專利名稱：乙肝基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒、乙肝基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因人參愈傷組織細(xì)胞系，獲得乙型肝炎病毒表面抗原，將其用于乙肝疫苗的制備。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是目前我國流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的傳染病之一。目前全球乙肝攜帶者大約有3.5億人，我國乙肝攜帶者就有1.2億以上，且有3000萬慢性乙型肝炎的現(xiàn)癥患者在社會(huì)上流動(dòng)，每年有200多萬例的急性肝炎發(fā)生，每年因肝病死亡的人數(shù)約35萬，其中一半是原發(fā)性肝癌。嚴(yán)重地影響了我國的社會(huì)穩(wěn)定及國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。
防止乙肝病毒感染仍將取決于疫苗的有效作用。乙肝疫苗在我國的普種是非常必要的，乙肝疫苗的需求量極大。但是，我國現(xiàn)有的生產(chǎn)能力因表達(dá)系統(tǒng)(CHO苗及酵母苗)限制表達(dá)量低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了社會(huì)需求(每年有3000萬支的市場份額空缺)，亟需尋求一種全新的表達(dá)系統(tǒng)。
隨著植物組織和細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，尤其是植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，通過規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)植物組織細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)，顯示出十分廣闊的發(fā)展前景。
通過人參愈傷組織細(xì)胞的工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)，規(guī)?；a(chǎn)新型乙肝基因工程疫苗，這在表達(dá)量大幅提高、簡化產(chǎn)品的后期提純制備工藝、開發(fā)新的優(yōu)秀劑型、產(chǎn)品的安全性、降低生產(chǎn)成本等諸多方面體現(xiàn)出極大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)基因植物組織細(xì)胞作為生物反應(yīng)器具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明首先在該領(lǐng)域獲得了突破，為利用組織培養(yǎng)人參愈傷組織細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)醫(yī)用重組蛋白提供我國獨(dú)有的技術(shù)平臺(tái)。這在產(chǎn)品的安全性、簡化產(chǎn)品的后期提純制備工藝、開發(fā)新的優(yōu)秀劑型、降低生產(chǎn)成本等諸多方面體現(xiàn)出極大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種包含乙型肝炎病毒表面抗原基因的基因構(gòu)建體，其中在所述乙肝病毒表面抗原基因的5’端組裝了能使其在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，在所述乙肝病毒表面抗原基因的3’端組裝了增強(qiáng)表達(dá)的終止子。優(yōu)選所述啟動(dòng)子為CaMV 35S啟動(dòng)子。優(yōu)選所述終止子為nos終止子。本發(fā)明的基因構(gòu)建體可以用于在植物細(xì)胞中表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原。
本發(fā)明還涉及含有上述基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。特別是，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因人參細(xì)胞系，優(yōu)選所述人參細(xì)胞來自人參愈傷組織。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系還包含一種篩選標(biāo)記，優(yōu)選該標(biāo)記是NPT II，這種標(biāo)記可用于原核細(xì)胞卡那霉素篩選和真核細(xì)胞卡那霉素、新霉素、G418篩選。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系的方法，包括1)將本發(fā)明的含有乙肝病毒表面抗原基因的構(gòu)建體或載體引入植物細(xì)胞；和2)使所述植物細(xì)胞表達(dá)乙肝病毒表面抗原蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，乙肝病毒表面抗原基因利用包含乙肝病毒表面抗原基因的載體引入植物細(xì)胞。在這種載體中，乙肝病毒表面抗原基因的5’端組裝了能使該基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選為CaMV 35S啟動(dòng)子；而乙肝病毒表面抗原基因的3’端組裝了增強(qiáng)表達(dá)的終止子，優(yōu)選為nos終止子。所述載體特別優(yōu)選pBIBSa或pBIBSb。
