DWT和下部的標(biāo)簽化的HXB2D序列。MNAzyme1在存在上部HXB2DWT擴(kuò)增子的情況下適應(yīng)度，產(chǎn)生在FAM(F)和淬滅劑(Q)之間裂解底物1(S-l)的活性核酸酶。MNAzyme2在存在下部的標(biāo)簽化的HXB2D序列的情況下適應(yīng)度，產(chǎn)生在JOE(J)和淬滅劑(Q)之間裂解底物2(S-2)的活性核酸酶。發(fā)明的簡(jiǎn)要說(shuō)明定義術(shù)語(yǔ)"病毒適應(yīng)度"是指任何HIV-1變體在給定環(huán)境下，例如在存在或不存在藥物的細(xì)胞系統(tǒng)中的復(fù)制能力。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽"是指化學(xué)部分，其是核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸，當(dāng)其取代另一個(gè)序列或添加至另一個(gè)序列時(shí)，為該序列提供了額外的用途，或賦予了有用的性質(zhì)，特別是在對(duì)其檢測(cè)或分離方面。特別地，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽"是指下述一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其在HIVDNA載體中被具有獨(dú)特性的其它一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換，這些核苷酸的替換都是沉默突變，其不破壞HIVDNA的閱讀框。在本發(fā)明中，一個(gè)或多個(gè)沉默突變被導(dǎo)入HIVDNA栽體中，特別是選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中，從而產(chǎn)生"標(biāo)簽化的HIVDNA栽體"。"未標(biāo)簽化的HIVDNA載體"是指不包含導(dǎo)入所迷標(biāo)簽化的HIVDNA栽體中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變的栽體。"擴(kuò)增子"被定義為通過(guò)離體或體外核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的任何核酸分子。特別是，擴(kuò)增子包含當(dāng)與引物接觸時(shí)能與引物雜交并且可以是整個(gè)分子或其部分的序列。來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子是指感興趣的HIV目標(biāo)病毒的核酸序列，它的復(fù)制能力將要通過(guò)本發(fā)明來(lái)測(cè)定。特別地，來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子包含HIV基因之一或其部分以及其組合，所述基因選自gag、pol和env基因，即，gag基因、pol基因的DBM編碼區(qū)、pol基因的逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)、pol基因的整合酶編碼區(qū)、env基因、其部分、以及其組合。特別地，來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子選自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env和其部分。另外，擴(kuò)增子可以包括側(cè)翼區(qū)域，例如，對(duì)于gag-PR和PR-RT基因，具有5'LTR序列的那些側(cè)翼區(qū)域或其部分。應(yīng)當(dāng)理解，這種擴(kuò)增子可以是各種來(lái)源的，包括質(zhì)粒、來(lái)自患者的材料或?qū)嶒?yàn)室病毒，包括IIIB和NL4-3，或任何其它突變的或WT病毒。來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子不能與在定量擴(kuò)增期間擴(kuò)增的序列混淆。這種最后的序列或擴(kuò)增子分別對(duì)應(yīng)于標(biāo)簽化的HIVDNA載體或未標(biāo)簽化的HIVDNA載體的標(biāo)簽化的或未標(biāo)簽化的區(qū)域。這些標(biāo)簽化的HIVDNA栽體或未標(biāo)簽化的HIVDNA載體最后與來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子重新組合，定量擴(kuò)增的序列來(lái)源于重組病毒。特別地，定量擴(kuò)增的擴(kuò)增子包含或缺少在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)沉默突變。"引物"是指DNA或含DNA的核酸分子的短片段，其(i)能在經(jīng)由聚合酶;導(dǎo)的合成啟動(dòng)，^本身物理地?cái)U(kuò)大。-'〃、'目標(biāo)核酸序列的"擴(kuò)增"是指體外目標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)，借此目標(biāo)序列被拷貝，產(chǎn)生充當(dāng)進(jìn)一步的擴(kuò)增循環(huán)的模板的擴(kuò)增子。這種體外擴(kuò)增技術(shù)包括但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈交換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、自持的序列復(fù)制(3SR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(TAS)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。"環(huán)境"是指藥物壓力，例如抗病毒藥物、抗生素或任何其它藥物，竟?fàn)幮越Y(jié)合蛋白質(zhì)，例如白蛋白、al糖蛋白、毒素，特定類型的介質(zhì)、血清和其成分，稀釋因子，細(xì)胞系，溫度，壓力，放射等等。治療或治療方式是指通過(guò)使用藥物、以給定劑量、時(shí)間間隔、持續(xù)時(shí)間、單獨(dú)地或不同組合地，經(jīng)由不同的給藥途徑，在適合的制劑中，等等，對(duì)個(gè)體的醫(yī)學(xué)狀況的管理或處理。"藥物"是指任何試劑，例如化學(xué)治療劑、肽、抗體、反義物、核酶和任何它們的組合，無(wú)論它是市場(chǎng)化的還是正在開發(fā)的?？梢栽诒景l(fā)明的分析中測(cè)試的抗HIV藥物的實(shí)例包括所有批準(zhǔn)的和正在開發(fā)的核苷酸、核苷以及非核苷RT抑制物、PR抑制物、侵入抑制物、包膜抑制物和整合酶抑制物。HIV抑制物包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物(NRTI)、核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物(NtRTI)、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物(NNRTI)、蛋白酶抑制物(PI)、侵入抑制物、融合抑制物、gp41抑制物、gpl20抑制物、整合酶抑制物、共同受體抑制物(例如，CCR5、CXCR4、...)、出芽/成熟抑制物，等等。HIV核苷RT抑制物包括其作用機(jī)制包括抑制病毒RT酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HIV核普逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物包括疊氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)、司他夫定(d4T)、扎西他濱(ddC)、去羥肌苷(ddl)、阿巴卡韋(ABC)。的那些化合物^舉例^言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HHIV非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物包括奈韋拉平、地拉韋定、施多寧、TMC120、TMC125、卡普韋林、calanolide、UC781、SJ-1366、二苯甲酮、PETT化合物、TSAO化合物。的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HIV非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物包括阿德福韋(PMEA)、替諾福韋(PMPA)和其它膦酸酯。HIV蛋白酶抑制物包括其作用機(jī)制包括抑制病毒蛋白酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HIV蛋白酶抑制物包括利托那韋(RTV)、茚地那韋(IDV)、奈非那韋(NFV)、安普那韋(APV)、替利那韋(SC-52151)、替拉那韋(TPV)、沙奎那韋(SQV)、洛匹那韋(LPV)、阿扎那韋、帕利那韋、莫折那韋、BMS186316、DPC681、DPC684、AG1776、GS3333、KNI-413、KNI-272、L754394、L756425、LG-71350、PD161374、PD173606、PD177298、PD1783卯、PD178392、PNU140135、山楂酸、U-140690、RO033-4649、TMC114、TMC26，它們的前體藥物、代謝物、N-氧化物和鹽。HIV侵入抑制物或gpl20抑制物包括其作用機(jī)制包括抑制病毒侵入或gpl20糖蛋白的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，現(xiàn)有的將來(lái)新的化合物，HIV進(jìn)入或gpl20抑制物包括BMS806、硫酸葡聚糖、蘇拉明、菊苣酸。HIV融合抑制物或gp41抑制物包括其作用;f幾制包括抑制病毒融合或gp41糖蛋白的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HIV融合或gp41抑制物包括T20、T1249。HIV整合酶抑制物包括其作用機(jī)制包括抑制病毒整合酶的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，HIV整合酶抑制物包括L-870810、L-870812、pyranodipyrimydines、S-1360。共同受體抑制物包括其作用機(jī)制包括抑制HIV與細(xì)胞膜上存在的細(xì)胞受體(例如CCR5、CXCR4)的相互作用的那些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，共同受體抑制物包括TAK779、AMD3亂AMD8664、AMD070、SHC國(guó)C、SHC-D、AK602、TAK-220、UK-427,857、T22。些化合物。舉例而言(且不限于現(xiàn)有的和將來(lái)新的化合物)，Hrv、出芽/成熟抑制物包括PA-457。術(shù)語(yǔ)"嵌合"指包含來(lái)自不同來(lái)源的核酸材料的構(gòu)建體，例如，WT病毒與實(shí)驗(yàn)室毒株的組合、WT序列和受試者衍生的臨床分離物序列的組合。病毒如本文所使用的，人類免疫缺陷病毒(HIV)是指下述任何HIV,其包括實(shí)驗(yàn)室毒抹、野生型毒林、突變毒抹和包含至少一種HIV病毒(例如，HIV臨床分離抹)的任何生物樣品。與本發(fā)明相符的HIV毒抹是能夠感染哺乳動(dòng)物、特別是人類的任何這種毒抹。實(shí)例有HIV-1、HIV-2和SIV。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，HIV病毒是指包含至少一種HIV病毒的任何樣品。例如，樣品可以從個(gè)體、從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得，或使用重組技術(shù)或克隆來(lái)產(chǎn)生。與本發(fā)明相符的HIV毒林是能夠感染細(xì)胞系和人類的任何這種毒林。用于獲得質(zhì)粒的病毒林優(yōu)選是HIV野生型序列，例如LAI、用于B亞型HIV研究的HXB2D。LAI,也稱為IIIB，是野生型HIV毒抹。它的一個(gè)特別的克隆(這意味著一條序列)是HXB2D。這種HXB2D序列可以摻入質(zhì)粒中。也可以使用來(lái)自其它亞型或群組的HIV的其它克隆。HIVDNA,例如原病毒DNA，可以代替病毒RNA用于本文描述的方法。在使用RNA的情況中，需要通過(guò)適合的逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。描述RNA分析的方案也可以用于DNA分析。然而，如果方案從DNA開始，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道不需要逆轉(zhuǎn)錄。被設(shè)計(jì)賴以擴(kuò)增RNA鏈的引物也與DNA退火并擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增可以用單個(gè)引物集進(jìn)行。適合地，可以用半嵌套方法，或更適合地，嵌套方法來(lái)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增遺傳物質(zhì)。來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子可以從HIV-1臨床分離物、定點(diǎn)突變體、或從選擇實(shí)驗(yàn)得出的病毒獲得。任何類型的患者樣品可以用于獲得期望的擴(kuò)增子，例如，血清、血液和組織。病毒RNA可以使用已知的方法分離，例如在Boom,R.etal.(Boom，R.etal.(J.Clin.Microbiol.28(3):495-503(1990),通過(guò)引用合并進(jìn)本文)中描述的，或通過(guò)其它常規(guī)方法，例如酸苯酴方法(例如，酸胍-笨酚-氯仿(AGPC)方法)、異硫氰酸胍操作、采用Chomczynski和Sacchi的方法(Anal.Biochem.162，156-159(1987))。備選地，可以用許多商業(yè)的方法例如QIAAMP病毒RNA試劑盒(Qiagen,Inc.),從體液如血漿、血清或無(wú)細(xì)胞液體獲得病毒RNA。也可以利用Trizol(Gibco),按照廠家所述，從沉淀的病毒分離病毒RNA。用于分離病毒RNA的其它商業(yè)的試劑盒包括但不限于，QiagenRNeasy試劑盒、Catrimox-14RNA分離試劑盒Ver.2.11(TaKaRa)、RNAgents總RNA分離系統(tǒng)(Promega)、RNAzol、Tel-Test、Stratagene、Tri-ReagentBD(Sigma)、purescript總RNA分離試劑盒(GentraSystems,orQiagen)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如Maniatis等人(1982)描述的過(guò)程從組織提取DNA，其涉及制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，隨后用蛋白酶K消化，通過(guò)多步驟的笨酚、乙醇沉淀和核糖核酸酶消化提取，實(shí)現(xiàn)DNA純化。任選地，也可以用可獲得的商業(yè)方法，來(lái)從體液獲得DNA，例如用QIAAMPBlood試劑盒用于從血液和體液的DNA分離(Qiagen,Inc.)?；パa(bǔ)DNA可以用SensiscriptRT(Qiagen)合成。核酸可以通過(guò)一些技術(shù)來(lái)擴(kuò)增，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈交換擴(kuò)增(SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、自持的序列復(fù)制(3SR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(TAS)和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。HIVDNA載體本發(fā)明涉及標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體。這種病毒DNA可以是原病毒DNA,即，是能復(fù)制的準(zhǔn)型病毒，或其它類型的栽體，例如質(zhì)粒。特別地，原病毒DNA和載體或質(zhì)粒具有在其DNA序列中的刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于或重疊于來(lái)自以上所指目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的質(zhì)粒，以及涉及在本文公開的方法中使用所述質(zhì)粒。完整的HIV序列可以摻入質(zhì)粒中，或者僅其一部分，例如，本發(fā)明中使用的質(zhì)粒缺少gag、pol和env基因、其部分和其組合。所述刪除還可以包含部分側(cè)翼基因，或最終超過(guò)一個(gè)基因。適合的質(zhì)粒主干可以選自包括pUC、pBR322和pGEM的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，每種標(biāo)簽化的HIVDNA載體和未標(biāo)簽化的HIVDNA載體包含野生型或突變毒抹的主干。