本發(fā)明的構(gòu)建體或載體可通過諸如農(nóng)桿菌感染法、基因槍法、花粉導(dǎo)入法、病毒介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)法、電擊誘導(dǎo)法、顯微注射法、激光轉(zhuǎn)化法、超聲波轉(zhuǎn)化法、或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等方法引入植物細(xì)胞。優(yōu)選地，在制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系的方法中，通過用攜帶乙肝病毒表面抗原基因的農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，從而引入乙肝病毒表面抗原基因。更優(yōu)選所述乙肝病毒表面抗原基因通過上述構(gòu)建體或載體引入農(nóng)桿菌，再用農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞來引入到植物細(xì)胞中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌感染通過將植物細(xì)胞的懸浮細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)來進(jìn)行。進(jìn)行農(nóng)桿菌感染時(shí)，可通過酚類化合物來誘導(dǎo)激活農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因，以便增強(qiáng)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。所述酚類化合物選自兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羥基乙酰丁香酮，特別優(yōu)選乙酰丁香酮(AS)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系可用于制備乙肝病毒表面抗原蛋白，進(jìn)而用于制備乙肝疫苗。
本發(fā)明還涉及一種表達(dá)乙肝病毒表面抗原蛋白的植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞包含一種構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含乙肝病毒表面抗原基因、能使該基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動(dòng)子、以及能增強(qiáng)該基因表達(dá)的終止子。優(yōu)選所述啟動(dòng)子為CaMV 35S啟動(dòng)子；還優(yōu)選所述終止子為nos終止子。在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中，還可包含一種篩選標(biāo)記，優(yōu)選為NPT II，這種標(biāo)記可用于原核細(xì)胞卡那霉素篩選和真核細(xì)胞卡那霉素、新霉素、G418篩選。這種標(biāo)記也可以包含在本發(fā)明的構(gòu)建體中。優(yōu)選本發(fā)明的植物表達(dá)系統(tǒng)是人參的表達(dá)系統(tǒng)。特別優(yōu)選是來源于人參愈傷組織的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明還涉及制備上述表達(dá)系統(tǒng)的方法，包括1)將本發(fā)明的包含乙肝病毒表面抗原基因、能使該基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動(dòng)子、以及能增強(qiáng)該基因表達(dá)的終止子的構(gòu)建體引入所述表達(dá)系統(tǒng)；和2)使所述表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)乙肝病毒表面抗原蛋白。
其中所述啟動(dòng)子優(yōu)選為CaMV 35S啟動(dòng)子，所述終止子優(yōu)選為nos終止子。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含在載體中，優(yōu)選所述載體是pBIBSa或pBIBSb。
可通過農(nóng)桿菌感染法、基因槍法、花粉導(dǎo)入法、病毒介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)法、電擊誘導(dǎo)法、顯微注射法、激光轉(zhuǎn)化法、超聲波轉(zhuǎn)化法、或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將上述構(gòu)建體或載體引入植物細(xì)胞，優(yōu)選農(nóng)桿菌感染法。
或者，可將本發(fā)明的上述構(gòu)建體直接引入農(nóng)桿菌中，并借助農(nóng)桿菌引入所述表達(dá)系統(tǒng)。
無論是借助載體，或者是通過直接引入農(nóng)桿菌的方式將本發(fā)明的構(gòu)建體引入植物細(xì)胞，都可通過將懸浮的植物細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方式來實(shí)現(xiàn)。在此過程中，可通過酚類化合物來誘導(dǎo)激活農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因，以便增強(qiáng)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。所述酚類化合物選自兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羥基乙酰丁香酮，優(yōu)選為乙酰丁香酮(AS)。
本發(fā)明的上述表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選源自人參，更優(yōu)選源自人參愈傷組織。這種表達(dá)系統(tǒng)可用于制備乙肝病毒表面抗原蛋白，進(jìn)而用于制備乙肝病毒疫苗。
因此，本發(fā)明涉及植物細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)化效率的方法，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選建立以及開發(fā)應(yīng)用。
成功的基因轉(zhuǎn)化依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。具體條件如下1.用于植物基因轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；2.植物受體系統(tǒng)應(yīng)有較高的遺傳穩(wěn)定性，接受外源DNA后應(yīng)不影響其分裂和分化，并且能夠穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性；3.要建立一個(gè)高產(chǎn)的組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)并能應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)化，還需要穩(wěn)定的受體細(xì)胞來源。植物基因轉(zhuǎn)化的頻率很低，需要多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，所以受體細(xì)胞應(yīng)容易得到并且可以大量提供；4.一般通過抗生素抗性篩選來淘汰非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株，所以必須選擇對(duì)抗生素敏感的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞作為受體細(xì)胞；5.可利用農(nóng)桿菌為載體介導(dǎo)植物的基因轉(zhuǎn)化，但這種方法具有宿主范圍的局限性。不同的植物甚至同一植物的不同組織細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性也有差異，所以在選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)前必須測(cè)試受體系統(tǒng)對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性。
此外建立一種植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)還應(yīng)注意到是否具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值或潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。為此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建了乙肝病毒表面抗原植物細(xì)胞表達(dá)載體以及用該載體轉(zhuǎn)化的乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因人參愈傷組織細(xì)胞系。
本發(fā)明用乙肝病毒表面抗原基因替換植物細(xì)胞表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒中的GUS基因，構(gòu)建成pBIBS載體質(zhì)粒。將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，利用農(nóng)桿菌感染人參愈傷組織細(xì)胞，進(jìn)而將pBIBS載體質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞，利用NPTII基因表達(dá)產(chǎn)物在G418篩選培養(yǎng)基上獲得抗性細(xì)胞株。提取抗性細(xì)胞株內(nèi)染色體鑒定乙肝病毒表面抗原基因整合情況。提取抗性細(xì)胞株內(nèi)蛋白質(zhì)，鑒定乙肝病毒表面抗原表達(dá)情況。
pBI121質(zhì)粒中GUS基因5’端和CaMV35S啟動(dòng)子之間有Xba I、BamH I和Sma I三個(gè)酶切位點(diǎn)可以利用，在GUS基因3’端和nos終止子之間有Sst I一個(gè)酶切位點(diǎn)可以利用。在乙肝病毒表面抗原基因序列中含有Xba I和BamH I酶切位點(diǎn)，所以在pBIBS構(gòu)建過程中只能選擇5’端Sma I位點(diǎn)和3’端Sst I位點(diǎn)。由于Sma I的堿基序列是CCCGGG，GC含量過高影響PCR擴(kuò)增的特異性。利用Sma I位點(diǎn)的粘末端特點(diǎn)，可以解決這一問題。本發(fā)明在5’端引物設(shè)計(jì)時(shí)用其它的酶切位點(diǎn)替代Sma I位點(diǎn)?？梢灾苯右肫交┒宋稽c(diǎn)與Sma I酶切消化后進(jìn)行連接；可以引入粘性末端位點(diǎn)，用綠豆核酸酶或T4DNA聚合酶作用造成平滑末端再與Sma I酶切消化后進(jìn)行連接；還可以引入粘性末端位點(diǎn)后，將其導(dǎo)入中間載體，利用中間載體上的平滑末端位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)。
pBIBS質(zhì)粒保留了pBI121質(zhì)粒上的NPT II(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)基因，該基因是植物基因轉(zhuǎn)化中最廣泛應(yīng)用的選擇標(biāo)記，它編碼的產(chǎn)物對(duì)卡那霉素、新霉素和G418等氨基糖苷類抗生素具有抗性。其中某些原核細(xì)胞和真核細(xì)胞對(duì)卡那霉素較敏感，新霉素和G418只對(duì)真核細(xì)胞起作用。pBIBS質(zhì)粒的NPT II基因編碼產(chǎn)物的特性使該載體可以在大腸桿菌、農(nóng)桿菌以及植物細(xì)胞的篩選中廣泛應(yīng)用。
大腸桿菌XL-I blue不具有卡那霉素抗性，在轉(zhuǎn)化pBIBS載體質(zhì)粒后，獲得了卡那霉素抗性，可以在載體構(gòu)建過程中篩選抗性克隆。農(nóng)桿菌LBA4404不具有卡那霉素抗性，在轉(zhuǎn)化pBIBS載體質(zhì)粒后，使其獲得了卡那霉素抗性，能夠在卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長，以篩選攜帶抗性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。人參愈傷組織細(xì)胞不具有卡那抗性和G418抗性，感染攜帶抗性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌后，能夠在卡那抗性或G418抗性培養(yǎng)基上生長，以篩選轉(zhuǎn)基因人參愈傷組織細(xì)胞。