在一個(gè)實(shí)施方式中，由標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體包含的質(zhì)粒DNA包含HXB2D野生型毒株的基因組。例如，可通過(guò)用合適的限制性內(nèi)切酶處理較長(zhǎng)的DNA、用合適的純化方法純化消化物、然后使這樣獲得的感興趣DNA片段自我連接，來(lái)制備含有本發(fā)明的DNA的刪除構(gòu)建體。因而，本發(fā)明的刪除構(gòu)建體的構(gòu)建可以通過(guò)用限制性內(nèi)切酶例如Clal和BcII限制性內(nèi)切酶消化來(lái)實(shí)現(xiàn)，這兩個(gè)酶在特定的位點(diǎn)裂解質(zhì)粒主干并從而除去gag和蛋白酶序列。備選地，在除去gag和蛋白酶序列之前，可以通過(guò)沉默突變將Munl或Nhel位點(diǎn)插入質(zhì)粒中，之后用Munl/BssHn或Nhel/BcII分別消化，隨后除去gag和蛋白酶序列。獨(dú)特的限制性位點(diǎn)指在核酸上被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的一個(gè)位點(diǎn)的單次出現(xiàn)，或者它不發(fā)生在構(gòu)建體中的別處?？梢栽跀U(kuò)增之后通過(guò)重新連接擴(kuò)增的質(zhì)粒的DNA的5'和3'末端來(lái)創(chuàng)建獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。備選地，獨(dú)特的限制性位點(diǎn)可能不必創(chuàng)建，因?yàn)樗赡芤呀?jīng)完全地位于末端之一中，5'或3'末端。任選地，可以插入獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。任選地，獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的部分可以存在于要擴(kuò)增的區(qū)域中。從擴(kuò)增衍生的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的創(chuàng)建是優(yōu)選的方法，因?yàn)檫@是單步驟的、直接的、簡(jiǎn)單的和快速的方法。獨(dú)特的限制性位點(diǎn)進(jìn)一步與重組病毒的產(chǎn)生相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的產(chǎn)生將取決于HIV基因組的序列，以及取決于要由此刪除的序列?？梢杂糜诒景l(fā)明中的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)是在HIV基因組中僅出現(xiàn)一次的那些，并且可以側(cè)翼于要?jiǎng)h除的感興趣區(qū)域，并且不改變閱讀框或由感興趣核酸所編碼的蛋白質(zhì)的序列。任選地，用于擴(kuò)增的引物可以含有相同的或其它的特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來(lái)便于插入不同的載體中。另外，用于擴(kuò)增的引物之一可以含有磷酸化的5'末端-接頭以便于外源擴(kuò)增子的插入。任選地，獲得含有下述WTHIV序列的質(zhì)粒的方法可以在第二克隆載體中進(jìn)行，所述WTHIV序列在最多對(duì)應(yīng)于或重疊于要重新組合的擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域的區(qū)域中具有刪除。例如，蛋白酶-逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域可以被插入克隆栽體例如pGEM質(zhì)粒中，例如，pGEM3載體的主干可以通過(guò)擴(kuò)增被使用和操作，以除去蛋白酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的部分，從而使得來(lái)自樣品的其余蛋白酶-逆轉(zhuǎn)錄酶序列的插入以不會(huì)破壞閱讀框的方式進(jìn)行。被操作的蛋白酶-逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域隨后被放入pGEM-HXB2D載體中，從而它除了含有相關(guān)的蛋白酶-逆轉(zhuǎn)錄酶刪除之外還含有完全的野生型HIV序列。蛋白酶-逆轉(zhuǎn)錄酶刪除載體的實(shí)例是pGEM-HXB2DAPR-RT，其具有包含整個(gè)蛋白酶編碼區(qū)和大部分逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的刪除。逆轉(zhuǎn)錄酶刪除載體的實(shí)例是pGEM-HXB2D△RT,其具有逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)的刪除。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域已知的其它的HIV栽體和克隆操作也可以用于創(chuàng)建缺少gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env的質(zhì)粒，用于與受試者衍生的序列重組或連接以及創(chuàng)建傳染性病毒。例如，可以通過(guò)重新將gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因的部分導(dǎo)入質(zhì)粒中來(lái)制備刪除構(gòu)建體，在所述質(zhì)粒中早先已經(jīng)分別刪除了gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT曙int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT或env基因。用于擴(kuò)增感興趣的區(qū)域，即要重新導(dǎo)入的部分的引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一般地，必須創(chuàng)建載體以容許刪除的序列的重新插入而不破壞gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR曙RT漏int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT和env基因的閱讀框。可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)沉默突變導(dǎo)入以上討論的質(zhì)粒構(gòu)建體來(lái)獲得標(biāo)簽化的HIVDNA載體。沉默突變的導(dǎo)入將應(yīng)用于形成質(zhì)粒的部分的那些基因，即，不形成來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子的部分的那些基因。一個(gè)或多個(gè)沉默突變可以摻入質(zhì)粒的任何mv基因，只要產(chǎn)生的重組病毒的表型保持不變即可。在一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)沉默突變的導(dǎo)入在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，沉默突變的導(dǎo)入在env或pol基因中，特別是在編碼包膜蛋白質(zhì)的env區(qū)域中、或在編碼整合酶的pol區(qū)域中進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，沉默突變的導(dǎo)入在env基因中進(jìn)行，在密碼子1和857之間、特別是在密碼子100和800之間、更特別是在密碼子200和600之間、又更特別是在密碼子300和500之間、例如在密碼子400和500之間、例如在密碼子430和490之間、特別是在密碼子468和475之間。在另一個(gè)實(shí)施方式中，沉默突變的導(dǎo)入在編碼整合酶酶的pol基因的區(qū)域中進(jìn)行，在密碼子1和288之間、特別是在密碼子50和275之間、更特別是在密碼子100和250之間、又更特別是在密碼子150和250之間、例如在密碼子200和250之間、特別是在密碼子230和231之間。沉默突變的這種引入可以通過(guò)使用QuickChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)和對(duì)感興趣區(qū)域的適合的誘變寡核苷酸引物來(lái)實(shí)現(xiàn)。定點(diǎn)誘變?nèi)菰S產(chǎn)生點(diǎn)突變，交換核苷酸以及刪除或插入單個(gè)或多個(gè)核苷酸，可能具有氨基酸水平上的改變。對(duì)于本發(fā)明的范圍，定點(diǎn)誘變被用于在感興趣的基因中插入沉默突變?；具^(guò)程使用質(zhì)粒DNA和兩個(gè)寡核苷酸引物，所述引物與質(zhì)粒的反鏈互補(bǔ)并含有期望的突變。這些引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)期間擴(kuò)增，這繼之以用限制性內(nèi)切酶DpnI消化，限制性內(nèi)切酶Dpnl是對(duì)于曱基化的和半曱基化的DNA的特異性核酸內(nèi)切酶。在這種消化期間，親本質(zhì)粒將被除去。具有期望的突變的新創(chuàng)建的質(zhì)?？梢杂糜谵D(zhuǎn)4匕E.coli。特別地，適合的誘變寡核苷酸引物是本文下文描述的引物和它們的同源物，本文要求了對(duì)它們的保護(hù)。SEQIDNO:l-2的引物對(duì)于將沉默突變摻入pol基因的整合酶編碼區(qū)域是有用的，SEQIDNO:3-4對(duì)于將沉默突變摻入HIV衍生的質(zhì)粒的包膜基因中是有用的。表l:誘變寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些引物選自SEQIDNO:1-4，或使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的算法如FASTA和BLAST測(cè)定時(shí)與SEQIDNO:1-4具有至少80%的同源性、優(yōu)選的90%的同源性、更優(yōu)選的95%的同源性。在此列出的引物序列任選地可以;故標(biāo)記。適當(dāng)?shù)兀@種標(biāo)記可以4吏用熒光、發(fā)光或吸光度來(lái)檢測(cè)。此外，位于在此給出的序列上游或下游50個(gè)核苷酸(nt)的區(qū)域內(nèi)的引物是本發(fā)明的一部分。特別地，引物可以位于在此給出的序列的上游或下游20nt的區(qū)域內(nèi)，它們也是本發(fā)明的一部分。并且，包含本文所述的任何引物中存在的至少8個(gè)連續(xù)堿基的引物構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施方式。感興趣地，引物包含在此處描述的任一引物中存在的至少12個(gè)連續(xù)堿基。在本發(fā)明的一個(gè)方面，引物可以含有接頭區(qū)域用于克隆。任選地，引物的接頭區(qū)域可以含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)是獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。備選地，引物可以與目標(biāo)區(qū)部分地退火。突變序列的存在可以通過(guò)最終質(zhì)?？寺〉腄NA測(cè)序來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明提供了HIV質(zhì)粒載體，其包含標(biāo)簽化的序列；和gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；其特征在于標(biāo)簽化的序列在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個(gè)或多個(gè)沉默突變；條件是所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變不位于刪除的基因序列中。本發(fā)明進(jìn)一步提供了HIV質(zhì)粒栽體，其包含gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；并且沒有標(biāo)簽化的序列。適當(dāng)?shù)?，HIV質(zhì)粒栽體來(lái)自HIV野生型毒林HXB2D(Ratneretal.(1987)AIDSRes.Hum.Retrovir.3:57-69])。適當(dāng)?shù)兀瑯?biāo)簽化的序列位于選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的一個(gè)或多個(gè)基因中,優(yōu)選的位于evn或pol基因中，更優(yōu)選的位于編碼包膜蛋白質(zhì)的env區(qū)域中，或位于編碼整合酶的pol區(qū)域中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體在env基因中包含標(biāo)簽化的序列，其在密碼子1和857之間、特別是在密碼子100和800之間、更特別是在密碼子200和600之間、又更特別是在密碼子300和500之間、例如在密碼子400和500之間、例如在密碼子430和490之間、特別是在密碼子468和475之間。在env基因中包含標(biāo)簽化的序列的這些HIV質(zhì)粒栽體是要求被保護(hù)的。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體在編碼整合酶的pol基因的區(qū)域中包含標(biāo)簽化的序列，其在密碼子1和288之間、特別是在密碼子50和275之間、更特別是在密碼子100和250之間、又更特別是在密碼子150和250之間、例如在密碼子200和250之間、特別是在密碼子230和231之間。在pol基因的整合酶編碼區(qū)域中包含標(biāo)簽化的序列的這些HIV質(zhì)粒載體是要求被保護(hù)的。特別地，本發(fā)明提供了標(biāo)簽化的HIVDNA載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)(登記號(hào)碼LMBP5112，SEQIDNO:28)和pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int)(登記號(hào)碼LMBP5113,SEQIDNO:29),其已經(jīng)于2005年12月20日保藏于位于UniversiteitGent-Plasmidecollectievakgroepmoleculairebiologie的比矛J時(shí)孩i生物十辦作寸呆藏所中。標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的產(chǎn)生通過(guò)將每種標(biāo)簽化的或未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體與感興趣的編碼片段，即來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，隨后通過(guò)細(xì)胞中的無(wú)細(xì)胞病毒上清液的傳代，可以產(chǎn)生重組的標(biāo)簽化和未標(biāo)簽化的傳染性的病毒。轉(zhuǎn)染可以通過(guò)電穿孔、連接、脂轉(zhuǎn)染或任何其它方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了制備重組HIV病毒，gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、env或其部分的擴(kuò)增序列4皮摻入標(biāo)簽化的或未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體中，所述栽體包含具有最多相應(yīng)于所述擴(kuò)增子的部分的刪除的HIV野生型或其突變毒抹。在擴(kuò)增子和刪除構(gòu)建體之間遺傳物質(zhì)交換時(shí)產(chǎn)生傳染性的克隆，來(lái)產(chǎn)生HIV序列。可以通過(guò)在適合的宿主細(xì)胞中在載體和擴(kuò)增子序列的重疊DNA片段之間的同源重組，來(lái)將來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子摻入合適的HIVDNA載體。備選地，可以根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的克隆操作，在獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，將來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子摻入載體中。后者是直接克隆策略。適合于直接克隆策略的是兩種不同的限制性位點(diǎn)，其被用來(lái)便于擴(kuò)增子在合適的方向上的連接。可以保持重組病毒儲(chǔ)備用于將來(lái)的分析，例如，生存力測(cè)試。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞可以選自T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨嗟細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、郎格罕氏細(xì)胞、造血千細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞(PBMC)或前體細(xì)胞、人類T淋巴樣千細(xì)胞系、MT4、MT2、CEM和PM-1細(xì)胞。