一些植物中常見的酚類化合物可以誘導(dǎo)激活農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因，從而增強(qiáng)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。這類化合物包括兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、草香醛、乙酰丁香酮(AS)、或羥基乙酰丁香酮。其中誘導(dǎo)效果最佳的是乙酰丁香酮。本發(fā)明在農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)，以及與植物細(xì)胞共培養(yǎng)過程中加入乙酰丁香酮來提高農(nóng)桿菌感染效率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明植物基因轉(zhuǎn)化的受體是人參愈傷組織細(xì)胞系。該人參愈傷組織細(xì)胞系是已經(jīng)保持了28年穩(wěn)定生長的傳代細(xì)胞系，可以傳代擴(kuò)大培養(yǎng)提供足夠的細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。愈傷組織由已分化的細(xì)胞回復(fù)到脫分化的分生細(xì)胞水平，具有易于接受外源基因的能力，可以提高轉(zhuǎn)化效率。非轉(zhuǎn)化人參愈傷組織細(xì)胞對(duì)卡那霉素和G418均敏感，其中G418的抑制作用更明顯。所以可選用G418作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選標(biāo)記。
本發(fā)明的方法獲得了帶有乙肝病毒表面抗原基因的植物細(xì)胞表達(dá)載體pBIBSa和pBIBSb(圖)；并進(jìn)一步獲得了乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因人參愈傷組織細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1乙肝病毒表面抗原基因植物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建1.C28細(xì)胞染色體DNA的提取取80％以上貼壁的C28細(xì)胞(含有乙肝病毒表面抗原S基因)，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，25％胰酶消化，TBS緩沖液重懸細(xì)胞，離心收獲細(xì)胞。用TE(pH8.0)重懸細(xì)胞使?jié)舛葹?×107/ml，取1ml加入10ml抽提緩沖液(10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1mol/L EDTA(pH8.0)，20ug/ml胰RNA酶，0.5SDS)，37℃1小時(shí)。加蛋白酶K至終濃度為100ug/ml，50℃3小時(shí)。冷卻至室溫，加等體積平衡酚抽提，離心收集水相。加兩倍體積無水乙醇，混合后，離心棄上清，用75％乙醇洗滌DNA沉淀，離心棄上清，干燥收集DNA沉淀。500ul TE(pH8.0)溶解DNA，4℃保存。
2.乙肝病毒表面抗原基因的獲得設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P15’-ACTCGAGACATGGAGAACACAG-3’；P25’-ACGTCGAGCTCAAATGTATAC-3’，以C28細(xì)胞染色體DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。得到上游含有Xho I位點(diǎn)和ATG起始密碼子，下游含有Sst I和TGA終止密碼子的約700bp的擴(kuò)增片段。
3.克隆載體的構(gòu)建a.利用PCR擴(kuò)增片段兩端突出A堿基與pMD18-T載體兩端突出T堿基進(jìn)行連接反應(yīng)。得到S基因上游含有HindIII、Sph I、Pst I、Sal I、Xho I位點(diǎn)，下游含有Sst I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I位點(diǎn)的克隆質(zhì)粒pMDBS。
b.將質(zhì)粒pMDBS和pBluescript II SK+用Pst I和Sst I雙酶切，瓊脂糖凝膠回收S基因和pBluescript II SK+載體片段，連接得到S基因上游含有Kpn I、Apa I、Xho I、Sal I、HindIII、EcoRV、EcoR I、Pst I位點(diǎn)，下游含有Sst I位點(diǎn)的克隆質(zhì)粒pSKBS。
4.兩種方法構(gòu)建表達(dá)載體用Sma I和Sst I雙酶切pBI121質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收得到pBI121載體片段。
a.用Xho I單酶切pMDBS質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收后，用T4DNA聚合酶作用補(bǔ)平粘性末端，再用Sst I單酶切，瓊脂糖凝膠回收得到S基因片段。與pBI121載體片段連接得到含有乙肝基因的植物細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒pBIBSa。
b.用EcoRV和Sst I雙酶切pSKBS質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收得到S基因片段。與pBI121載體片段連接得到含有乙肝基因的植物細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒pBIBSb。
實(shí)施例2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1.農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備接種農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于5ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm培養(yǎng)過夜。取2ml過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)入50ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm培養(yǎng)至OD600為0.5左右，冰浴30分鐘，4℃5000rpm離心5分鐘，棄上清。加入20ml 50mmol/L的CaCl2重懸菌體，4℃5000rpm離心5分鐘，棄上清。加入2ml 50mmol/L的CaCl2重懸菌體，每管200ul分裝，-80℃保存。