對(duì)于HIV序列的同源重組，適合的宿主細(xì)胞包括MT4和PM-1。MT4是含有CXCR4共同受體的CD4+T細(xì)胞系。PM-1細(xì)胞系表達(dá)CXCR4和CCR5共同受體。所有上述細(xì)胞能夠在HIVDNA載體與來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子重組時(shí)產(chǎn)生新的傳染性病毒顆粒。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞通常被維持在富含蛋白質(zhì)的介質(zhì)中，例如補(bǔ)充有10%的胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素(例如青霉素和鏈霉素)的RPMI1640中。有趣地，在HIV感染之前，可以用植物凝集素對(duì)PBMC細(xì)胞進(jìn)行若干天的刺激，并將其維持在R-20培養(yǎng)基中(補(bǔ)充有20%胎牛血清的RPMI1640)、L-谷氨酰胺、HEPES緩沖液、重組人類白細(xì)胞介素-2;青霉素和鏈霉素中。生長(zhǎng)竟?fàn)幏治鋈缓髮⒅亟M標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的病毒以不同的比例混合在一起，例如，0/100,25〃5,50/50,75/25，100/0。其它比例可以是0/100、20/80、40/60、60/40、80/20、100/0。如果測(cè)試超過(guò)兩種病毒，例如，三種，比例可以是例如0/0/100、0/33/66、33/66/0。混合的病毒樣品被用于感染細(xì)胞，所述細(xì)胞懸浮在有或沒有抗病毒藥物或任何其它環(huán)境成分中，如本文所描述的。因而，通常懸浮在介質(zhì)中的細(xì)胞以傳染劑量的重組標(biāo)簽化的和/或未標(biāo)簽化的病毒來(lái)接種。測(cè)定病毒滴度(表示為感染復(fù)數(shù)，MOI)并調(diào)整到合適的范圍，優(yōu)選在0.0001和0.01之間，更優(yōu)選約0.001傳染性病毒單位/細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，包含標(biāo)簽化的HIVDNA栽體和來(lái)自第一目標(biāo)HIV病毒的第一目標(biāo)擴(kuò)增子的標(biāo)簽化的重組傳染性病毒與包含未標(biāo)簽化的HIVDNA載體和來(lái)自第二目標(biāo)HIV病毒的第二目標(biāo)擴(kuò)增子的未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒混合。這些病毒在給定的環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)物中混合，通過(guò)定量擴(kuò)增來(lái)測(cè)定在所述環(huán)境中所述標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的重組病毒的復(fù)制能力。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育、洗滌、重懸浮、重孵育，所有這些都按照需要來(lái)進(jìn)行。在不同的時(shí)間收獲上清液，例如在第1、4、7、10和14天。從某一天開始，例如，開始孵育后的笫四天，培養(yǎng)物被傳代，在孵育、洗滌、重懸浮和重孵育之后，在特定的時(shí)點(diǎn)，例如第1、4、7、10、14或任何其它的一天從培養(yǎng)物上清液提取病毒RNA。病毒RNA提取可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的的幾種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)使用QiagenRNA試劑盒。備選地，將細(xì)胞與重組傳染性病毒一起培養(yǎng)，在特定的時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞，進(jìn)行基因組DNA提取?；蚪MDNA提取可以^f艮據(jù)本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)使用來(lái)自Invitek試劑盒InvisorbDNA細(xì)胞HTS96試劑盒/V用于純化基因組DNA。在群體中標(biāo)簽化的重組病毒對(duì)比未標(biāo)簽化的重組病毒的比例通過(guò)定量擴(kuò)增來(lái)測(cè)定。定量擴(kuò)增定量擴(kuò)增提供了用于對(duì)將要測(cè)定復(fù)制能力的病毒進(jìn)行直接定量所需的數(shù)據(jù)。在定量擴(kuò)增期間，從如上所迷的細(xì)胞培養(yǎng)物或上清液提取的、重組病毒的標(biāo)簽化的和相應(yīng)的未標(biāo)簽化的區(qū)域被擴(kuò)增和檢測(cè)，這通常同時(shí)進(jìn)行。任選地，持家基因可以用作內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果可以通過(guò)參考外部定量標(biāo)準(zhǔn)以絕對(duì)項(xiàng)表示，即，以原病毒DNA拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)的數(shù)目，或以與樣品中存在的總病毒群體或另一種HIV病毒相比的相3于項(xiàng)。用于核酸序列擴(kuò)增的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。這些包括DNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參見，例如美國(guó)專利No.4,683,202;美國(guó)專利No.4，683，195;美國(guó)專利No,4,000,159;美國(guó)專利No.4，％5，188;美國(guó)專利No.5,176,995)(Saikietal.，1985;Chehabetal.,1987)、鏈交換擴(kuò)增("SDA")(Walkeretal.,1992)、滾環(huán)擴(kuò)增("RCA")(Lizardietal.，1998)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增("LAMP")(Notomietal.,2000;Nagamineetal.,2002)。其它目標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)是由RNA聚合酶介導(dǎo)的，例如，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增("TMA")(Jonasetal.,1993)、自持的序列復(fù)制("3SR，，)(Fahyetal.,1991)和基于核酸序列復(fù)制的擴(kuò)增("NASBA，，)(Compton,1991)。通過(guò)PCR、RT-PCR、SDA、RCA和LAMP產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物("擴(kuò)增子")由DNA組成；而RNA擴(kuò)增子由TMA、3SR和NASBA產(chǎn)生。一種已知的定量擴(kuò)增技術(shù)是實(shí)時(shí)PCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在專利NO.US4683195和US4683202中描述。本文使用的術(shù)語(yǔ)"實(shí)時(shí)PCR"是指從PCR分析發(fā)射的信號(hào)在反應(yīng)期間被監(jiān)測(cè)，作為每個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)期間擴(kuò)增子產(chǎn)量的指標(biāo)，即，"實(shí)時(shí)"地，這與常規(guī)的PCR不同，在常規(guī)PCR中分析信號(hào)在PCR反應(yīng)的結(jié)束時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)PCR—般基于對(duì)焚光報(bào)告物的檢測(cè)和定量。信號(hào)增加與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過(guò)記錄每個(gè)循環(huán)中熒光發(fā)射的數(shù)量，有可能在指數(shù)期監(jiān)視PCR反應(yīng)，其中在PCR產(chǎn)物數(shù)量方面的第一次顯著提高與目標(biāo)模板的初始數(shù)量相關(guān)。對(duì)于"實(shí)時(shí)PCR"的一般性說(shuō)明，參見Deheeetal.J.Virol.Meth.102:37-51(2002);和Aldeaetal.J.Clin.Microbiol.40:1060-1062(2002)(對(duì)于"LightCycler,，，,其中實(shí)時(shí)的、動(dòng)力學(xué)的定量容許測(cè)量在PCR的log線性階段期間進(jìn)行)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，被定量擴(kuò)增的HIV標(biāo)簽化重組病毒的序列包含在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，被定量擴(kuò)增的HIV未標(biāo)簽化的重組病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV標(biāo)簽化重組病毒的所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變，即，它缺少所有選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因的一個(gè)或多個(gè)沉默突變。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，被定量擴(kuò)增的HIV標(biāo)簽化重組病毒的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，被定量擴(kuò)增的HIV未標(biāo)簽化的重組病毒的序列不包含在前一句子中涉及的HIV標(biāo)簽化重組病毒的一個(gè)或多個(gè)沉默突變，即，它缺少所有在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區(qū)中的所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，特異于標(biāo)簽化的和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的定量擴(kuò)增的正向和反向引物包括SEQIDNO:5-12。SEQIDNO:5是正向引物，其延伸標(biāo)簽化的包膜基因，即，包含一個(gè)或多個(gè)沉默突變的包膜基因。SEQIDNO:6是反向引物，其延伸標(biāo)簽化的包膜基因和WT包膜基因。SEQIDNO:7是正向引物，其延伸WT包膜基因。SEQIDNO:8-9是正向和反向引物，其延伸持家基因或?qū)φ栈?。SEQIDNO:IO是正向引物，其延伸標(biāo)簽化的整合酶編碼序列，即，包含一個(gè)或多個(gè)沉默突變的整合酶編碼序列，以及WT整合酶編碼序列。SEQIDNO:ll是反向引物，其延伸標(biāo)簽化的整合酶編碼序列。SEQIDNO:12是反向引物，其延伸WT整合酶編碼序列。其它的序列可以附加到正向引物上以容許實(shí)時(shí)PCR監(jiān)視。此類序列可以包括但不限于，用于LUXTM檢測(cè)的發(fā)熒光探針、用于zymogene檢測(cè)的反義DNAzyme序列、以及Scorpion探針序列。任選地，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的附加的序列可以附著于反向引物。表2:特異于標(biāo)簽化和未標(biāo)簽化重組傳染性病毒的定量擴(kuò)增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，特異于標(biāo)簽化和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的定量擴(kuò)增的正向和反向引物包括SEQIDNO:19-20，和24-25。SEQIDNO:19是正向引物，其延伸標(biāo)簽化的包膜基因和WT包膜基因。SEQIDNO:20是反向引物，其延伸標(biāo)簽化的包膜基因，和WT包膜基因。SEQIDNO:24是正向引物，其延伸人類基因組RPLPO基因。SEQIDNO:25是反向引物，其延伸人類基因組RPLPO基因。表3:特異于標(biāo)簽化和未標(biāo)簽化重組傳染性病毒的定量擴(kuò)增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>上文描述的引物和它們的同源物是被要求保護(hù)的。這些引物選自SEQIDNO:5-12、19-20和24-25,或如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法如FASTA和BLAST確定的具有至少80%的同源性、優(yōu)選的90%的同源性、更優(yōu)選的95%的同源性。在此列出的引物序列任選地可以被標(biāo)記。適當(dāng)?shù)?，可以使用熒光、發(fā)光或吸光度來(lái)檢測(cè)這種標(biāo)記。此外，位于在此給出的序列上游或下游50個(gè)核苷酸(nt)的區(qū)域內(nèi)的引物構(gòu)成了本發(fā)明的部分。特別地，引物可以位于在此給出的序列的上游或下游20nt的區(qū)域內(nèi)，并且也構(gòu)成了本發(fā)明的部分。并且，包含在此處描迷的任一引物中存在的至少8個(gè)連續(xù)堿基的引物構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施方式。感興趣地，引物包含在此處描述的任一引物中存在的至少12個(gè)連續(xù)堿基。在本發(fā)明的一個(gè)方面，引物可以含有接頭區(qū)域用于克隆。任選的，引物的接頭區(qū)域可以含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)是獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。做為選擇，引物可以與目標(biāo)區(qū)部分地退火。實(shí)時(shí)PCR的方法使用熒光引物或探針，例如LUX發(fā)熒光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探針、T叫Man⑧探針、分子信標(biāo)、scorpions或任何其它FRET探針。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，定量擴(kuò)增采用能夠裂解熒光探針的MNAzymes。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，定量擴(kuò)增可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈交換擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增進(jìn)行，采用LUXTM發(fā)熒光引物、TaqMan⑧探針、分子信標(biāo)、scorpions、DNAzymes、MNAzymes或任何其它與FRET探針聯(lián)結(jié)的引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述定量擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，并采用MNAzymes,即，采用在MNAzymes附近的引物和尋皮MNAzymes裂解的探針。LUXTM引物是用單個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸。其一般長(zhǎng)度為20-30個(gè)堿基，它們被設(shè)計(jì)為具有靠近發(fā)夾結(jié)構(gòu)中3'末端的熒光基團(tuán)。這種結(jié)構(gòu)內(nèi)在地使得具有焚光猝滅能力；從而不需要獨(dú)立的淬滅部分。當(dāng)引物變?yōu)閾饺腚p鏈PCR產(chǎn)物時(shí)，熒光基團(tuán)被去淬滅，引起熒光信號(hào)的顯著提高。TaqMan⑧探針(Heidetal.,1996)利用Taq聚合酶的發(fā)焚光5'核酸外切酶活性來(lái)測(cè)量cDNA樣品中目標(biāo)序列的數(shù)量。TaqMan⑧探針是寡核苷酸，其含有通常在5'堿基處或附近的熒光染料以及通常在3'堿基處或附近的淬滅部分。淬滅劑部分可以是染料，例如TAMRA,或者可以是非熒光分子，例如4-(4-二甲基氨基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)。當(dāng)被照射時(shí)，被激發(fā)的熒光染料將能量轉(zhuǎn)移到附近的淬滅染料分子而不是發(fā)熒光(這稱為FRET-F6rster或熒光共振能量傳遞)。因而，報(bào)告物和淬滅劑的緊密接近防止任何熒光的發(fā)射，此時(shí)探針是完整的。TaqMan探針被設(shè)計(jì)來(lái)與PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域退火。當(dāng)聚合酶復(fù)制結(jié)合了TaqMan⑧探針的模板時(shí)，它的5'核酸外切酶活性裂解探針。這結(jié)束了淬滅劑的活性(沒有FRET),報(bào)告物染料開始發(fā)射熒光，其在每個(gè)循環(huán)與探針裂解的速率成比例地提高。PCR產(chǎn)物的積累通過(guò)監(jiān)視報(bào)告染料的熒光方面的提高來(lái)檢測(cè)(注意到引物未被標(biāo)記)。TaqMan⑧分析使用了通用的熱循環(huán)參數(shù)和PCR反應(yīng)條件。由于裂解僅當(dāng)探針與目標(biāo)雜交時(shí)發(fā)生，檢測(cè)的熒光來(lái)源于特異性擴(kuò)增。雜交和裂解的過(guò)程不受產(chǎn)物的指數(shù)性積累的影響。發(fā)熒光探針的一種特殊的需求是在5'末端不能是G。鄰近于報(bào)告物染料的"G"甚至在裂解之后也淬滅報(bào)告物熒光。分子信標(biāo)是用于鑒定細(xì)胞內(nèi)存在的特定核苷酸序列的探針(Tyagietal.，(1998)NatureBiotechnology16:49-53)。分子信標(biāo)可以僅由核酸組成，例如DNA或RNA,或者它可以由肽核酸(PNA)結(jié)合物組成。分子信標(biāo)與特定核苷酸序列的結(jié)合允許體內(nèi)或體外地鑒定那些序列的存在。分子信標(biāo)包括結(jié)合物(例如，一種結(jié)構(gòu)，例如量子點(diǎn)標(biāo)簽化的珠子)、探針、熒光基團(tuán)和淬滅部分。探針是包含莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核普酸，其中親水性附著基團(tuán)附著于單鏈寡核苷酸的一個(gè)末端，淬滅部分附著于單鏈寡核苷酸的另一個(gè)末端。熒光基團(tuán)可以是任何熒光有^f幾染泮?；騿瘟孔狱c(diǎn)，從而它的發(fā)射不與量子點(diǎn)標(biāo)簽化的珠子的發(fā)射重疊。淬滅部分理想地淬滅焚光基團(tuán)的發(fā)光。淬滅焚光基團(tuán)的發(fā)光的任何適合的淬滅部分可以用于以上描述的結(jié)合物中。蝎子引物是含有與探針共價(jià)連接的PCR引物的雙功能分子。探針中的熒光基團(tuán)與降低熒光的淬滅劑相互作用。在PCR反應(yīng)期間，熒光基團(tuán)和淬滅劑分離，其引起來(lái)自反應(yīng)管的光輸出的提高。在Whitcombe，D.，TheakerJ.，Guy，S.P,，Brown,T.，Little,S.(1999)-DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescence,NatureBiotech17，804-807中更完整地描述了蝎子引物，其由專利EP1088102保護(hù)。DNAzyme(Santoro，S.andJoyce,G.,1997,AgeneralpurposeRNAcleavingDNAenzyme.ProcNatlAcadSciUSA.94:4262-4266.ReviewedEmilsson,G.M.andBreaker,R.R.,2002,Deoxyribozymes:newactivitiesandnewapplications.Cell.Mol.LifeSci.59，596-607)是催化活性的寡核苷酸，其可以，例如，在特定的磷酸二酯鍵處裂解核酸底物。DNAzyme由側(cè)翼是兩個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域組成。其觀察S'J標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則，必須與它的底物雜交來(lái)適當(dāng)?shù)卮呋呀?。DNAzymes可以與體外擴(kuò)增技術(shù)組合使用，例如PCR，作為產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的手段，因而容許擴(kuò)增的核酸目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(US6,140,055)DNAzymes通過(guò)使用具有5'tag的引物導(dǎo)入擴(kuò)增子，所述引物是無(wú)活性的、DNAzymes的反義序列。當(dāng)這些序列案子體外擴(kuò)增期間被拷貝時(shí)，催化活性的正義DNAzyme序列與目標(biāo)序列一起被共同擴(kuò)增。這產(chǎn)生了起到DNAzymes的作用、能夠裂解報(bào)告物底物的擴(kuò)增子。重要的試劑包括與無(wú)活性的、DNAzyme的反義鏈結(jié)合的一種基因特異性引物；和第二種基因特異性引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，5'和3'引物特異于目標(biāo)擴(kuò)增子。除了DNAzyme之外，還存在著DNAzyme特異性熒光底物。這種通用的探針由短的核酸片段組成，所迷核酸片段在一個(gè)末端被焚光基團(tuán)標(biāo)簽化，在另一個(gè)末端為BlackHoleQuencherTM染料(BHQ)。DNAzyme底物最終充當(dāng)DNA拷貝數(shù)的度量。每一輪擴(kuò)增，活性DNAzymes的數(shù)目與DNA拷貝數(shù)成正比地提高。DNAzyme活性方面的指數(shù)性提高引起熒光的相應(yīng)增加，容許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法從多個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA開始，因而需要較少的循環(huán)來(lái)達(dá)到檢測(cè)閾值水平，通常由"Ct"值表示。在DNAzyme特異性熒光底物中存在的熒光基團(tuán)包括FAM、CALFluorOrange、JOE和TAMRA染料，等等。它們?cè)谒鼈兊募ぐl(fā)狀態(tài)強(qiáng)烈地發(fā)射，但在它們的淬滅狀態(tài)僅樣吏弱地發(fā)射。MNAzymes(Johnson&JohnsonResearchPtyLimited,Australia的專利申請(qǐng)PCT/AU2006/001473)是基于DNAzymes的催化核酸。MNAzymes由兩種或更多種寡核普酸序列(例如，partzymes)構(gòu)成，其是被定量擴(kuò)增的標(biāo)簽化的或相應(yīng)的未標(biāo)簽化的區(qū)域)，形成能夠催化性修飾底物如報(bào)告物底物的活性核酸酶。包含partzymeA和partzymeB的示例性MNAzyme在附圖12中描繪。參考附圖12，DNApartzymesA和B各自與目標(biāo)結(jié)合，即，MNAzyme組裝輔助物分子(例如，通過(guò)與堿基配對(duì)目標(biāo)的Watson-Crick堿基配對(duì))。當(dāng)partzymesA和B在目標(biāo)上相互鄰近地雜交時(shí)，僅形成MNAzyme。MNAzyme的底物臂與報(bào)告物底物結(jié)合，報(bào)告物底物的裂解由MNAzyme的催化核心催化，所述催化核心通過(guò)partzymesA和B的催化結(jié)構(gòu)域的相互作用形成。MNAzyme裂解熒光基團(tuán)和淬滅劑染料配對(duì)之間的底物，因而產(chǎn)生信號(hào)。DNA/RNA嵌合體(報(bào)告物底物)的裂解在附圖中舉例說(shuō)明。術(shù)語(yǔ)"MNAzyme"也稱為"多組件核酸酶"。MNAzyme也可以包含穩(wěn)定化寡核苷酸，其通過(guò)與組裝輔助物或底物相互作用提供了MNAzyme的穩(wěn)定性。明顯^>,為了可檢測(cè)的催化活性，MNAzyme的形成需要至少是partzyme組件與目標(biāo)(或組裝輔助物)的組裝，以及報(bào)告物底物的結(jié)合，任何這些組件的缺乏將引起催化活性的缺失?？梢酝ㄟ^(guò)大量方法的任一種來(lái)標(biāo)記與MNAzymes使用的報(bào)告物底物，所述方法包括，例如熒光基團(tuán)(有或沒有一種或多種其它組件，例如淬滅劑)、放射性標(biāo)記、用生物素標(biāo)記(例如，生物素化)或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。催化核酸的報(bào)告物底物也可以包括蛋白質(zhì)或核酸酶，例如，共價(jià)地附著到它們的末端。與MNAzymes使用的報(bào)告物底物可以是一般的報(bào)告物底物系統(tǒng)，通過(guò)容許容易的設(shè)計(jì)改變來(lái)創(chuàng)建識(shí)別不同目標(biāo)的新的MNAzymes,其容許快速的分析開發(fā)。partzymes的底物臂部分和催化核心部分可以保持不變，僅有為新的目標(biāo)所需的一個(gè)或多個(gè)partzymes的感受器臂部分的改變。提供一般底物序列，因而相同的底物可以被包括入多種不同目才示的分析中。進(jìn)一步地，相同的底物可以被包括入本文的各種實(shí)施方式的方法中，包括其中底物在溶液中游離的、或拴系在或附著于支持物的分析。一系列一般底物可以用于容許多個(gè)目標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)的多路反應(yīng)。使用一般底物的MNAzyme策略提供了相對(duì)于一些技術(shù)例如TaqMan⑧或Beacons的主要優(yōu)點(diǎn)，這些技術(shù)需要設(shè)計(jì)和使用對(duì)每個(gè)新的目標(biāo)特異的探針。如以下更詳細(xì)描述地，MNAzymes在能夠利用通用或一般報(bào)告物底物的某些實(shí)施方式中具有有益的性質(zhì)。這種底物以當(dāng)前優(yōu)選的結(jié)構(gòu)在附圖12中示出，其中報(bào)告物底物包含可檢測(cè)部分和淬滅劑部分。淬滅劑部分適合于減少或消除來(lái)自底物的可檢測(cè)部分的可檢測(cè)信號(hào)，直到底物被MNAzyme裂解。例如，淬滅劑部分可以包含"BlackHoleQuencher1"(BHQ1)或"BlackHoleQuencher2"(BHQ2)。因而，MNAzyme在可檢測(cè)部分和淬滅劑部分之間裂解報(bào)告物底物，容許兩個(gè)部分在溶液中分離，從而隨著淬滅劑部分遠(yuǎn)離于可檢測(cè)部分、或有效地從可檢測(cè)部分的局部環(huán)境中除去，容許可檢測(cè)信號(hào)出現(xiàn)或提高。通過(guò)設(shè)計(jì)MNAzyme的組件partzymes,得以使用一般或通用報(bào)告物底物。通過(guò)僅改變partzymes的感受器臂部分，但是通過(guò)裂解不變的底物臂，可以設(shè)計(jì)出特異于多種目標(biāo)的每一種的大量MNAzymes,所有這些都利用通用報(bào)告物底物用于檢測(cè)。技術(shù)人員將理解，就消除針對(duì)每個(gè)目標(biāo)定制的或獨(dú)特的底物需要而言它所提供的益處。每個(gè)新的目標(biāo)僅需要一個(gè)或多個(gè)感受器臂部分的一個(gè)或多個(gè)改變；底物臂部分和催化核心部分可以保持恒定。因而，使用MNAzyme,單個(gè)報(bào)告物底物可以用于單個(gè)目標(biāo)，使用改變的MNAzymes，可以用于一系列分析中的多個(gè)目標(biāo)。多種報(bào)告物底物容許多路化，來(lái)在單個(gè)分析中使用多種MNAzymes檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，一種MNAzyme針對(duì)一個(gè)目標(biāo)。利用MNAzymes的這種多路方法在溶液中或附著在支持系統(tǒng)上容易地實(shí)現(xiàn)。本文包括如本文所述的，在涉及將一種或多種報(bào)告物底物、或MNAzymepartzymes或組裝輔助物、或其它的酶活性連接到支持物的系統(tǒng)中，可以實(shí)現(xiàn)多路的分析。可以通過(guò)提高可檢測(cè)效果的MNAzyme來(lái)修飾底物。在檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)MNAzyme的報(bào)告物底物修飾可以包括，例如，裂解、連接、外啉金屬取代、碳-碳鍵、酯鍵或酰胺鍵的形成。作為通過(guò)MNAzyme的報(bào)告物底物修飾的結(jié)果，產(chǎn)生了可檢測(cè)的效果，由此該效果的量是想要測(cè)量的目標(biāo)的數(shù)量的指示?？蓹z測(cè)效果可以通過(guò)多種方法來(lái)測(cè)量，包括熒光光語(yǔ)、表面胞質(zhì)團(tuán)共振、質(zhì)譜法、NMR、電子自旋共振、偏振熒光光"i普、園二色性、免疫分析、層析、輻射測(cè)量、光度測(cè)量、閃爍照相術(shù)、電子方法、UV、可見光或紅外光語(yǔ)、酶學(xué)方法或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)告物底物是SEQIDNO:17-18,它們各自用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。具有SEQIDNO:17的底物在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-6-FB。這種底物SEQIDNO:17對(duì)于跟蹤未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用492nm的激發(fā)在516nm處監(jiān)測(cè)這種底物的裂解。具有SEQIDNO:18的底物在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SEQIDNO:18對(duì)于跟蹤標(biāo)簽化的HXB2D擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用535nm的激發(fā)在555nm處監(jiān)測(cè)這種底物的裂解。在表4中，列出了這些底物。小寫字母的堿基代表RNA,大寫字母的堿基代表DNA。表4:報(bào)告物底物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，報(bào)告物底物是SEQIDNO:17-18和23，三種不同的報(bào)告物底物，它們每一種用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。具有SEQIDNO:17的底物在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-6-FB。這種底物SEQIDNO:17對(duì)于跟蹤未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用492nm的激發(fā)在516nm處監(jiān)測(cè)這種底物的裂解。具有SEQIDNO:18的底物在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SEQIDNO:18對(duì)于跟蹤標(biāo)簽化的HXB2D擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用535nm的激發(fā)在555nm處監(jiān)測(cè)這種底物的裂解。具有SEQIDNO:23的底物在5'末端用Quasar670部分、以及在3'末端用BHQ2部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-3-Q6B2。做為選擇，具有SEQIDNO:23的底物可以在5'末端用TAMRA部分、以及在3'末端用BHQ2部分來(lái)末端標(biāo)記。這種底物SEQIDNO:23對(duì)于3艮蹤RPLPO擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用635nm的激發(fā)在665nm處監(jiān)測(cè)這種底物的裂解。這三種底物的序列在表5中列出。小寫字母的堿基代表RNA，大寫字母的堿基代表DNA。表5:報(bào)告物底物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，MNAzyme結(jié)構(gòu)基于包括10:23和8:17DNAzymes的DNAzymes。在各種實(shí)施方式中，MNAzymes包含核糖核苷酸堿基和脫氧核糖核苷酸堿基。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，MNAzyme結(jié)構(gòu)至少部分地基于DNAzyme的結(jié)構(gòu)。在其它一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，MNAzymes至少包含某些脫氧核糖核苷酸堿基或其類似物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，MNAzyme的催化核心包含一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核普酸石咸基或其類似物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸堿基或其類似物被包括在底物的催化作用中。