2.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取20ng純化的質(zhì)粒pBIBS，加入200ul農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻，冰浴5分鐘，轉(zhuǎn)入液氮冷凍8分鐘，迅速置于37℃溫育5分鐘。加入800ul YEP液體培養(yǎng)基，28℃220rpm培養(yǎng)4～5小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有50mg/L卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基表面，均勻涂布于整個(gè)平板。28℃培養(yǎng)1～2天。
3.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的篩選鑒定篩選抗性菌落于5ml含有50mg/L卡那霉素YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm培養(yǎng)1天，離心，提取質(zhì)粒，酶切電泳檢測(cè)片段大小。
實(shí)施例3
植物細(xì)胞抗性敏感預(yù)實(shí)驗(yàn)在以下四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)人參愈傷組織細(xì)胞，每25ml培養(yǎng)基中加入.1.5g人參愈傷組織固體培養(yǎng)細(xì)胞。
1.氨芐青霉素抗性組在25ml 67V固體培養(yǎng)基中分別加入50mg/ml的氨芐青霉素60ul、120ul、180ul、240ul、360ul、500ul。
2.卡那霉素抗性組在25ml 67V固體培養(yǎng)基中分別加入50mg/ml的卡那霉素5ul、10ul、25ul、50ul、75ul、100ul、150ul。
3.G418抗性組在25ml 67V固體培養(yǎng)基中分別加入50mg/ml的G4185ul、10ul、25ul、50ul、75ul、100ul、150ul。
4.對(duì)照組25ml 67V固體培養(yǎng)基。
比較一個(gè)月內(nèi)的生長情況4組不同抗性濃度與1組之間沒有明顯差異，人參細(xì)胞從1.5g生長到6～7g，說明人參細(xì)胞可以在高濃度氨芐青霉素存在下正常生長，可以應(yīng)用氨芐青霉素在篩選過程中抑制農(nóng)桿菌生長，同時(shí)不影響人參愈傷組織細(xì)胞生長。2組和3組都表現(xiàn)出低濃度使人參細(xì)胞生長受到抑制，高濃度使人參細(xì)胞死亡；同樣濃度下人參細(xì)胞對(duì)G418比卡那霉素更敏感，所以G418更適合轉(zhuǎn)基因人參細(xì)胞篩選。培養(yǎng)4天時(shí)，G418150ul的細(xì)胞開始有部分死亡，10天時(shí)細(xì)胞幾乎全部死亡；培養(yǎng)12天時(shí)，G418 25ul的細(xì)胞開始有部分死亡，30天時(shí)細(xì)胞幾乎全部死亡。G41825ul(50mg/L)的濃度比較適合轉(zhuǎn)基因人參細(xì)胞篩選。
實(shí)施例4農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌的預(yù)培養(yǎng)取農(nóng)桿菌單菌落于3ml YEP液體抗性培養(yǎng)基中，28℃220rpm培養(yǎng)至OD600為0.9左右。取50ul菌液于3ml AB培養(yǎng)基中，28℃220rpm培養(yǎng)至OD600為0.9左右，4℃5000rpm離心10分鐘。菌液懸浮于50ml AB預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(AB-AS)中，28℃220rpm培養(yǎng)12～15小時(shí)，4℃5000rpm離心10分鐘。20ml 67V-AS培養(yǎng)基重懸。
2.農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞的共培養(yǎng)將人參愈傷組織細(xì)胞置于三角瓶中，倒入預(yù)培養(yǎng)的菌液，搖勻，靜置15～20分鐘，倒掉菌液，轉(zhuǎn)移到67V-AS共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，25℃閉光培養(yǎng)48～72小時(shí)。將共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至三角瓶中，用67V培養(yǎng)基洗3次，500mg/L氨芐青霉素洗1次，轉(zhuǎn)移至67V固體培養(yǎng)基，25℃閉光培養(yǎng)一周。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的篩選鑒定1.抗性篩選將共培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有300mg/L的氨芐青霉素和50mg/L的G418的67V固體培養(yǎng)基上，四周后長出抗性愈傷組織，每兩周傳代一次。三個(gè)月后換成不含氨芐青霉素的35ml/L G418的67V固體培養(yǎng)基繼續(xù)篩選。
2.篩選細(xì)胞的鑒定1)外源基因整合的PCR檢測(cè)分別取50-200mg抗性篩選細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)液氮冷凍后，研磨成粉。加入900ul提取緩沖液(100mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，500mmol/LnaCl，10mmol/L α-巰基乙醇)，混勻。加入100ul10％SDS，混勻，65℃溫育15分鐘。加入160ul 5mol/L乙酸鉀，混勻，冰浴30分鐘，4℃12000r/min離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上清，加入等體積氯仿/異戊醇，4℃8000r/min離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，放置30分鐘。4℃8000r/min離心10分鐘，棄上清，80％乙醇洗滌沉淀，干燥。加入含有RNase酶的200ul TE緩沖液溶解沉淀，37℃溫育1小時(shí)。加入等體積的氯仿/異戊醇，4℃8000r/min離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，放置30分鐘。4℃8000r/min離心10分鐘，棄上清，80％乙醇洗滌沉淀，干燥。加入100ul TE溶解DNA。得到抗性篩選細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞的染色體DNA。分別取1ul作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。抗性篩選細(xì)胞的PCR產(chǎn)物得到約700bp的擴(kuò)增片段，陰性對(duì)照細(xì)胞的PCR擴(kuò)增反應(yīng)沒有特異擴(kuò)增片段。