在其它一些實(shí)施方式中，在催化核心內(nèi)的至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸堿基或它的類似物改善了催化活性。在又另外的實(shí)施方式中，相對(duì)于沒有存在所述脫氧核糖核苷酸堿基的可比較MNAzyme而言，為了以可測(cè)量的速率發(fā)生催化作用，對(duì)于在MNAzyme的催化核心中的至少一個(gè)脫氧核糖核普酸堿基或它的類似物存在著嚴(yán)格的要求。MNAzymes可以含有一個(gè)或多個(gè)取代，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的類似物、衍生物、修飾或改變的堿基、核糖核芬酸、糖類或磷酸鹽主干的改變、各種刪除、插入、取代、二重化或其它修飾或這些的任何組合。這樣的修飾、取代、刪除、插入等等可以在感受器和/或底物臂中和/或在催化核心部分中進(jìn)行，從而分子保持催化活性。對(duì)結(jié)合底物或組裝輔助物的臂的取代或修飾可以是良好耐受性的，實(shí)際上是容許分子針對(duì)不同的底物/組裝輔助物的修整的基礎(chǔ)。例如，感受器臂的修飾將容許對(duì)不同的組裝輔助物的適應(yīng)，而底物臂的修飾將容許對(duì)不同底物的適應(yīng)。熟練的技術(shù)人員將理解，MNAzymes包括脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸，或者甚至兩者。包含至少一個(gè)、以及優(yōu)選的所有的脫氧核糖核苷酸組件寡核苷酸的那些MNAzymes是當(dāng)前優(yōu)選的。還優(yōu)選的是，在MNAzyme的催化核心內(nèi)包含至少一個(gè)脫氧核糖核普酸;咸基、或它的類似物的那些MNAzyme。再更優(yōu)選的是其中這樣的名成基是催化活性所需的那些實(shí)施方式。MNAzyme結(jié)構(gòu)的基本實(shí)例在附圖12中描繪。顯示的結(jié)構(gòu)包含partzymeA和partzymeB,其具有與MNAzyme組裝輔助物分子配對(duì)的堿基，在此簡(jiǎn)略顯示為目標(biāo)。通過(guò)與目標(biāo)相互作用PartzymesA和B容許催化核心變得緊密接近從而形成。MNAzyme的底物臂相互作用于或堿基配對(duì)于底物，在此稱為報(bào)告物底物。因而，MNAzyme自我組裝，這種過(guò)程通過(guò)MNAzyme組裝輔助物分子目標(biāo)的存在被便利化。在不存在目標(biāo)時(shí)，將不形成MNAzyme。底物的修飾(在這種情況中，裂解)4皮在由直立箭頭指出的底物內(nèi)的MNAzyme裂解位點(diǎn)處的MNAzyme的催化核心所催化。在本發(fā)明的這個(gè)特定實(shí)施方式中的底物包含具有可檢測(cè)信號(hào)的可檢測(cè)部分，例如熒光基團(tuán)F，以及通過(guò)淬滅劑Q的作用對(duì)可檢測(cè)信號(hào)F具有淬滅效果的淬滅劑部分。在MNAzyme裂解位點(diǎn)處裂解時(shí)，存在著可檢測(cè)信號(hào)的大幅增加，在此處是熒光，其是容易檢測(cè)和定量的。更具體地，附圖12中顯示partzymeA和partzymeB各自包含底物臂部分、催化核心部分和感受器臂部分。在存在目標(biāo)的情況下，partzymeA和partzymeB的感受器臂部分可以開始與目標(biāo)的互補(bǔ)部分，例如DNA或RNA序列雜交以及石成基配對(duì)。在以這種方式接觸目標(biāo)時(shí)，MNAzyme自我組裝形成催化核心，其可以修飾被底物臂結(jié)合的底物。優(yōu)選地，MNAzyme的存在通過(guò)它的催化活性的檢出或測(cè)出來(lái)^r測(cè)。這樣組裝的MNAzyme的底物臂可以嚙合底物，例如，附圖12中顯示的報(bào)告物底物，通過(guò)底物臂和底物上的互補(bǔ)序列的相互作用。一旦底物這樣嚙合與底物臂，催化核心可以促進(jìn)底物的修飾(例如，裂解)，其隨后可以被直接地或間接地測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了被設(shè)計(jì)以檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子的partzymes，所述目標(biāo)擴(kuò)增子即從未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT擴(kuò)增的那些，以及從HXB2D標(biāo)簽化的序列擴(kuò)增的那些。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的-成基與目標(biāo)雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列的3'末端的P代表3'磷酸基團(tuán)。表6:被設(shè)計(jì)以檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子的partzymes:即擴(kuò)增的未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT，以及擴(kuò)增的HXB2D標(biāo)簽化的序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了被設(shè)計(jì)來(lái)檢測(cè)三種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子的partzymes，即，從未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT序列擴(kuò)增的那些、從HXB2D標(biāo)簽化的序列擴(kuò)增的那些、以及從RPLPO基因擴(kuò)增的那些。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標(biāo)雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列的3'末端的P代表3'磷酸基團(tuán)。表7:被設(shè)計(jì)以檢測(cè)三種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子的partzymes:即擴(kuò)增的未標(biāo)簽化的HXB2DWT序列、擴(kuò)增的HXB2D標(biāo)簽化的序列、以及擴(kuò)增的RPLPO序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>多種MNAzymes在本發(fā)明中是有用的，因?yàn)樗鼈內(nèi)菰S檢測(cè)相差少至一個(gè)核苷酸的相關(guān)的序列。類似地，獨(dú)特的報(bào)告物底物是檢測(cè)幾種目標(biāo)的每一種所需的。在某些情況下，為了使該方法多路化，需要為每個(gè)報(bào)告物底物使用不同的或獨(dú)特的可檢領(lǐng)'H言號(hào)來(lái)便于該方法的設(shè)計(jì)。根據(jù)用于擴(kuò)增核酸(即，DNA或RNA)的操作來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核酸，包括本發(fā)明的重組病毒的標(biāo)簽化的或相應(yīng)的未標(biāo)簽化的區(qū)域。優(yōu)選地，使用體外擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法。在擴(kuò)增期間產(chǎn)生的擴(kuò)增子充當(dāng)MNAzyme的目標(biāo)，由此，MNAzyme活性是目標(biāo)存在的指示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這種監(jiān)測(cè)可以在允許擴(kuò)增和MNAzyme組裝和催化活性的條件下在單個(gè)容器中進(jìn)行，或者，通過(guò)在最后時(shí)或擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中除去樣品，MNAzyme分析可以在擴(kuò)增之后、或在整個(gè)擴(kuò)增中的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。還應(yīng)當(dāng)理解，組合目標(biāo)擴(kuò)增與催化核酸活性的方法或方案可能需要特定的反應(yīng)條件。優(yōu)選地，反應(yīng)條件適合于聚合酶活性(用于擴(kuò)增)以及底物的催化性核酸修飾(用于檢測(cè))。對(duì)于DNAzymes已經(jīng)描迷了例如在PCR期間用于在高溫下測(cè)定同時(shí)的催化活性和聚合酶活性的條件的方案(Impeyetal.,2000)。在這個(gè)文章中展現(xiàn)了包括臂長(zhǎng)度、緩沖液、溫度、二價(jià)離子濃度和添加劑作用的因素的影響。DNA酶適合于與體外擴(kuò)增策略一起使用。例如，通過(guò)在擴(kuò)增期間本領(lǐng)域高溫，它們不被不可逆地變性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)一種方法進(jìn)行定量擴(kuò)增，用于檢測(cè)至少一種目標(biāo)或組裝輔助物的存在，其中目標(biāo)或組裝輔助物是如上所述的重組病毒的一個(gè)標(biāo)簽化的或相應(yīng)的未標(biāo)簽化的區(qū)域，所述方法包括a)提供兩種或更多種寡核普酸組件，其中至少第一寡核苷酸組件和第二寡核苷酸組件在存在至少第一組裝輔助物的情況下自我組裝來(lái)形成至少第一催化活性多組件核酸酶(MNAzyme);b)提供至少第一報(bào)告物底物，所述笫一底物能夠被所述第一MNAzyme修飾，其中通過(guò)所述MNAzyme的所述底物的所述修飾提供了可檢測(cè)效果；c)在允許以下的條件下，使所述兩種或更多種寡核芬酸組件與可能含有所述至少第一組裝輔助物的樣品接觸(1)所述至少第一MNAzyme的自我組裝，和(2)所述至少第一MNAzyme的催化活性；以及d);險(xiǎn)測(cè)所述可4企測(cè)的效果。檢測(cè)至少一個(gè)目標(biāo)或組裝輔助物的存在的方法可以進(jìn)一步包括提供至少第三和第四寡核苷酸組件，其中所述至少第三和至少第四寡核苷酸組件能夠在存在至少一個(gè)其它的目標(biāo)或組裝輔助物的情況下自我組裝來(lái)形成至少一個(gè)其它的催化活性MNAzyme,其中至少一個(gè)其它的報(bào)告物底物存在于所述樣品中，所述其它的報(bào)告物底物能夠僅被所述其它的MNAzyme修飾，其中所述修飾提供了所述其它的可檢測(cè)效果。病毒復(fù)制能力的測(cè)定獲得對(duì)于標(biāo)簽化和/或未標(biāo)簽化的重組病毒的隨時(shí)間的閾值循環(huán)(Ct)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并標(biāo)繪在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，一般地從對(duì)照或持家基因獲得，在給定病毒群體中或在給定環(huán)境下的給定標(biāo)簽化物種的比例被顯示和計(jì)算。本發(fā)明的方案和產(chǎn)物可以用于各種診斷的、臨床的、毒理學(xué)的研究和法醫(yī)目的，包括藥物發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)患者治療、藥物效力測(cè)定以及患者管理。當(dāng)前的方法可以與其它分析一起使用。結(jié)果可以在計(jì)算機(jī)模型和數(shù)據(jù)庫(kù)中實(shí)施。另外，本發(fā)明的方案和產(chǎn)品還允許監(jiān)視抗HIV化合物對(duì)病毒適應(yīng)度的影響。病毒適應(yīng)度分析可以用作高通量篩選分析或包含高通量篩選分析的部分，所述分析中評(píng)估多種HIV毒林和環(huán)境組合。來(lái)自病毒適應(yīng)度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以用于開發(fā)在存在其它HIV毒株和環(huán)境因素的情況下復(fù)制能力水平的數(shù)據(jù)庫(kù)。本發(fā)明還提供了下述試劑盒。所述試劑盒可以用于任何在此描述的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒可以用于測(cè)定在一定環(huán)境中兩種或更多種目標(biāo)HIV病毒的復(fù)制能力。本發(fā)明的試劑盒可以包含標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體、未標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體、引物、和探針。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒包含細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑盒包含選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種引物；和/或根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒栽體，以及任選的未標(biāo)簽化的HIVHXB2D質(zhì)粒栽體。所述試劑盒可以進(jìn)一步包含環(huán)境成分。做為選擇，所述試劑盒還可以包含partzymesSEQIDNO:13-16以及21-22。本發(fā)明的方法的步驟的順序可以改變。技術(shù)人員將能夠確定在步驟順序上什么改變是合適的。根據(jù)在此公開的本發(fā)明的說(shuō)明書和實(shí)踐的考慮，本發(fā)明的其它實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。說(shuō)明書和實(shí)施例意欲被認(rèn)為僅是示例性的，而保護(hù)范圍由權(quán)利要求表明。以下的非限制性實(shí)例幫助闡述本發(fā)明的原則。實(shí)驗(yàn)部分縮寫MNAzyme:多組分核酸酶，或多部分核酸酶；DNAzyme:脫氣核糖核酸酶；RNAzyme:核一唐核酸酶，或核酶；PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；dH20:去離子蒸餾水；F:熒光基團(tuán)；200680051987.3說(shuō)明書第38/56頁(yè)Q:淬滅劑；JOE或6-JOE:6-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基熒光素；FAM或6-FAM:6-羰基焚光素；BHQ1:BlackHoleQuencher1;BHQ2:BlackHoleQuencher2.實(shí)施例1根據(jù)在EP877937、EP1283272或EP1285971中解釋的方案制備重組病毒。具有標(biāo)簽化的包膜基因的病毒是質(zhì)粒載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)和擴(kuò)增子GPRT的重組的結(jié)果。具有標(biāo)簽化整合酶序列的病毒是質(zhì)粒栽體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int)和擴(kuò)增子GPRT的重組的結(jié)果。具有標(biāo)簽化序列的病毒是質(zhì)粒載體pGEM-HIVdelGPRT和擴(kuò)增子GPRT的重組的結(jié)果。擴(kuò)增子GPRT是指由gag基因的最后81個(gè)氨基酸、蛋白酶基因的完整序列、逆轉(zhuǎn)錄酶基因的p51部分組成的序列。GPRT擴(kuò)增子從突變病毒毒株和從WT病毒毒林獲得。來(lái)自突變毒林的GPRT擴(kuò)增子與標(biāo)簽化的質(zhì)粒栽體重組。來(lái)自WT毒抹的GPRT擴(kuò)增子與未標(biāo)簽化的質(zhì)粒栽體重組。來(lái)自突變毒林的GPRT擴(kuò)增子與未標(biāo)簽化質(zhì)粒載體的重組，以及來(lái)自WT毒抹的GPRT擴(kuò)增子與標(biāo)簽化的質(zhì)粒栽體的重組是另一種選擇。質(zhì)粒載體pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env)的序列被SEQIDNO:13包括。質(zhì)粒栽體pGEM-HIVdelGPRTjagged(int)的序列被SEQIDNO:14包括。質(zhì)粒載體pGEM-HIVdelGPRT的序列，即，沒有標(biāo)簽，謬皮SEQIDNO:15包括。以下的包膜基因序列在下劃線的區(qū)域中顯示了已經(jīng)導(dǎo)入沉默突變(以粗體和小寫字母標(biāo)記)的地方標(biāo)簽化的包膜基因(SEQIDN°26):ATGAGAGTGAAGGAGAAATATCAGCACTTGTGGAGATGGGGGTGGAGATGGGGCACCATGCTCCTTGGGATGTTGATGATCTGTAGTGCTACAGAAAAATTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGTATGATACAGAGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAGTAGTATTGGTAAATGTGACAG43AAAATTTTAACATGTGGAAAAATGACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGTTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTGTTAGTTTAAAGTGCACTGATTTGAAGAATGATACTAATACCAATAGTAGTAGCGGGAGAATGATAATGGAGAAAGGAGAGATAAAAAACTGCTCTTTCAATATCAGCACAAGCATAAGAGGTAAGGTGCAGAAAGAATATGCATTTTTTTATAAACTTGATATAACACCTCAGTCA丁TACACAGGCCTGTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTAAAATGTAATAATAAGACGTTCAATGGAACAGGACCATGTACAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCAGTAGTATCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGATCTGTCAATTTCACGGACAATGCTAAAACCATAATAGTACAGCTGAACACATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGAATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACTTTAAAACAGATAGCTAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATAATCTTTAAGCAATCCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGCACAGTTTTAATTGTGGAGGTTAA丁AGTAC丁TGGAGTACTGAAGGGTCAAATAACACTGAAGGAAGTGACACAATCACCCTCCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGCAGAAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATG丁TCATCAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGAGGtGAcATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTGGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTC丁TCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGAT丁GTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAGTATTGGAGTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAGCTTGCTCAATGCCACAGCCATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTAGTACAAGGAGCTTGTAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTATAA以下的整合酶編碼區(qū)域的序列在下劃線的區(qū)域中顯示了已經(jīng)導(dǎo)入沉默突變(以粗體和小寫字母標(biāo)記)的地方標(biāo)簽化的整合酶編碼序列(SEQIDN。27):TTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGATGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTGCCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAACTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGCAGGAAACAGCATATTTTCTTTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTGCTACGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGAATCAAGCATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACtcacGtAATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAG一旦產(chǎn)生重組病毒，制備含有7.5x106個(gè)MT4-LTR-EGFP細(xì)胞的六個(gè)試管。然后，根據(jù)下式制備8ml重組病毒預(yù)稀釋物(MOI:感染復(fù)數(shù))0.001MOI的最終稀釋物/20=預(yù)稀釋因數(shù)根據(jù)下表8，在下述條件下將重組病毒添加到重懸浮的細(xì)胞中表8<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>病毒和細(xì)胞的混合物在37。C孵育30分鐘，隨后在1200xg旋轉(zhuǎn)孵育10分鐘。除去上清液，用培養(yǎng)基洗涂細(xì)胞。試管在200xg離心5分鐘，團(tuán)粒重懸浮在培養(yǎng)基中。將重懸浮的細(xì)胞添加到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)燒瓶中，并在37。C孵育。仔細(xì)地記錄時(shí)間。每24小時(shí)之后，對(duì)燒瓶記錄致細(xì)胞病變效果和焚光。在O小時(shí)(洗滌步驟后)、15小時(shí)、24小時(shí)、39小時(shí)、48小時(shí)、63小時(shí)、72小時(shí)、和87小時(shí)，收集6ml重懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)物。通過(guò)離心回收上清液和細(xì)胞在1800xgio分鐘之后，收集2xl.5ml上清液。將400plPBS添加到上清液的其余部分中，來(lái)重懸浮細(xì)胞團(tuán)粒。重懸浮的細(xì)胞分到2個(gè)試管中，上清液和細(xì)胞都保持在-80。C。根據(jù)供應(yīng)商提供的方案，使用來(lái)自Invitek(Westburg)的InvisorbSpinBloodMini試劑盒從細(xì)胞團(tuán)提取DNA。用分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度，將DNA濃度調(diào)節(jié)到100ng/pl。樣品然后保存在-20。C。在實(shí)時(shí)分析中測(cè)試2pl保存的樣品。將DNA添加到實(shí)時(shí)PCR混合物中，并置于PCR儀中。實(shí)時(shí)PCR混合物含有野生型引物混合物、通用底物FAM、標(biāo)簽引物混合物、通用底物JOE、對(duì)照引物混合物、通用底物FAMTAM、具有FAMTAM的BDQtaqPCR緩沖液、PCR級(jí)水以及BDQtaqDNA聚合酶混合物。2jalDNA模板與實(shí)時(shí)PCR混合物的混合物置于熱循環(huán)儀(ABI7700)中，采用以下程序<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>產(chǎn)生的Ct(閾值循環(huán))值被用于測(cè)定標(biāo)簽病毒和野生型病毒的復(fù)制能力。在附圖5中，在MT4細(xì)胞中在各種相關(guān)的輸入濃度下HIVHXB2DWT和標(biāo)簽化的HIVHXB2D的病毒生長(zhǎng)的比較。進(jìn)一步的在附圖6中，描繪了來(lái)自使用雙標(biāo)記共感染的MT4細(xì)胞的HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA的檢測(cè)，其中標(biāo)簽化的引物連接到JOE探針，未標(biāo)簽化的野生型引物連接到FAM探針。在附圖7a、7b和7c中，對(duì)用于共感染MT4細(xì)胞的模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴(kuò)增曲線。使用的引物是SEQIDNO:7和6,使用的標(biāo)記是B-FAM針對(duì)HIVHXB2DDNA(附圖7a)D-JOE針對(duì)標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖7b)TAMRA針對(duì)持家基因(GAPD)(附圖7C)在附圖8a、8b和8c中，對(duì)用于共感染MT4細(xì)胞的模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴(kuò)增曲線。使用的引物是SEQIDNO:5和6，使用的標(biāo)記是B-FAM針對(duì)HIVHXB2DDNA(附圖8a)D-JOE針對(duì)標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖8b)TAMRA針對(duì)持家基因(GAPD)(附圖8c)在附圖9a、9b和9c中，對(duì)用于共感染MT4細(xì)胞的模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴(kuò)增曲線。使用的引物是SEQIDNO:8和9,使用的標(biāo)記是B-FAM針對(duì)HIVHXB2DDNA(附圖9a)D-JOE針對(duì)標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖9b)TAMRA針對(duì)持家基因(GAPD)(附圖9c)在附圖10a、10b和10c中，對(duì)用于共感染MT4細(xì)胞的模板HIVHXB2D和標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA顯示了三條擴(kuò)增曲線。使用的引物是SEQIDNO:5、6、7、8和9,使用的標(biāo)記是B-FAM針對(duì)HIVHXB2DDNA(附圖10a)D-JOE針對(duì)標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA(附圖10b)TAMRA針對(duì)持家基因(GAPD)(附圖10c)在附圖11中提供了附圖7-10中顯示的擴(kuò)增的材料的終點(diǎn)凝膠電泳的圖片。圖片清楚地顯示了，已經(jīng)開發(fā)了可行的三聯(lián)分析，其能夠區(qū)分未標(biāo)簽化的WT和標(biāo)簽化的HIVDNA載體模板(即，HIVHXB2Dvs.標(biāo)簽化的HIVHXB2DDNA),甚至是在存在基因組DNA背景的情況下。PCR效力在90。/。和110%之間，數(shù)據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)是>0.99。在l-和n-plex之間的ACt(即，閾值循環(huán)的變異)是《1循環(huán)。實(shí)施例2:MNAzvmes用于經(jīng)由二聯(lián)實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量HIV核酸序列的用途多組分核酸酶(MNAzymes)含(i)特異性識(shí)別并結(jié)合組裝輔助物，例如目標(biāo)核酸的感受器區(qū)域；(ii)催化核心區(qū)域；和(iii)結(jié)合底物的底物區(qū)域。MNAzymes由兩個(gè)(或更多個(gè))獨(dú)立的寡核苷酸"partzymes，，組成，所述"partzymes"僅在存在組裝輔助物的情況下形成活性酶。催化活性的MNAzyme可以在熒光基團(tuán)和淬滅劑染料配對(duì)之間裂解核酸報(bào)告物底物，從而產(chǎn)生焚光信號(hào)。組裝輔助物的實(shí)例包括目標(biāo)被分析物，例如DNA或RNA序列。MNAzymes可以用于容許檢測(cè)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它體外擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的目標(biāo)DNA擴(kuò)增子。進(jìn)一步地，利用MNAzymes的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)容許測(cè)定反應(yīng)中起初存在的目標(biāo)的數(shù)量。開發(fā)了利用兩種MNAzymes來(lái)便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的二聯(lián)PCR分析，用于對(duì)(i)未標(biāo)簽化的HIVHXB2DWT序列和(ii)被修飾以含有四個(gè)沉默突變(標(biāo)簽)的標(biāo)簽化的HIVHXB2D序列進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)和定量。設(shè)計(jì)標(biāo)簽堿基，從而它們不影響復(fù)制能力但是容許標(biāo)簽化的HXB2D序列和未標(biāo)簽化的HXB2DWT序列之間的辨別(附圖14)標(biāo)簽的不存在或存在分別提供了"野生型"序列(WT)或通過(guò)對(duì)感興趣的HIV目標(biāo)病毒擴(kuò)增衍生的那些序列的存在的代替性標(biāo)記物，其位于未標(biāo)簽化或標(biāo)簽化的區(qū)域的上游。2丄用于二聯(lián)PCR分析的Partzvme寡核苷酸多個(gè)目標(biāo)可以在包含多種獨(dú)特的MNAzymes的一個(gè)多路化反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)。每種MNAzyme具有特異于一個(gè)目標(biāo)的感受器臂，和特異于一系列一般報(bào)告物底物的獨(dú)特成員的底物臂，所述報(bào)告物底物每一種用不同的熒光基團(tuán)來(lái)標(biāo)記。在以下的實(shí)施例中，設(shè)計(jì)MNAzymes以檢測(cè)兩種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子，即，從未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT擴(kuò)增的那些，以及從HXB2D標(biāo)簽化的序列擴(kuò)增的那些。針對(duì)每個(gè)目標(biāo)的partzymesAandB的序列在以下從5'到3'列出。在以下序列中，下劃線的石成基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標(biāo)雜交，斜體的堿基與底物雜交。在每個(gè)序列末端的P代表3'磷酸基團(tuán)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>2.2.報(bào)告物底物在這個(gè)實(shí)施例中，使用了兩種不同的報(bào)告物底物，每一種用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。底物的序列以下從5'向3'書寫。在當(dāng)前的實(shí)施例中，第一底物SubBi-6在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB對(duì)于跟蹤未標(biāo)簽化的HXB2DWT擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用492nm的激發(fā)在516nm處監(jiān)測(cè)SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB對(duì)于跟蹤HXB2D標(biāo)簽化的擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用535nm的激發(fā)在555nm處監(jiān)測(cè)SubBi-2-JB的裂解。小寫字母的堿基代表RNA,大寫字母的堿基代表DNA。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>2.3.用于目標(biāo)序列的擴(kuò)增的PCR引物引物5HIV和3HIV被用于野生型和標(biāo)簽化的目標(biāo)HXB2D序列的擴(kuò)增。通過(guò)PCR使用以下列出的寡核苷酸PCR引物產(chǎn)生擴(kuò)增子。表11SEQIDNO:按5'到3'方向列出的引物序列名稱19(正向)ATTAACAAGAGATGGTGGTAA5HIV20(反向)GTGCTACTCCTAATGGTTCAA3HIV2.4.反應(yīng)成分對(duì)目標(biāo)序列的擴(kuò)增和定量在25的總反應(yīng)體積中進(jìn)行對(duì)目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)擴(kuò)增和定量。所有的反應(yīng)在Mx3005PTMQPCR系統(tǒng)(Stratagene)中進(jìn)行，循環(huán)參數(shù)是，95°C7分鐘，95。C15秒和60。C30秒(每個(gè)循環(huán)溫度降低1°C)的10個(gè)循環(huán)，最后95。