2)外源基因表達(dá)的ELISA檢測(cè)分別取抗性篩選細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞0.5g，置液氮中冷凍后，研磨成粉。加入0.5ml提取緩沖液(50mmol/L Tris.Cl，0.029％NaN3(pH9.5))，混勻，4℃抽提過夜。14000r/min離心5分鐘。分別取上清液50ul，用乙肝病毒表面抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原表達(dá)?？剐院Y選細(xì)胞檢測(cè)到抗原表達(dá)，陰性對(duì)照細(xì)胞沒有檢測(cè)到抗原表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種包含乙型肝炎病毒表面抗原基因的構(gòu)建體，其中在所述乙肝病毒表面抗原基因的5’端組裝了能使其在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，在所述乙肝病毒表面抗原基因的3’端組裝了增強(qiáng)表達(dá)的終止子。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子為CaMY 35S啟動(dòng)子和/或所述終止子為nos終止子。
3.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中還包含一種篩選標(biāo)記，優(yōu)選該標(biāo)記是NPT II。
4.含有權(quán)利要求1-3之一的構(gòu)建體的載體，所述載體優(yōu)選為pBIBSa或pBIBSb。
5.含有權(quán)利要求1-3之一的構(gòu)建體或權(quán)利要求4的載體的農(nóng)桿菌，優(yōu)選該農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌LBA4404。
6.含有權(quán)利要求1-3之一的構(gòu)建體或權(quán)利要求4的載體或權(quán)利要求5的農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系，優(yōu)選其為人參細(xì)胞系，更優(yōu)選人參愈傷組織的細(xì)胞系。
7.制備權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系的方法，包括1)將權(quán)利要求1的構(gòu)建體或權(quán)利要求4的載體引入植物細(xì)胞；和2)使所述植物細(xì)胞表達(dá)乙肝病毒表面抗原蛋白。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述構(gòu)建體或載體通過農(nóng)桿菌感染法、基因槍法、花粉導(dǎo)入法、病毒介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)法、電擊誘導(dǎo)法、顯微注射法、激光轉(zhuǎn)化法、超聲波轉(zhuǎn)化法、或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法引入植物細(xì)胞，優(yōu)選農(nóng)桿菌感染法。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述構(gòu)建體或載體通過使包含該構(gòu)建體或載體的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞的懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)來引入植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求8的方法，其中在進(jìn)行農(nóng)桿菌感染的過程中，通過選自兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、原兒茶酸、草香醛、乙酰丁香酮、或羥基乙酰丁香酮的酚類化合物來誘導(dǎo)激活農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因，以便增強(qiáng)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，優(yōu)選所述酚類化合物為乙酰丁香酮(AS)。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系以及植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及制備上述細(xì)胞系或表達(dá)系統(tǒng)的方法，以及上述細(xì)胞系或表達(dá)系統(tǒng)在制備乙肝病毒表面抗原蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明所公開的細(xì)胞系或表達(dá)系統(tǒng)可用于制備乙肝病毒的疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1532287SQ0312098
公開日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者盛軍, 劉丹, 劉曉宇, 郭橋, 于海鵬, 李鵑, 回悅君, 王志武, 張雪梅, 盛 軍 申請(qǐng)人:長春生物制品研究所