C15秒和50'C120秒的40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)含有40nM的3HIV和400nM的5HIV，200nM的每種partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P和TgB5/2-P)、200nM的每種底物(SubBi-6-FB和SubBi-2-JB)、7mMMgCl2、200|tiM每種dNTP,10單位Rnasin(Promega)、1xlmmobuffer(Bioline)和1單位的Immolase(Bioline)。如以下表12中表明的，雙份的反應(yīng)含有或缺少質(zhì)?；蚧蚪MDNA模板。表12:反應(yīng)中存在的目標(biāo)DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>2.5.結(jié)果對(duì)未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的目標(biāo)序列的同時(shí)擴(kuò)增以及使用目標(biāo)特異性MNAzvmes經(jīng)由兩種不同報(bào)告物底物裂解進(jìn)行的^^測(cè)通過(guò)監(jiān)視由于SubBi-6-FB被MNAzymel(包含partzymesWTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上熒光的提高，實(shí)時(shí)地檢測(cè)和定量未標(biāo)簽化的HXB2DWT序列。MNAzyme1僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由HXB2DWT質(zhì)粒或原病毒HXB2DWT目標(biāo)序列的擴(kuò)增(以下表13和14)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在不存在HXB2DWT質(zhì)?；蛟《綝NA的情況下，在FAM通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。進(jìn)一步的，在存在單獨(dú)的來(lái)自標(biāo)簽化的原病毒DNA的擴(kuò)增子的情況下，在FAM通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。通過(guò)監(jiān)視由于SubBi-2-JB被畫Azyme2(包含partzymesTgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上焚光的提高，實(shí)時(shí)地檢測(cè)和定量標(biāo)簽化的HXB2D序列。MNAzyme2僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)?；驑?biāo)簽化的原病毒HXB2D目標(biāo)序列的擴(kuò)增(以下表13和14)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在不存在標(biāo)簽化的質(zhì)?；蛟《綡XB2D模板DNA的情況下，在JOE通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。進(jìn)一步的，在存在單獨(dú)的來(lái)自未標(biāo)簽化的HXB2DWT原病毒DNA的擴(kuò)增子的情況下，在JOE通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。通過(guò)相對(duì)于達(dá)到閾值熒光時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct)來(lái)對(duì)質(zhì)粒濃度的log值進(jìn)行繪圖，對(duì)未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)粒目標(biāo)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。以下在表13中顯示的每種已知數(shù)量(標(biāo)準(zhǔn))的Ct值是兩份反應(yīng)的平均值。對(duì)未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的目標(biāo)序列顯示了標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)和斜率以及反應(yīng)效率。表13:對(duì)含有未標(biāo)簽化的野生型和標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)粒的反應(yīng)的<table>complextableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>根據(jù)從未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)粒產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，來(lái)估計(jì)MT-4基因組DNA混合物內(nèi)的未標(biāo)簽化的WT和標(biāo)簽化的HXB2D原病毒的拷貝數(shù)(表14)。每種未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D原病毒序列的拷貝數(shù)被表示為總拷貝數(shù)(未標(biāo)簽化的加上標(biāo)簽化的原病毒序列)的百分比，將估計(jì)值與原始spikedMT-4混合物中的百分比相比較。具有含100%未標(biāo)簽化的原病毒序列或100%標(biāo)簽化的原病毒序列的基因組MT-4的樣品能被很容易地相互區(qū)分(表14)。在僅存在標(biāo)簽化的原病毒序列的情況下，隨著時(shí)間過(guò)去MNAzyme1沒有產(chǎn)生熒光方面的背景提高。類似地，在僅存在未標(biāo)簽化的原病毒序列的情況下，隨著時(shí)間過(guò)去MNAzyme2沒有產(chǎn)生焚光方面的背景提高。利用MNAzyme分析，未標(biāo)簽化序列的未標(biāo)簽化序列比標(biāo)簽化序列比例為80%、50%和20。/。的混合物分別被計(jì)算為含有77%、47%和21%的未標(biāo)簽化的序列。表14:以各種百分比存在的未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的原病毒DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)的反應(yīng)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>這個(gè)實(shí)施例中的MNAzymePCR反應(yīng)容許同時(shí)檢測(cè)和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，以用于在二聯(lián)反應(yīng)中定量未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的核酸HXB2D序列。該分析容許辨別未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的序列，反之亦然。進(jìn)一步的，MNAzyme分析能夠測(cè)定樣品中存在的未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的原病毒HXB2DDNA的絕對(duì)和相對(duì)數(shù)量。因而，MNAzymePCR提供了在HIV病毒適應(yīng)度分析中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1序列的方法。實(shí)施例3:MNAzvmes用于經(jīng)由三聯(lián)實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量HIV和對(duì)照核酸序列的用途開發(fā)利用三種MNAzymes來(lái)便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的三聯(lián)PCR分析，用于對(duì)(i)未標(biāo)簽化的HIVHXB2DWT序列，(ii)被修飾以含有四個(gè)沉默突變(標(biāo)簽)的標(biāo)簽化的HIVHXB2D序列，和(i")對(duì)照人類RPLPO基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)和定量。設(shè)計(jì)標(biāo)簽堿基，從而它們不影響復(fù)制能力但是容許修飾的標(biāo)簽化HXB2D序列和未標(biāo)簽化的HXB2DWT序列之間的辨別。標(biāo)簽的不存在或存在分別提供了"野生型"WT序列或通過(guò)對(duì)感興趣的HIV目標(biāo)病毒擴(kuò)增衍生的那些序列的存在的代替性標(biāo)記物，其位于未標(biāo)簽化或標(biāo)簽化的區(qū)域的上游。3丄用于三聯(lián)PCR分析的Partzvme寡核苷酸多個(gè)目標(biāo)可以在包含多種獨(dú)特的MNAzymes的一個(gè)多路4匕反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)。每種MNAzyme具有特異于一個(gè)目標(biāo)的感受器臂，和特異于一系列一般報(bào)告物底物的獨(dú)特成員的底物臂，所述報(bào)告物底物每一種用不同的熒光基團(tuán)來(lái)標(biāo)記。在以下的實(shí)施例中，設(shè)計(jì)MNAzymes以檢測(cè)三種不同的目標(biāo)擴(kuò)增子，即，從未標(biāo)簽化的HXB2WT擴(kuò)增的那些，從標(biāo)簽化的HXB2D序列擴(kuò)增的那些以及從RPLPO基因擴(kuò)增的那些。對(duì)于每個(gè)目標(biāo)的partzymesAandB的序列在以下從5'到3'列出。在以下序列中，下劃線的堿基形成了組裝的MNAzyme的催化核心的部分，粗體的堿基與目標(biāo)雜交，斜體的堿基與底物雜交。在序列末端的P代表3'磷酸基團(tuán)。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>3.2.報(bào)告物底物在這個(gè)實(shí)施例中，使用了三種不同的報(bào)告物底物，每一種用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。底物的序列以下從5'向3'書寫。在當(dāng)前的實(shí)施例中，第一底物SubBi-6在5'末端用6-FAM部分、以及在3'末端用BHQ部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-6-FB。底物SubBi-6-FB對(duì)于跟蹤未標(biāo)簽化的野生型HXB2DWT擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用492nm的激發(fā)在516nm處監(jiān)測(cè)SubBi-6-FB的裂解。第二底物SubBi-2在5'末端用6-JOE部分、以及在3'末端用BHQ1部分來(lái)末端標(biāo)記，其被稱為SubBi-2-JB。底物SubBi-2-JB對(duì)于跟蹤標(biāo)簽化的HXB2D擴(kuò)增子的積累是有用的，可以用535nm的激發(fā)在555nm處監(jiān)測(cè)SubBi-2-JB的裂解第三底物SubBi-3在5'末端用Quasar670部分、在3'末端用BHQ2部分標(biāo)記，其被稱為SubBi-3-Q6B2。底物SubBi-3-Q6B2被用于監(jiān)視RPLPO擴(kuò)增子的積累，用635nm的激發(fā)在665nm處監(jiān)測(cè)SubBi-3-Q6B2的裂解。三種底物的序列在以下列出。小寫字母的堿基代表RNA，大寫字母的堿基代表DNA。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>3.3.用于目標(biāo)序列的擴(kuò)增的PCR引物行擴(kuò)增。引物5R05和3R05被用于擴(kuò)增人類基因組RPLPO基因核苷酸PCR引物的序列在以下列出。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>3.4.反應(yīng)成分目標(biāo)序列的擴(kuò)增和定量目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)擴(kuò)增和定量在25pL的總反應(yīng)體積中進(jìn)行。所有的反應(yīng)在Mx3005PTMQPCR系統(tǒng)(Stmtagene)中進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)是，95°C7分鐘，95°C15秒和60°C30秒(每個(gè)循環(huán)溫度降低1。C)的10個(gè)循環(huán)，最后95°C15秒和50°C120秒的40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)含有400nM的5HIV、40nM的3HIV、40nM的5R05、200nM的5R05、200nM的每種partzyme(WTA4/6-P、WTB5/6-P、TgA4/2-P、TgB5/2-P、R05A4/3-P和R05B5/3-P)、200nM的每種底物(SubBi-6-FB、SubBi-2-JB和SubBi-3-Q6B2)、7mMMgCI2、200mM每種dNTP,10單位Rnasin(Promega)、1ximmobuffer(Bioline)和1單位的Immolase(Bioline)。如下表18所示的，雙份的反應(yīng)含有或缺少質(zhì)?；蚧蚪MDNA模板。表18:反應(yīng)中存在的目標(biāo)DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>3.5.結(jié)果同時(shí)擴(kuò)增未標(biāo)簽化的野生型和標(biāo)簽化的目標(biāo)HXB2D序列以及對(duì)照RPLPO基因序列以及使用目標(biāo)特異性MNAzvmes經(jīng)由三種不同報(bào)告物底物裂解進(jìn)行檢測(cè)通過(guò)監(jiān)視由于SubBi-6-FB被MNAzymel(包含partzymesWTA4/6-P和WTB5/6-P)裂解在FAM上熒光的提高，實(shí)時(shí)地檢測(cè)和定量未標(biāo)簽化的HXB2D-WT序列。MNAzyme1僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由未標(biāo)簽化的HXB2DWT質(zhì)粒或未標(biāo)簽化的原病毒HXB2DW丁目標(biāo)序列的擴(kuò)增(以下表19和20)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在不存在未標(biāo)簽化的HXB2DWT質(zhì)粒或原病毒DNA的情況下，在FAM通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。進(jìn)一步地，在存在單獨(dú)的來(lái)自標(biāo)簽化的原病毒DNA的擴(kuò)增子的情況下，在FAM通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提南。通過(guò)監(jiān)視由于SubBi-2-JB被MNAzyme2(包含partzymesTgA4/2-P和TgB5/2-P)裂解在JOE上熒光的提高，實(shí)時(shí)地檢測(cè)和定量標(biāo)簽化的HXB2D序列。MNAzyme2僅在存在合適的組裝輔助物的情況下形成，即由標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)粒或標(biāo)簽化的原病毒HXB2D目標(biāo)序列的擴(kuò)增(以下表19和20)產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在不存在標(biāo)簽化的質(zhì)粒或原病毒HXB2D模板DNA的情況下，在JOE通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。進(jìn)一步地，在存在單獨(dú)的來(lái)自未標(biāo)簽化的HXB2DWT原病毒DNA的擴(kuò)增子的情況下，在JOE通道上隨著時(shí)間沒有熒光信號(hào)的提高。通過(guò)監(jiān)^L由于SubBi-3-Q6B2#皮MNAzyme3(包含partzymesR05A4/3-P和R05B5/3-P)裂解在Quasar通道上熒光的提高，實(shí)時(shí)地檢測(cè)和定量RPLPO基因。MNAzyme3僅在存在基因組DNA的情況下形成。在存在提取自K562或MT-4細(xì)胞的基因組DNA的情況下觀察到焚光的增加。在缺少基因組DNA的情況下隨著時(shí)間的過(guò)去沒有萸光信號(hào)的提高。通過(guò)相對(duì)于達(dá)到閾值焚光時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct)來(lái)標(biāo)繪質(zhì)粒濃度的log值，對(duì)未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D質(zhì)粒目標(biāo)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。以下在表19中顯示的每種已知數(shù)量的質(zhì)粒(標(biāo)準(zhǔn))的Ct值是兩份反應(yīng)的平均值。顯示了RPLPO的Ct值，對(duì)所有的標(biāo)準(zhǔn)獲得的相似的值表明在所有的標(biāo)準(zhǔn)中存在相似數(shù)量的基因組DNA。對(duì)未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的目標(biāo)序列顯示了標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)和斜率，以及反應(yīng)效力。表19:未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D目標(biāo)以及對(duì)照RPLPO序列的實(shí)時(shí)分析的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在MT-4基因組DNA混合物內(nèi)的未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D原病毒的拷貝數(shù)(表20)。每種未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的HXB2D原病毒序列的拷貝數(shù)被表示為總拷貝數(shù)(未標(biāo)簽化的加上標(biāo)簽化的原病毒序列)的百分比，估計(jì)值與原始spikedMT-4混合物中的百分比相比較。具有含100%未標(biāo)簽化的原病毒序列或100%標(biāo)簽化的原病毒序列的基因組MT-4的樣品很容易地相互區(qū)分(表20)。在僅存在標(biāo)簽化的原病毒序列的情況下，隨著時(shí)間過(guò)去MNAzyme1沒有產(chǎn)生熒光方面的背景提高。類似地，在僅存在未標(biāo)簽化的原病毒序列的情況下，隨著時(shí)間過(guò)去MNAzyme2沒有產(chǎn)生焚光方面的背景提高(表20)。80%、50%MNAzyme分析被分別地計(jì)算含有74%、47%和28%的未標(biāo)簽化的序列。表20:以各種百分比存在的未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的原病毒DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)的反應(yīng)結(jié)果(三聯(lián)MNAzyme形式)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>這個(gè)實(shí)施例中的MNAzymePCR反應(yīng)容許同時(shí)^r測(cè)和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于在三聯(lián)反應(yīng)中定量未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的核酸HXB2D序列。該分析容許辨別未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的序列，反之亦然。進(jìn)一步地，MNAzyme分析能夠測(cè)定樣品中存在的未標(biāo)簽化的和標(biāo)簽化的原病毒HXB2DDNA的絕對(duì)和相對(duì)數(shù)量。RPLPO基因序列可以提供標(biāo)準(zhǔn)或測(cè)試樣品中基因組DNA數(shù)量的內(nèi)部對(duì)照。因而，三聯(lián)MNAzymePCR提供了在HIV病毒適應(yīng)度分析中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HIV-1序列的方法。權(quán)利要求1.一種用于測(cè)定兩種HIV病毒在環(huán)境中的復(fù)制能力的離體或體外方法，所述方法包括下述步驟e)產(chǎn)生標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，其包含標(biāo)簽化的HIVDNA載體和來(lái)自第一目標(biāo)HIV病毒的第一擴(kuò)增子；其中所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體通過(guò)在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生；其中所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于或重疊于來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的所述第一擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；其中所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變被導(dǎo)入下述基因中，所述基因不被來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的所述第一擴(kuò)增子包括；以及其中所述第一擴(kuò)增子包含來(lái)自所述第一目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；f)產(chǎn)生未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，其包含未標(biāo)簽化的HIVDNA載體和來(lái)自第二目標(biāo)HIV病毒的第二擴(kuò)增子；其中所述未標(biāo)簽化的HIVDNA載體不包含在步驟a)的標(biāo)簽化的HIVDNA載體中導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)沉默突變；其中所述未標(biāo)簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于或重疊于來(lái)自所述第二目標(biāo)HIV病毒的所述第二擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；以及其中所述第二擴(kuò)增子包含來(lái)自第二目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；g)在給定環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)物中混合步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及h)通過(guò)檢測(cè)所述標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變，和通過(guò)檢測(cè)所述未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中一個(gè)或多個(gè)沉默突變的缺乏，通過(guò)定量擴(kuò)增測(cè)定總病毒群體內(nèi)標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例。2.—種用于測(cè)定三或更多種HIV病毒在環(huán)境中的復(fù)制能力的離體或體外方法，所述方法包括下述步驟a)產(chǎn)生權(quán)利要求1中步驟a)的標(biāo)簽化的重組傳染性病毒；b)產(chǎn)生權(quán)利要求l中步驟b)的未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒；c)產(chǎn)生其它的一種或多種標(biāo)簽化的重組傳染性病毒，每種包含標(biāo)簽化的HIVDNA栽體和來(lái)自其它一種或多種目標(biāo)HIV病毒的笫三種或后續(xù)的擴(kuò)增子；其中通過(guò)在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV基因之一中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生所述標(biāo)簽化的HIVDNA栽體，所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變不同于這個(gè)權(quán)利要求的步驟a)的所述第一標(biāo)簽化的HIVDNA載體的一個(gè)或多個(gè)沉默突變；其中每種所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體在其DNA序列中具有刪除，所述刪除最多對(duì)應(yīng)于(correspondsatmost)或重疊于來(lái)自所述笫三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的所述第三或后續(xù)的擴(kuò)增子的側(cè)翼區(qū)域；其中所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變被導(dǎo)入下述基因中，所述基因不被來(lái)自所迷第三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的所述第三或后續(xù)的擴(kuò)增子包括；以及其中所迷第三或后續(xù)的擴(kuò)增子包含來(lái)自所述第三或后續(xù)的目標(biāo)HIV病毒的gag、pol或env基因、其部分和其組合；d)在給定的環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)物中混合步驟c)的重組傳染性病毒和步驟a)和b)的重組傳染性病毒；以及e)通過(guò)檢測(cè)每種所述標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA栽體部分中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變，和通過(guò)檢測(cè)所述未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的所述HIVDNA載體部分中一個(gè)或多個(gè)沉默突變的缺乏，通過(guò)定量擴(kuò)增測(cè)定總病毒群體內(nèi)每種標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例和未標(biāo)簽化的重組傳染性病毒的比例3.根據(jù)權(quán)利要求1-2的任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈交換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、自持的序列復(fù)制(3SR)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(TAS)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的方法，其中所述定量擴(kuò)增利用Lux發(fā)熒光引物、可被DNAzymes或MNAzymes裂解的探針、T叫Man⑧探針、分子信標(biāo)、蝎子引物或任何其它FRET探針來(lái)監(jiān)測(cè)。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4的任一項(xiàng)的方法，其中所述定量擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、采用鄰近MNAzymes的引物和被MNAzymes裂解的探針來(lái)進(jìn)行。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的方法，其中每種所述標(biāo)簽化的HIV千。，"、，？'、、7.根椐權(quán)利要求6的方法，其中每種所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體和所述未標(biāo)簽化的HIVDNA栽體是原病毒HIVDNA或質(zhì)粒DNA。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述質(zhì)粒DNA包含HXB2D野生型毒抹的基因組。9.根據(jù)權(quán)利要求l-8的任一項(xiàng)的方法，其中所述來(lái)自目標(biāo)HIV病毒的擴(kuò)增子包含選自gag-PR-RT-int、gag-PR-RT、gag-PR、gag、PR-RT-int、RT-int、int、PR-RT、PR、RT、evn和其部分的序列之一。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述環(huán)境包含一種或多種藥物、一種或多種結(jié)合蛋白或其混合物。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)在HIVDNA載體的pol基因的整合酶編碼區(qū)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生所述標(biāo)簽化的HIVDNA栽體，其中所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變的導(dǎo)入使用引物SEQIDNO:1-2來(lái)進(jìn)行。12.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)在HIVDNA栽體的env基因中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)沉默突變來(lái)產(chǎn)生所述標(biāo)簽化的HIVDNA載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變的導(dǎo)入使用引物SEQIDNO:3-4來(lái)進(jìn)行。13.—種標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒栽體，其中所述質(zhì)粒栽體的主干是野生型HXB2D，所述栽體包含-標(biāo)簽化的序列；和-gag、pol或env基因序列、其部分和其組合的刪除；其特征在于，所述標(biāo)簽化的序列在選自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的基因之一中包含一個(gè)或多個(gè)沉默突變；以及條件是所述一個(gè)或多個(gè)沉默突變不位于所述刪除的基因序列中。14.根據(jù)權(quán)利要求13的標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體，其中所述標(biāo)簽化的序列包含在env基因中或在pol基因的整合酶編碼區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)沉默突變。15.根據(jù)權(quán)利要求14的標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體，其中所述質(zhì)粒栽體是SEQIDNO:28(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(env))或29(pGEM-HIVdelGPRT—tagged(int))。16.選自SEQIDNO:1-16、19-22和24-25的寡核苷酸。17.標(biāo)簽化的HIV包膜基因序列，其中所述標(biāo)簽化的HIV包膜基因序列是SEQIDNO:26。18.標(biāo)簽化的HIV整合酶編碼基因序列，其中所述標(biāo)簽化的HIV整合酶編碼基因序列是SEQIDNO:27。19.一種用于離體或體外測(cè)定兩種或更多種HIV病毒在環(huán)境中的復(fù)制能力的試劑盒，所述試劑盒包含-選自SEQIDNO:1-12、19-20和24-25的一種或多種寡核苷酸；和/或-根據(jù)權(quán)利要求13-15的任一項(xiàng)的一種或多種標(biāo)簽化的HIV質(zhì)粒載體，和任選的未標(biāo)簽化的HIVHXB2D質(zhì)粒栽體。20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其進(jìn)一步包括選自SEQIDNO:13-16和21-22的一種或多種寡核苷酸。全文摘要本發(fā)明涉及在給定環(huán)境中評(píng)價(jià)HIV病毒復(fù)制能力的方法和裝置。特別地，本發(fā)明提供了生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)檢驗(yàn)，其可以利用重組標(biāo)簽化的HIV-1病毒系統(tǒng)來(lái)測(cè)定相關(guān)的病毒適應(yīng)度。所述方法依靠質(zhì)粒載體、擴(kuò)增子、引物和探針，以及由此的能復(fù)制的病毒的生成。所述方法和材料可以用于多個(gè)領(lǐng)域，包括診斷、藥物篩選、藥物遺傳學(xué)和藥物開發(fā)。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101365808SQ200680051987公開日2009年2月11日申請(qǐng)日期2006年12月7日優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日發(fā)明者A·V·托德,B·A·J·梅斯,E·莫卡尼,G·克勞斯,I·P·M·德貝爾,L·T·里姆斯基,M·-P·T·M·M·G·德貝圖恩申請(qǐng)人:泰博特克藥品有限公司;莊臣及莊臣研究股份有限公司